close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10120

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2007.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
C 07J 41/00
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 10120
(13) C1
(19)
{[(22R,23R,24R)-2α
α,3α
α,22,23-ТЕТРАГИДРОКСИ-24-МЕТИЛ-5α
αХОЛЕСТ-6-ИЛИДЕНАМИНО]ОКСИ}УКСУСНАЯ КИСЛОТА
В КАЧЕСТВЕ ГАПТЕНА В СИНТЕЗЕ КОНЪЮГАТА
24-ЭПИКАСТАСТЕРОНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ
АЛЬБУМИНОМ
(21) Номер заявки: a 20050843
(22) 2005.08.26
(43) 2007.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Хрипач Владимир Александрович; Свиридов Олег Васильевич; Литвиновская Раиса Павловна; Прядко Андрей Георгиевич;
Драч Светлана Васильевна; Жабинский Владимир Николаевич; Завадская Маргарита Ивановна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) Yokota T. et al. J. Plant Growth Regul.,
1990. - V. 9. - P. 151-159.
Schlagnhaufer C.D. et al. Supplement to:
Plant Physiology, 1988. - V. 86. - № 4. P. 113.
Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высшая школа, 1991. С. 176-183.
Хрипач В.А. и др. Брассиностероиды. Мн.: Навука i тэхнiка, 1993. - С. 15-21.
BY 10120 C1 2007.12.30
(57)
{[(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5α-холест-6-илиденамино]окси}уксусная кислота формулы
OH
HO
HO
HO
NOCH2COOH
в качестве гаптена для получения иммуногена - конъюгата 24-эпикастастерона с бычьим
сывороточным альбумином.
Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно новому химическому соединению - {[(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5α-холест-6илиденамино]окси}уксусной кислоты (далее 6-О-карбоксиметилоксим 24-эпикастастерона) формулы 1
BY 10120 C1 2007.12.30
OH
HO
HO
HO
1
NOCH2COOH
которое может быть использовано в качестве гаптена в синтезе иммуногена - конъюгата
24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином для получения антител, специфичных к 24R-метилбрассиностероидам.
Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают
ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко – 10-5-10-9 % и менее. В очень малых концентрациях они проявляют и
свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению
качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [27]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для
агропрепаратов. Одним из наиболее известных в настоящее время является препарат
ЭПИН, действующим веществом которого стал фитогормон 24-эпибрассинолид.
Все вышеизложенное ставит на повестку дня разработку методов анализа 24-эпибрассинолида и его химического и биохимического предшественника 24-эпикастастерона (далее 24R-метилбрассиностероиды). В качестве такого метода предложен метод иммуноферментного определения 24R-метилбрассиностероидов, который, прежде всего, требует
наличия соответствующего иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть
использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками, которые, в свою очередь,
могут быть получены через соответствующие гаптены.
В настоящее время неизвестны гаптены на основе 24-эпикастастерона или 24-эпибрассинолида. Наиболее близок к заявляемому гаптен на основе кастастерона (24S-эпимер заявляемого соединения) формулы 2
OH
HO
HO
HO
2
NOCH 2COOH
который предложен авторами для получения конъюгата с белком для выработки антител,
использованных в радиоиммуноанализе брассиностероидов [8]. Однако синтезированный
таким образом конъюгат, во-первых, отличается структурой боковой цепи стероидной мо2
BY 10120 C1 2007.12.30
лекулы, имеющей принципиальное значение для проявления физиологического эффекта,
и, во-вторых, не позволил получить антитела, специфичные даже к группе 24S-метилбрассиностероидов, для анализа которых он был предназначен.
Известен также гаптен брассинолида формулы 3
OH
HO
HO
O
O
O
O
O
3
OH
который представляет собой эфир янтарной кислоты по С3-гидроксильной группе брассинолида [9]. Синтезированный на его основе конъюгат также не позволил получить антитела, специфичные к исходным 24S-метилбрассиностероидам. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной
кислоты делает конъюгат на его основе нестабильным [9].
Неизвестны гаптены и, следовательно, иммуногены на основе 24R-метилбрассиностероидов.
Задачей настоящего изобретения является {[(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5α-холест-6-илиденамино]окси} уксусная кислота в качестве гаптена для
получения иммуногена (конъюгата 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином).
Поставленная задача решается заявляемым соединением в качестве гаптена, который
получают по описанному для производных тестостерона методу [11] взаимодействием 24эпикастастерона с гидрохлоридом О-карбоксиметилгидроксиламина в водном пиридине,
выделением и очисткой полученного соединения хроматографией на силикагеле.
Пример 1.
К раствору 0.1 г (0.2 ммоль) 24-эпикастастерона в 3 мл пиридина добавляют раствор 0.085 г гидрохлорида О-карбоксиметилгидроксиламина в 1 мл воды. Реакционную
смесь кипятят в течение 6 ч, затем вливают в воду, экстрагируют хлороформом, экстракт сушат над Na2SO4. Хроматографируют на силикагеле смесью этилацетат-метанол 10:1. Получают 0.095 г (86 %) 6-О-карбоксиметилоксим 24-эпикастастерона (1).
{[(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5α-холест-6-илиденамино]окси}уксусная кислота, Т. пл. 177-178 °С (ЭА-МеОН). 1Н NMR: 0.61 (с, 3Н, 18-Ме), 0.65 (с, 3Н,
19-Ме), 0.71-0.92 (m, 12Н, 21-, 26-, 27- и 28-Ме), 3.08-3.20 (m, 2Н), 3.40-3.56 (m, 2Н), 3.78
(m, 1Н), 4.42 (с, 2Н, -О-СН2-СО2Н). ИК-спектр (вазелиновое масло): 3490. ИК-спектр
(КВr): 3460, 2950, 2880, 1720, 1645, 1470, 1450, 1395, 1220, 1110.
Синтезированный гаптен используют для получения конъюгата 24-эпикастастерона с
бычьим сывороточным альбумином, что подтверждается примером конкретного выполнения.
3
BY 10120 C1 2007.12.30
Пример 2.
Растворяют 0.11 г (0.21 ммоль) {[(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил5α-холест-6-илиденамино]окси}уксусной кислоты и 0.019 г (0.165 ммоль) N-оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана, охлаждают до 5 °С и при перемешивании добавляют раствор 0.029 г (0.14 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0.5 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 °С и 20 ч при комнатной
температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным
Na2SO4, упаривают. Выход N-сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон-NOS
0.105 г (92 %). Маслообразный продукт, спектр 1Н NMR: 0.66 (с, 3Н, 18-Ме), 0.74 (с, 3Н,
19-Ме), 0.8-1.00 (m, 12Н, 21-, 26-, 27- и 28-Ме), 2.88 (с, 4Н, -С(О)-СН2-СН2-С(О)), 3.063.24 (m, 2Н), 3.28-3.38 (m, 2Н), 3.78 (m, 1Н), 3.92-4.00 (m, 1Н), 4.88 (m, 2Н, -O-CH2-CO).
ИК-спектр (пленка): 3440, 2950, 2880, 1755, 1730, 1725, 1390, 1215, 1090.
Растворяют 72 мг (101.55 мкмоль) N-оксисукцинимидного эфира 6-О-карбоксиметоксиламиноксима 24-эпикастастерона в 7 мл диоксана и добавляют 0.1 г (1.4 мкмоль) БСА
в 7 мл 0.1 М раствора бикарбоната натрия (рН 8.3). Перемешивают в течение 20 ч при
комнатной температуре.
Реакционную смесь подвергают диализу при 20 °С против дистиллированной воды в
течение 36 ч, затем против 1 % суспензии активированного угля в воде 20 ч, лиофилизуют
и замораживают при температуре -20 °С. Содержание гаптена в конъюгате, определенное
спектрофотометрически, составляет 25 моль гаптена на 1 моль белка.
Полученный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 24R-метилбрассиностероидам (24-эпибрассинолид и 24-эпикастастерон), что подтверждается примером конкретного выполнения.
Пример 3.
Группу из десяти кроликов иммунизировали конъюгатом эпикастастерон-БСА с плотностью посадки 25 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводили
подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл
фосфатно-буферного раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном
объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляли 3 недели.
Иммунизацию продолжали в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб
крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестировали на наличие
связывающей способности в отношении 24-эпикастастерона и определяли их титры и значения констант ассоциации (Ка). Титр определяли как рабочее разведение антисыворотки,
обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании
конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ.
Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных
конъюгатом 24-эпикастастерона с БСА
Антисыворотка
А1
А2
Ка×109М-1
1,5
1,9
Титр
1:10000
1:20000
Таким образом, определение оптимального титра антисыворотки для применения в
ИФА показало, что ее разбавление в 10000 (А1) или 20000 (А2) раз позволяет обеспечить
приемлемые условия определения эпикастастерона.
4
BY 10120 C1 2007.12.30
Источники информации:
1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. Мн.: Навука i тэхнiка, 1993. - 288 с.
2. Патент РБ 2806, МПК6 G 21F 9/00, 1999.
3. Патент РБ 3488, МПК6 C07J 9/00, 2000.
4. Патент РБ 3400, МПК6 C07J 9/00, 2000.
5. Патент РБ 5168, МПК7 А 01N 45/00, 2003.
6. Патент РБ 5212, МПК7 А 01N 43/00, 2003.
7. Патент РБ 5698, МПК7 А 01Н 4/00, А 01N 43/00, C07J 9/00, 63/00, 2003.
8. Yokota Т., Wanabe S., Ogino Y., Yamaguchi I., Takahashi N. // J Plant Growth Regul. 1990. - Vol. 9. - P.151.
9. Carl D. Schlagnhaufer, Richard N. Arteca and Allen T. Phillips. Monoclonal antibodies
against brassinosteriod a new plant growth regulating compound. Plant Physiol. (Suppl.) - 1988. Vol. 86. - P. 113.
10. Carter M.C., Meyerhoff M.E. //J. Immunol. Methods. -1985. - Vol. 81. - P. 245.
11. Rao P.N., Shain S.A, Axelrod L.R. // J. Ster. Biochem. - 1974. - Vol. 5. - P. 433.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
97 Кб
Теги
патент, by10120
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа