close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10117

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2007.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 10117
(13) C1
(19)
G 01N 33/534
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 125I-МЕЧЕННОГО БЕЛКА
(21) Номер заявки: a 20050701
(22) 2005.07.12
(43) 2007.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Макаренко Михаил Васильевич; Усанов Сергей Александрович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) SU 1588141 A1, 1991.
SU 1767434 A1, 1992.
US 4430318, 1984.
Макаренко М.В. и др. Весцi нацыянальнай акадэмii навук Беларусi: Сэрыя
хiмiчных навук. - 2001. - № 1. - С. 60-62.
BY 10117 C1 2007.12.30
(57)
1. Способ получения 125I-меченного белка, включающий окислительное радиоиодирование белка изотопом 125I в водном буферном растворе, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют натрий-фосфатный буфер рН 7,5, содержащий от 5 до
30 % спирта.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве спирта используют метанол,
изопропанол, изобутанол, бутанол или глицерин.
Фиг. 1
BY 10117 C1 2007.12.30
Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к усовершенствованному способу получения 125I-меченного белка, который может быть использован в качестве радиомаркера в биохимических исследованиях и в радиоиммунологическом анализе.
Известен способ получения 125I-меченных белков методом окислительного радиоиодирования с хлорамином Т (ХАТ) [1]. Радиоиодирование сводится к смешению растворов
белка, иодида натрия (Na125I) и хлорамина Т. Навески белка и хлорамина Т растворяют в
водных буферных растворах (рН 7,5). Реакцию иодирования останавливают добавлением
в реакционную смесь восстановителя метабисульфита натрия. Недостаток метода - нежелательные побочные реакции: хлорирования, окисления тиоэфирной и сульфгидрильной
групп аминокислот, разрушения пептидных связей, что делает неадекватными свойства
меченого и исходного лигандов [2, 3]. Для уменьшения побочных реакций данного метода
используют дополнительные протекторные вещества формулы R2S = O, где R - низший
алкил, фенил, бензил или толил [4]. Производные сульфоксидов в качестве "ловушек" защищают чувствительные остатки аминокислот в гормонах от перекисного окисления при
химическом иодировании с хлорамином Т. Протектор вносят в количестве от 0,1 до 11 мг
на микрограмм гормона, до внесения хлорамина Т. Недостаток - метод не позволяет увеличить связывание выше 51,5-52,6 %.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения меченых белков окислительным радиоиодированием в присутствии сульфоксидов [5] (прототип). Мечение хорионического гонадотропина проводят в водном буферном растворе с 1 мкКи Na125I в
присутствии 50 мкл диметилсульфоксида. Вносят 500 мкг хлорамина Т и перемешивают в
течение 1 минуты. Останавливают реакцию внесением 240 мкг метабисульфита натрия.
Эффективность включения метки составляет 40-48 %. Недостатки метода: применение
сульфоксидов в качестве протекторов требует использования больших количеств окислителя (150-500 мкг хлорамина Т) и соответственно метабисульфита натрия; метод не позволяет достичь высокой эффективности включения изотопа.
Задачей изобретения является усовершенствование способа получения 125I-меченного
белка, приводящее к увеличению включения изотопа в белок. Поставленная задача решается заявляемым способом окислительного радиоиодирования белка изотопом 125I в водном буферном растворе, который отличается тем, что в качестве буферного раствора
используют натрий-фосфатный буфер рН 7,5, содержащий от 5 до 30 % спирта. В качестве
спирта используют низкомолекулярные спирты различной природы: метанол, этанол, изопропанол, изобутанол, бутанол, глицерин. Спиртовой ингредиент вносится в реакционную
среду вместо сульфоксидов. Спирты, как и диметилсульфоксид, являются n-донорными
растворителями и, следовательно, обладают основными свойствами, они отлично сольватируют катионы. Установлено, что проведение радиоиодирования в спиртосодержащей
среде приводит к увеличению включения изотопа в 1,3-2 раза по сравнению с контролем
(без спирта) при иммунореактивности получаемых меченых белков 93-98 %. В отличие от
способа-прототипа метод позволяет использовать значительно меньшее количество хлорамина Т: 2 мкг и 150-500 мкг в прототипе, т.е. в 75-250 раз менее.
Использование водноспиртовых буферных растворов позволяет увеличить растворимость паров иода в реакционной среде, уменьшить его выброс в воздух рабочего помещения. Известно, что газообразный 125I2 является элементом с высокой радиотоксичностью,
относится к группе радиационной опасности "Б". Радиоактивный газообразный иод обладает высокой летучестью, образуется при окислении Na125I с хлорамином Т. При радиоиодировании хлораминовым методом с использованием 18,5 МБк Na125I выделяется
37 ± 22 кБк газообразного 125I2 [6]. Минимизация выброса уменьшает степень радиоактивного загрязнения оборудования и уровень облучения работающего персонала, обеспечивает поддержание требуемого уровня радиационной безопасности.
2
BY 10117 C1 2007.12.30
Сущность предлагаемого изобретения поясняется чертежами, где:
на фиг. 1 показана зависимость включения изотопа 125I в бычий сывороточный альбумин от концентрации изопропанола и времени реакции (−■− 10 с, −♦− 30 с, −▲− 60 с,
−●− 120 с);
на фиг. 2 показана зависимость включения изотопа 125I в гамма-глобулин кролика от
времени реакции и используемого спирта. Обозначения по оси X: 1-контроль, без спирта;
2-этанол, 20 %; 3-метанол, 30 %; 4-изопропанол, 20 %; 5-бутанол, 10 %; 6-избутанол,
10 %; 7-глицерин, 10 %.
Данные показывают, что растворитель не является инертной средой, в которой проводится мечение. По сравнению с контролем (без спирта) включение возрастает по мере
увеличения содержания изопропанола в реакционной среде (фиг. 1) до максимума при
концентрации 20 % (включение 81,7 %, контроль 61,4 %), при 30 % - 78 %, дальнейшее
увеличение в меньшей степени влияет на включение. Метанол и этанол оказывают меньшее влияние по сравнению с изопропанолом (фиг. 2). Максимальное включение при их
концентрации 20 % составляет 74,5 %, 76,0 % и 83,5 %, контроль 62,6 %. Вносит свой
вклад и природа используемых спиртов: при равной концентрации спирта (10 %) бутанол,
изобутанол и глицерин оказывают разное влияние. Максимальный эффект оказывает бутанол, причем при времени реакции 10 с включение составляет 28,2 % (контроль 12,4 %);
30 с - 57,1 % (33,5 %), 60 с - 72,0 % (52,0 %), 2 мин - 81,5 % (62,6 %). Внесение спирта заметно увеличивает включение изотопа, возможно, благодаря уменьшению летучести иода
за счет увеличения абсорбции его реакционной средой.
Заявляемый способ поясняется примером конкретного получения 125I-меченного белка, который не ограничивает объем изобретения.
В коническую пробирку Эппендорфа вносят 20 мкл 0,1 М натрий фосфатного буфера
(НФБ), рН 7,5, 10 мкл (74 МБк) Na125I, 20 мкл (30 мкг) хорионического гонадотропина,
15 мкл изопропанола. Реакцию инициируют внесением 10 мкл (2 мкг) свежеприготовленного раствора хлорамина Т в 0,1 М НФБ, перемешивают 60 с на встряхивателе пробирок
(1292 Rack Shaker, LKB, Швеция). Реакцию останавливают прибавлением 50 мкл (2 мкг)
метионина в 0,05 М НФБ. Разбавляют реакционную смесь 150 мкл 0,05 М НФБ, наносят
на колонку с сефадексом G-100 (1×40 см), уравновешенную 0,05 М НФБ, содержащим
0,1 % бычьего сывороточного альбумина, 0,15 М NaCl и 0,02 % NaN3. Элюирование проводят этим же буфером со скоростью 6 мл/ч. Фракции по 0,5 мл собирают на коллекторе
фракций LKB 2112. Из фракций отбирают аликвоты по 10 мкл и просчитывают их активность на гамма-счетчике RIA-Gamma 1274 фирмы LKB. Методом осаждения водным раствором 20 %-ной трихлоруксусной кислоты определяют фракции, содержащие 125I-ХГ.
Выход меченого продукта составил 68,1 %. Без изопропанола, в этих же условиях, включение равно 52,0 %. Иммунореактивность 125I-ХГ составляет 93-98 %.
Источники информации:
1. Hunter W.M., Greenwood F.C. // Nature. - 1962. - V.194. - № 4827. - P. 495-496.
2. Seevers R.R.H., Counsell R.E. // Chem. Rev. - 1982. - V.82. - P. 575-590.
3. Crim J.W., Garczynski S.F. Brown M.R. // Peptides (United States). - 2002. - V.23. № 11. - P. 2045-51.
4. Патент США 4219538, МПК А 61К 43/00, 1980.
5. Патент Японии 53-20569, МПК G 01N 31/22, 1978 (прототип).
6. Tanaka Y, Takeshima К. // Radioisotopes. 1984. - V. 33. - № 10. - P. 699-701.
3
BY 10117 C1 2007.12.30
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
202 Кб
Теги
by10117, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа