close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10314

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.02.28
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 10314
(13) C1
(19)
G 01N 33/50
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРИУТРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ
ХЛАМИДИЙНОЙ, МИКОПЛАЗМЕННОЙ ИЛИ ТРИХОМОНАДНОЙ
ЭТИОЛОГИИ У НОВОРОЖДЕННОГО
(21) Номер заявки: a 20050545
(22) 2005.06.02
(43) 2007.02.28
(71) Заявитель: Государственное учреждение образования "Белорусская медицинская академия последипломного образования" (BY)
(72) Авторы: Хулуп Геннадий Яковлевич; Бадыгина Наталья Александровна; Костюк Светлана Андреевна; Исмаил Марианна Николаевна
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение образования "Белорусская
медицинская академия последипломного образования" (BY)
(56) Шабалдин А.В. и др. Педиатрия. - 2000. № 3. - С. 38-41.
Ткаченко А.К. Современные аспекты
клиники, диагностики, лечения внутриутробных инфекций у новорожденных. - Мн., 2003. - С. 13-14.
RU 2225008 C2, 2004.
RU 2110800 C1, 1998.
RU 2231791 C2, 2004.
BY 10314 C1 2008.02.28
(57)
Способ диагностики внутриутробной инфекции хламидийной, микоплазменной или
трихомонадной этиологии у новорожденного, заключающийся в том, что проводят ПЦР в
соскобе эпителиальных клеток из ротовой полости и носовых путей новорожденного и
при положительной ПЦР и наличии у новорожденного отягощенного анамнеза диагностируют наличие инфекции.
Изобретение относится к области медицины, а именно: к способам ранней (доклинической) диагностики внутриутробных инфекций (ВУИ) в момент рождения ребенка.
Известен способ выявления внутриутробных инфекций (ВУИ) у новорожденных, где
объектами исследования в момент рождения ребенка являются аспират из глотки, желудка, моча, меконий, спинномозговая жидкость, отделяемое из конъюнктивы, ушей, периферическая кровь, послед. Основными клинико-лабораторными тестами диагностики данной
группы инфекционных агентов предложены как методы прямого выявления возбудителей:
микроскопический, культуральный, обнаружения антигенов с помощью реакций иммунофлюоресценции, методы молекулярной гибридизации, так и непрямого - выявление
специфических антител иммуноферментным методом [1].
Недостатками этого способа являются трудность получения биологического материала, требующих дополнительных инвазивных врачебных манипуляций, необходимость
специальной подготовки сотрудников, а также требуют значительных трудовых и временных затрат.
Вместе с тем выявление возбудителей хламидийно-микоплазменно-трихомонадной
инфекции в соскобе эпителиальных клеток из ротовой полости и носовых ходов новорож-
BY 10314 C1 2008.02.28
денного с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет проводить быстрое прямое установление инфекционных агентов с высокой чувствительностью и специфичностью.
Задачей заявленного способа является прямое раннее выявление возбудителей хламидийно-микоплазменно-трихомонадной инфекции в соскобе эпителиальных клеток ротовой полости и носовых ходов новорожденных с помощью полимеразной цепной реакции
(ПЦР).
Поставленная задача достигается следующим образом.
Предложенный способ диагностики внутриутробной инфекции (ВУИ) хламидийной,
микоплазменной или трихомонадной этиологии у новорожденных заключается в том, что
проводят ПЦР в соскобе эпителиальных клеток из ротовой полости и носовых путей и при
положительной ПЦР и наличии у новорожденного отягощенного анамнеза диагностируют
наличие инфекции.
Пример.
Новорожденный женского пола, вес 2680 г, оценка по шкале Апгар 5/7, общее состояние тяжелое, крик слабый, кожные покровы и видимые слизистые цианотичны, асфиксия
новорожденного умеренной степени, врожденная пневмония, катаральный конъюнктивит,
ларингит. Мать В., 29 лет, история родов 3717, роды первые, 36-37 нед., Е1Р1Н1 гестоз,
преждевременное излитие околоплодных вод, родоразрешена путем кесарева сечения.
Для выявления ДНК возбудителей у новорожденных производят соскоб из носовых
ходов, слизистой поверхности ротовой полости. Стерильной одноразовой цитощеткой
вращательными движениями поочередно в обоих носовых ходах и ротовой полости производят соскоб эпителиальных клеток.
Из соскобов эпителиальных клеток ДНК выделяют сорбционным методом: адсорбции
на частицах двуокиси кремния в присутствии гуанидинатицианата натрия, отмывая этиловым спиртом. При этом к 100 мкл физиологического раствора, содержащего клинический
материал в пробирке объемом 1,5 мл (типа Eppendorf), добавляют 300 мкл раствора I (лизирующего, 6 М раствор гуанидина изотиоцианата) и 10 мкл суспензии сорбента (SiO2).
Пробы инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, 1-2 раза перемешивая
на микроцентрифуге при 1500 об/мин. Пробы центрифугируют в течение 15 с на центрифуге при 12 тыс. оборотов в мин, супернатант удаляют. К осадку добавляют 100 мкл раствора II (промывочного, 96 % этанол, содержащий 100 мМ ацетат натрия (рН 4,8)), встряхивают и центрифугируют. Процедуру отмывки повторяют 2 раза с использованием
раствора III (промывочного, 70 % этанол). Пробирки помещают в твердотельный микротермостат и подсушивают пробы 5 мин при температуре 50 °С, оставляя пробирки открытыми. В пробирки с осадком добавляют 50 мкл ТЕ буфера (на 1 л буфера: 0,04 М Трисацетат (242 г Трис, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты), 0,002 М ЭДТА (100 мл 0,5 М ЭДТА
рН 8,0) и инкубируют в течение 5 мин при 50 °С. Пробирки центрифугируют в течение 15 с
при 12 тыс. оборотов. Водную фазу используют в качестве исследуемого образца ДНК для
постановки реакции амплификации.
В пробирки типа Eppendorf объемом 0,5 мл вносят 5 мкл анализируемого образца. В
каждую из пробирок добавляют 20 мкл амплификационной смеси, состоящей из 17,5 мкл
разбавителя, 2,5 мкл реакционной смеси и 0,2 мкл Taq-полимеразы. Добавляют 25 мкл
минерального масла.
Амплификацию ДНК проводят в многоканальном амплификаторе по следующей программе для Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum:
1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали) - + 93 °С...30 с
2. Отжиг (присоединение праймеров)
+ 93 °С...10 с
+ 60 °С...10 с - 35 циклов
+ 72 °С...10 с
3. Элонгация (достраивание цепей ДНК) + 72 °С...60 с.
2
BY 10314 C1 2008.02.28
С помощью источника тока с фиксированным напряжением 150 В полученные ампликоны разгоняют электрофорезом в 1,5 % агарозном геле, содержащем 1 % бромистый этидий в течение 30 мин при напряжении 10 В/см.
Для оценки результатов используют трансиллюминатор Н-2 с длиной волны 310 нм с
применением видеосистемы для регистрации гелей "Gel-Imager" с помощью программы
"Gel Exploer" версия 1,0 на базе компьютера Intel Pentium-4.
Анализ результатов проводят по внутренним контролям и контрольным образцам.
В соскобе эпителиальных клеток ротовой полости и носовых ходов новорожденного
на 2-е сутки жизни с помощью полимеразной цепной реакции с электрофоретической
схемой детекции продуктов амплификации обнаружена ДНК Chlamydia trachomatis. По
результатам ПЦР-диагностики ребенку была назначена специфическая антибактериальная
терапия (максипин, кетоцефен, гентомицин, клацид, дифлюкан).
Таким образом, по сравнению с прототипом заявленный способ позволяет получить
следующие преимущества: проводить быстрое прямое установление этиологии внутриутробных инфекций у новорожденных с высокой диагностической специфичностью и чувствительностью с использованием в качестве биологического материала малоинвазивного
соскоба из ротовой полости и носовых ходов, что позволит врачам-неонатологам проводить выбор этиологической и патогенетической терапии, а также контроль за результатами лечения.
Источники информации:
1. Ткаченко А.К. Современные аспекты клиники, диагностики, лечения внутриутробных инфекций у новорожденных: (учебно-методическое пособие). - Мн.: МГМИ, 2003. С. 34.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
75 Кб
Теги
by10314, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа