close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10279

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.02.28
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 10279
(13) C1
(19)
C 12P 19/00
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИ-5′′-ФТОРУРИДИЛОВОЙ КИСЛОТЫ
(21) Номер заявки: a 20050957
(22) 2005.10.05
(43) 2007.06.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Титович Ольга Иринеушевна; Ерошевская Людмила Анатольевна; Зинченко Анатолий Иванович
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) Есипов Р.С. и др. Горизонты физикохимической биологии. Школа-конференция. Пущино, 2000. - Т. 2. - С. 39-40.
GRUNBERG-MANAGO M. et al. Biochimica et Biophysica Acta, 1964. - V. 87. No 4. - P. 541, 594-600.
BY 10279 C1 2008.02.28
(57)
Способ получения поли-5′-фторуридиловой кислоты, заключающийся в том, что реакционную смесь, содержащую в 0,2 М Трис-НCl-буфере 2,0 ммоля 5-фтор-уридин-5′дифосфата и 7,5 ед. изолированной из бактериальных клеток полинуклеотидфосфорилазы,
инкубируют при рН 8,5 и температуре 50 °С до прекращения накопления целевого продукта, после чего в смесь вносят 12 ммоль уридина и клетки Escherichia coli БИМ В-200Д
в количестве, эквивалентном 160 ед. уридинфосфорилазы, и продолжают инкубировать до
максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением.
BY 10279 C1 2008.02.28
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментативным способам
получения 5-фторуридиловой кислоты [поли-(5-фтор-У)] - полимера, общей формулы
(C9H10FN2O8P)n, где n = 1500-4500 (молекулярная масса 300-1000 кДа):
O
F
NH
O
O
P
O
O
N
O
O
OH
F
NH
O
O
P
OH
,
O
N
O
O
O
OH
F
NH
O
O
P
OH
N
O
O
O
OH
O
OH
являющегося «депо-формой» противоопухолевого модифицированного нуклеотида
(5-фторуридин-5'-монофосфата) и применяющегося для химиотерапии злокачественных
опухолей желудочно-кишечного тракта, мозга, кожи, яичников и др. органов [1, 2].
Известен химический способ получения поли-(5-фтор-У) [3] с использованием твердофазного ДНК-синтезатора фирмы Applied Biosystems (модель 380В) из 5-фторуридина с
защищенными 2'-, 3'- и 5'- гидроксильными группами.
Недостатками указанного химического способа получения поли-(5-фтор-У) являются
многостадийность, трудоемкость и длительность процесса, а также необходимость использовать сложную, дорогостоящую аппаратуру и токсичные растворители (безводные
метанол, пиридин, тетрагидрофуран).
Из известных способов получения поли-(5-фтор-У) наиболее близким к заявляемому
способу по технической сущности и достигаемому эффекту является ферментативный
способ получения поли-(5-фтор-У) [4] (прототип), предусматривающий инкубацию
5-фторуридин-5'-дифосфата (5-фтор-УДФ) с полинуклеотидфосфорилазой Azotobacter
vinilandii при 30 °С в присутствии 0,1 М Трис-НСl-буфера (рН 8,2) и 2 мМ MgCl2. Выход
целевого продукта в реакции синтеза составляет 25 мол. % в расчете на взятый в реакцию
5-фтор-УДФ.
Недостатком способа-прототипа получения поли-(5-фтор-У) является низкий выход
целевого продукта. Это обусловлено, главным образом, обратимостью протекающей реакции: фермент катализирует не только прямую, но и обратную реакцию, т.е. фосфоролиз
целевого продукта с образованием исходного 5-фтор-УДФ.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение выхода целевого продукта.
Поставленная задача решается за счет того, что 5-фтор-УДФ инкубируют с бактериальной полинуклеотидфосфорилазой до достижения реакцией состояния равновесия, затем в реакционную смесь вносят уридин и клетки Escherichia coli БМ-21 и реакционную
2
BY 10279 C1 2008.02.28
смесь продолжают инкубировать до момента достижения максимального выхода целевого
продукта. При этом в качестве полинуклеотидфосфорилазы используют фермент преимущественно Е. coli или Enterobacter amnigenus БИМ В-245.
Целевой продукт выделяют из реакционной смеси известными приемами.
Заявляемый способ описывается следующим уравнением реакции:
полинуклеотидфосфорилаза
5-Фтор-УДФ
поли-(5-фтор-У)+Фн
Уридин
уридинфосфорилаза
Рибозо-1-фосфат
Проводят инкубацию 5-фтор-УДФ с полинуклеотидфосфорилазой. При этом происходит полимеризация 5-фтор-УДФ, сопровождающаяся образованием целевого продукта поли-(5-фтор-У) и побочного продукта - неорганического фосфата (Фн) (схема). Поскольку реакция обратима, через некоторое время она достигает состояния равновесия, характеризующегося прекращением накопления целевого продукта в среде. В этот момент в
реакционную смесь вводят уридин и клетки Е. coli, проявляющие уридинфосфорилазную
активность, и смесь продолжают инкубировать до достижения максимального выхода целевого продукта.
В результате протекания известной реакции фосфоролиза уридина под действием уридинфосфорилазы в составе клеток Е. coli БМ-21 [5] неорганический фосфат (Фн), образовавшийся в результате прямой реакции в виде побочного продукта, трансформируется в
рибозо-1-фосфат, становясь, таким образом, недоступным для полинуклеотидфосфорилазы,
т.е. теряет возможность участвовать в обратной реакции - фосфоролизе целевого продукта.
Кроме того, удаление из реакционной среды неорганического фосфата по закону действующих масс приводит к сдвигу равновесия процесса в сторону образования дополнительного количества целевого продукта. Все это, в конечном счете, находит свое
выражение в достижении 75 %-ного выхода поли-(5-фтор-У) (рисунок в примере 1).
На стадии синтеза поли-(5-фтор-У) используют полинуклеотидфосфорилазу, изолированную преимущественно из клеток Е. coli, и Enterobacter amnigenus (таблица в примере 2),
на стадии фосфоролиза уридина - клетки Е. coli БМ-21.
Штамм Е. coli БМ-21 депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси под коллекционным номером
БИМ В-200Д.
По мнению авторов, приводящее к решению поставленной задачи сочетание указанных выше двух ферментативных реакций является новым, так как не является очевидным
для специалистов и не встречается в общедоступной патентной и научно-технической литературе.
Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного осуществления.
Пример 1
Получение поли-(5-фтор-У) в оптимальных условиях проведения процесса.
Реакционную смесь (0,1 л), содержащую 0,94 г 5-фтор-УДФ (2,0 ммоль), 0,2 М ТрисНСl-буфер (рН 8,5), 10 мМ MgCl2, 2 мМ ЭДТА и 7,5 ед. полинуклеотидфосфорилазы (изо3
BY 10279 C1 2008.02.28
лированных из клеток Enterobacter amnigenus БИМ В-245), инкубируют при 50 °С. За приростом количества целевого продукта в смеси следят с помощью тонкослойной хроматографии на тонкослойных пластинках "Silufol-UV254" фирмы "Serva" (Германия) в системе
растворителей: диоксан - изо-пропанол - вода - 25 %-ный аммиак (4:2:4:1; об/об).
Спустя 10 ч к реакционной смеси добавляют 2,93 г уридина (12 ммоль) и клетки Е. coli
БМ-21 (160 ед. уридинфосфорилазы), после чего смесь продолжают инкубировать в течение 11 ч.
Динамику накопления целевого продукта в реакционной смеси отражает фигура.
Стрелкой указан момент внесения в реакционную смесь уридина и клеток Е. coli.
По окончании реакции к реакционной смеси добавляют 2 объема хлороформа и интенсивно встряхивают при комнатной температуре в течение 10 мин. После центрифугирования смеси (5000 g, 5 мин) отбирают водную фазу. Из нее осаждают целевой продукт
одним объемом этанола. Осадок формируют 16 ч при комнатной температуре, последовательно промывают 60 %-ным и 96 %-ным этанолом и высушивают при комнатной температуре в течение 6 ч. Получают 0,48 г хроматографически чистого поли-(5-фтор-У), что
соответствует 69 %-ному молярному выходу в расчете на взятый в реакцию 5-фтор-УДФ.
УФ-спектр поглощения целевого продукта:
(рН 7), λмакс нм (ε): 267 (6500)
совпал со спектром поли-(5-фтор-У), описанным в литературе [6].
Элементный состав для (C9H10FN2O8P)n; M мономера = 324,1565.
Вычислено, %: С 33,35; Н 3,09; N 8,65; F 5,86.
Найдено, %: С 33,26; Н 3,10; N 8,34; F 5,80.
Величина молекулярной массы продукта, определенная с помощью гель-фильтрации
на колонках со смолой Toyopearl HW-60F и HW-65F, находилась в пределах 300-1000 кДа.
Пример 2
Получение поли-(5-фтор-У) при использовании полинуклеотидфосфорилаз из различных микроорганизмов.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что в
качестве биокатализатора используют полинуклеотидфосфорилазы, изолированные из
клеток различных микроорганизмов. Достигнутые выходы реакции синтеза поли-(5-фтор-У)
(без выделения целевого продукта) представлены в таблице.
Выход реакций синтеза поли-(5-фтор-У), катализируемых полинуклеотидфосфорилазой,
изолированной из наиболее активных из 42 проверенных штаммов бактерий
Выход реакций синтеза
Относительная
Микроорганизм
поли-(5-фтор-У), мол. %
эффективность, %
Enterobacter amnigenus БИМ В-245
75,0
100
Escherichia coli MRE-600
74,9
100
Escherichia coli (продукт фирмы
Sigma, США)
73,5
98
Escherichia coli БИМ В-389Д
72,0
96
Escherichia coli БМ-11
71,9
96
Enterobacter amnigenus БМ-56
71,8
96
Bacillus subtilis БИМ R-l12
70,5
94
Paenibacillus alvei БИМ В-218
69,7
93
Bacillus subtilis БИМ С-132
69,7
93
Bacillus licheniformis БИМ C-128e
68,2
91
Erwinia herbicola БИМ В-345
68,2
91
Enterobacter sp. CM-3x
67,5
90
Bacillus subtilis БИМ С-73
67,5
90
Erwinia carotovora БИМ В-73
66,7
89
4
BY 10279 C1 2008.02.28
Из данных таблицы следует, что, хотя эффективность применения полинуклеотидфосфорилазы, изолированной из бактерий Е. coli MRE-600 и Enterobacter amnigenus
БИМ В-245, несколько выше эффективности этого фермента, изолированного из других
микроорганизмов, тем не менее задача заявляемого изобретения решается с использованием любого из приведенных в таблице бактериальных штаммов.
Представленные материалы свидетельствуют о том, что использование предлагаемого
способа получения поли-(5-фтор-У) обеспечивает по сравнению с известным способом
преимущество в виде увеличения выхода целевого продукта в расчете на исходный
5-фтор-УДФ с 25 до 69 мол. %.
Источники информации:
1. Pat. 5457187 US. Oligonucleotides containing 5-fluorouracil / W.H. Gmeiner, P.L. Iversen.
2. Pat. 5663321 US. Oligonucleotide prodrugs containing 5-fluorouracil / W.H. Gmeiner,
P.L. Iversen.
3. Pat. 5614505 US. Method of treating cancer with homo-oligonucleotides of 5-FU 5'- monophosphate / W.H. Gmeiner, P.L. Iversen.
4. Grunberg-Manago M., Michelson A.M. Polynucleotide analogues. IV. Polyfluorouridylic
acid and copolymers containing fluorouridylic acid // Biochim. Biophys. Acta. 1964. Vol. 87.
P. 593-600 (прототип).
5. Пат. 5602 BY. Способ получения 2-хлор-2'-дезоксиаденозина / И.А. Михайлопуло,
Е.Н. Калиниченко, А.И. Зинченко, В.Н. Барай, Л.А. Ерошевская.
6. Massoulie J., Michelson A.M., Pochon F. Polynucleotide analogues. VI. Physicial studies
on 5-substituted pyrimidine polynucleotides // Biochim. Biophys. Acta. 1966. Vol. 114, No 1. P. 16-26.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
116 Кб
Теги
патент, by10279
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа