close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10495

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.04.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 01H 1/04
СПОСОБ ОЦЕНКИ ТРАНСГЕННОГО КАРТОФЕЛЯ
НА УСТОЙЧИВОСТЬ К Y-ВИРУСУ
(21) Номер заявки: a 20040106
(22) 2004.02.19
(43) 2005.09.30
(71) Заявитель: Республиканское унитарное предприятие "Научно-практический центр Национальной академии
наук Беларуси по картофелеводству
и плодоовощеводству" (BY)
(72) Авторы: Яковлева Галина Анатольевна; Родькина Инна Александровна
(BY)
BY 10495 C1 2008.04.30
BY (11) 10495
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Республиканское
унитарное предприятие "Научнопрактический центр Национальной
академии наук Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству" (BY)
(56) SU 1745161 А1, 1992.
SU 1470246 А1, 1989.
Шмальц Х. Селекция растений. - Москва: Колос, 1973. - С. 104-105, 128-131.
SU 1745160 А1, 1992.
JP 10127290 А, 1998.
(57)
Способ оценки трансгенного картофеля с любой последовательностью генома Yвируса на устойчивость к штамму или штаммам Y-вируса, заключающийся в том, что
оценку проводят в течение трех лет, при этом в первый год трансгенное растение размножают в культуре in vitro, получают линии растений, которые высаживают в условия защищенного грунта и заражают путем механической инокуляции Y-вирусом, причем инокулюм
готовят непосредственно перед заражением из сока листьев растения-инфектора с использованием калий-фосфатного буфера, в качестве контроля проводят механическую инокуляцию одного растения картофеля калий-фосфатным буфером, в качестве контроля на
эффективность заражения остатками инокулюма заражают группу растений табака сорта
Самсун, а вторую группу растений табака сорта Самсун инокулируют водопроводной водой, механическую инокуляцию проводят дважды с интервалом в 6-8 суток, затем через
21-30 суток после второй инокуляции проводят определение титра вируса в соке опытных
растений методом иммуноферментного анализа, на второй год клубни, полученные от каждого растения, высаживают в полевые условия на инфекционный фон, который создают
чередованием делянок опытных растений, полученных путем размножения трансгенного
картофеля, с делянками полевых инфекторов Y-вируса картофеля, с интервалом в 6-8 суток осуществляют механическую инокуляцию растений картофеля Y-вирусом, а в фазу
бутонизации-цветения растений определяют их пораженность Y-вирусом, на третий год
клубни здоровых и слабоинфицированных растений высаживают в полевые условия на
инфекционный фон, выделяют здоровые растения трансгенного картофеля со стабильным
проявлением устойчивости к вирусу и тестируют их методом индикаторных растений, с
помощью иммуноферментного анализа и на тип устойчивости к Y-вирусу методом прививки черенков здорового полевого растения картофеля на зараженное Y-вирусом растение-накопитель вирусной инфекции, причем результат иммуноферментного анализа
растения определяют по формуле:
СО = (у1 + у2 + у3)/3-ОП-Рi,
BY 10495 C1 2008.04.30
где СО - среднее отклонение значения оптической плотности от порога достоверности положительных результатов;
у1, у2, у3 - значения оптического поглощения проб;
ОП - значение оптического нуля планшеты;
Рi - среднее значение порога достоверности положительных результатов,
и при отрицательном либо равном нулю значении СО судят об отсутствии вируса в соке
трансгенного картофеля, при значении СО менее 0,05 трансгенный картофель считают
слабозараженным, при значении СО от 0,051 до 0,1 трансгенный картофель считают среднезараженным, при значении СО более 0,101 трансгенный картофель считают сильнозараженным.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что растение-накопитель штамма Y-вируса
картофеля сохраняют и размножают в культуре in vitro.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что место прививки изолируют парафильмом.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к области фитопатологии, и
может найти применение в биотехнологии.
Известны способы оценки картофеля на устойчивость к Y-вирусу путем механической
инокуляции вирусом и (или) выращивания на инфекционном фоне и дополнительном использовании прививки на инфицированные растения томата при оценке на иммунитет с
применением комплекса диагностических методов: визуальный, серологический, электронномикроскопический, индикаторный, иммуноферментный без изложения конкретных
протоколов исполнения последовательности определенных приемов [1].
К недостаткам относится необходимость применения различных приемов в зависимости от оценки растений из ботанических семян и селекционного материала, испытания на
устойчивость к Y-вирусу и испытания на иммунитет. Испытание на иммунитет сеянцев
проводится только на 4-й год оценки (питомник гибридов 3-го года). Способы не позволяют выявить возможность расщепления оцениваемого образца по признаку устойчивости
к вирусу, т.к. не предусматривают определение накопления вируса в популяции растенийклонов конкретного образца. При оценке сеянцев в первый год возможно и проводится
искусственное заражение только одного растения на образец, а при оценке селекционного
материала заражаются 3-5 растений, выросших из случайно выбранных клубней сорта или
гибрида. Следовательно, способы не позволяют отобрать образцы со стабильной экспрессией признака устойчивости к Y-вирусу. Способы не предусматривают создание постоянного на период оценки жесткого инфекционного фона, который позволил бы за короткий
срок выявить образцы, имеющие склонность к накоплению вирусной инфекции.
Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа, является способ оценки картофеля на устойчивость к Y-вирусу и отбора исходных форм с различным типом
устойчивости путем механической инокуляции растений картофеля на стадии 3-5 настоящих листьев соком растения-инфектора дважды с интервалом через неделю, использования в качестве инфектора растения табака, содержащего разные штаммы вируса Y,
предварительного посыпания 2-х листьев картофеля абразивом, последующего их натирания поролоновой губкой с суспензией сока табака, смывания сока водой, испытания безсимптомных и не содержащих вируса растений путем заражения индикаторных растений
для выявления латентной инфекции и путем прививки для определения устойчивости по
типу сверхчувствительность или иммунитет, использования инфекционного фона в полевых условиях [2].
Недостатками способа являются:
отсутствие единой последовательности приемов, ограниченной временными рамками,
которая позволила бы и оценить изучаемый материал на устойчивость к Y-вирусу и отобрать исходные формы с различным типом устойчивости;
2
BY 10495 C1 2008.04.30
выбраковка на первой стадии оценки (механическая инокуляция) всех зараженных
Y-вирусом образцов (исключение - образцы с локальными, рассеянными и верхушечными
некрозами при выделении исходных форм в семенном потомстве в случае испытания иммунитета и сверхчувствительности неспецифического типа [2], раздел 1.2.1.), что может
привести к потере ценных форм, которые способны оздоравливаться после первичного
поражения вирусом;
отсутствие оценки стабильности экспрессии признака.
Задачей, решаемой данным изобретением, является разработка способа оценки трансгенного картофеля на устойчивость к Y-вирусу и отбора исходных форм с различным типом устойчивости к вирусу путем определения конкретной ограниченной временными
рамками последовательности приемов работы с трансгенным картофелем, содержащим
любую последовательность вирусного генома.
Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе оценки трансгенного
картофеля с любой последовательностью генома Y-вируса на устойчивость к штамму или
штаммам Y-вируса оценку проводят в течение трех лет, при этом в первый год трансгенное растение размножают в культуре in vitro, получают линии растений, которые высаживают в условия защищенного грунта и заражают путем механической инокуляции Yвирусом, причем инокулюм готовят непосредственно перед заражением из сока листьев
растения-инфектора с использованием калий-фосфатного буфера, в качестве контроля
проводят механическую инокуляцию одного растения картофеля калий-фосфатным буфером, в качестве контроля на эффективность заражения остатками инокулюма заражают
группу растений табака сорта Самсун, а вторую группу растений табака сорта Самсун
инокулируют водопроводной водой, механическую инокуляцию проводят дважды с интервалом 6-8 суток, затем через 21-30 суток после второй инокуляции проводят определение титра вируса в соке опытных растений методом иммуноферментного анализа, на
второй год клубни, полученные от каждого растения, высаживают в полевые условия на
инфекционный фон, который создают чередованием делянок опытных растений, полученных путем размножения трансгенного картофеля, с делянками полевых инфекторов Yвируса картофеля, с интервалом 6-8 суток осуществляют механическую инокуляцию растений картофеля Y-вирусом, а в фазу бутонизации-цветения растений определяют пораженность Y-вирусом, на третий год клубни здоровых и слабоинфицированных растений
высаживают в полевые условия на инфекционный фон, выделяют здоровые растения
трансгенного картофеля со стабильным проявлением устойчивости к вирусу и тестируют
их методом индикаторных растений, с помощью иммуноферментного анализа и на тип
устойчивости к Y-вирусу методом прививки здорового полевого растения картофеля на
зараженное Y-вирусом растение-накопитель вирусной инфекции, причем результат иммуноферментного анализа растения определяют по формуле:
CO = (y1 + y2 + y3) / 3 - OП - Pi,
где СО - среднее отклонение значения оптической плотности от порога достоверности положительных результатов;
y1, у2, у3 - значения оптического поглощения проб;
ОП - значение оптического нуля планшеты;
Pi - значение порога достоверности положительных результатов.
и при отрицательном либо равном нулю значении СО судят об отсутствии вируса в соке
трансгенного картофеля, при значении СО менее 0,05 трансгенный картофель считают слабозараженным, при значении СО от 0,051 до 0,1 трансгенный картофель считают среднезараженным, при значении СО более 0,101 трансгенный картофель считают сильнозараженным.
Причем растения-накопители штаммов вируса Y картофеля сохраняют и размножают
в культуре in vitro. Кроме того, место прививки изолируют парафильмом.
3
BY 10495 C1 2008.04.30
Пример конкретного исполнения
Исходный материал - трансгенные растения с любой последовательностью генома вируса Y картофеля, половое потомство трансгенных образцов в виде растений сеянцев, полученных из ботанических семян, любые растения картофеля, а также их половое
потомство. Трансгенные растения с геном белка оболочки вируса Y картофеля размножали в культуре in vitro на агаризованной среде Мурасиге-Скуга. Образцы пассировали до
получения необходимого количества растений (10 растений на образец). Примерно через 3
недели после последнего черенкования отбирали по 7-8 растений с хорошо развитой корневой системой от каждого образца. Для высадки растений в условия защищенного грунта
готовили следующую смесь: 2 части торфа: 1 часть песка: 1 часть земли. После перемешивания смесью заполняли пластмассовые горшки и кассеты.
В первый год растения in vitro трансгенных образцов высаживали в 12-ячеечные пластмассовые кассеты (по 6 растений на образец) в условия теплицы. Впоследствии эти растения (родоначальники линий в образце) были инфицированы вирусом - питомник
инфицированных линий. Одновременно в горшки высаживали по одному растению от каждого опытного образца - питомник неинфицированных растений. Для контроля эффективности заражения были высажены 6 растений табака сорта Самсун. Подросшие
растения трансгенных образцов на стадии 3-5 настоящих листьев путем механической
инокуляции заражали смесью штаммов YO + YN. Инокулюм готовили путем растирания
листьев растений-инфекторов в фарфоровой ступке непосредственно перед заражением. С
целью стабилизации вирусных частиц сок растений-инфекторов смешивали с калийфосфатным буфером (рН 7,4) в соотношении 1:1. Растения-инфекторы (табак сорта Самсун) были введены в культуру in vitro и поддерживались черенкованием на агаризованную
среду Мурасиге-Скуга. По сравнению с прототипом культивирование растений-инфекторов в
условиях in vitro обеспечивает: 1) наличие штаммов вируса для заражения в течение всего
года, независимо от вегетативного сезона; 2) возможность получения вегетативной массы
инфекторов практически в неограниченных количествах; 3) хранение выделенных изолятов с известным штаммовым составом продолжительный период времени. Для получения
необходимой вегетативной массы черенки растений-инфекторов высаживали в колбы на
500 мл или их соком инокулировали растения табака на стадии 3-5 настоящих листьев,
которые выращивали в условиях защищенного грунта. Для приготовления инокулюма
были использованы растения табака, зараженные разными штаммами вируса - YO, YN.
Суспензия штаммов втиралась в поверхность 2-х листьев трансгенных растений, предварительно опудренных абразивом, например карборундом или толченым стеклом, с помощью поролоновой губки, а через 1-2 мин натертые листья смывали водой.
Одновременно с заражением по 1 растению от каждого образца натирали губкой, смоченной калий-фосфатным буфером, - питомник неинфицированных растений (отрицательный контроль). Наличие питомника неинфицированных растений позволяет судить о
реакции генетически идентичных трансгенных растений на механическое воздействие без
внесения инфекции, в отличие от прототипа, где отсутствует контроль на повреждение
эпидермиса листа. В прототипе наличие контроля к анализируемому образцу предусматривается в случае выделения исходных форм в клубневом потомстве и определении наличия полевой устойчивости, когда из клубня вырезаются два глазка и из выросших из них
растений механической инокуляции подвергается только одно. Остатками инокулюма заражали растения табака сорта Самсун, которые служили положительным контролем на
эффективность заражения, в отличие от прототипа и аналога, где такого контроля нет.
Между тем всегда существует возможность потери вирулентности вирусных частиц под
воздействием внешних условий окружающей среды (прямые солнечные лучи, температура воздуха и временной интервал заражения опытного материала). Заражение растенийнакопителей вируса Y остатками инокулюма и последующая диагностика симптомов позволяет контролировать воздействие окружающей среды на активность вирусных частиц.
4
BY 10495 C1 2008.04.30
Через неделю заражение повторяли. Питомники неинфицированных и инфицированных
растений были пространственно изолированы и накрыты марлевыми изоляторами.
На второй год клубни инфицированных опытных образцов картофеля были высажены
на инфекционный фон в полевых условиях. Инфекционный фон создавался чередованием
делянок опытных трансгенных образцов с делянками, на которых были высажены растения картофеля с симптомами поражения вируса Y картофеля - полевые инфекторы YBК.
В двух пространственно изолированных полевых питомниках (II и I) были высажены
клубни чистых и слабозараженных растений (согласно результатам иммуноферментного
анализа - ИФА). Растения питомника I на стадии 3-4 настоящих листьев были инфицированы штаммом YN описанным выше способом. Заражение 2-го года может быть не ограничено одним конкретным штаммом вируса, возможно использование смеси штаммов. В
качестве отрицательного контроля было высажено вегетативное потомство питомника неинфицированных растений. На второй год было 3 питомника: питомник неинфицированных растений - клубни отрицательных контролей, высаженные на естественном фоне;
растения питомника I - двухгодично инфицированные линии опытных образцов; растения
питомника II - одногодично инфицированные линии опытных образцов.
Таким образом, в отличие от прототипа было обеспечено создание жесткого инфекционного давления (двухгодичное искусственное инфицирование вирусом, высадка растений с тяжелыми симптомами поражения вирусом на полевом участке со второго года
оценки), которое позволило ускорить накопление вируса у восприимчивых образцов и исключить их из эксперимента.
По результатам второго года испытаний был проведен отбор здоровых и слабоинфицированных клонов в зараженных линиях трансгенных образцов, которые были высажены
в полевые условия третьего года, где также был создан инфекционный фон.
При длительном репродуцировании от каждого инфицированного растения одногодично и двухгодично зараженных линий высаживали по 3 клубня семенной фракции
(клоны в линиях). Потомство каждой инфицированной линии прослеживали индивидуально. Данный прием приводил к ежегодному увеличению совокупности растений тестируемого образца.
Накопление YBК в растениях инфицированных линий ежегодно тестировали методом
иммуноферментного анализа (ИФА) на стадии бутонизации-цветения. ИФА проводили в
строгом соответствии с протоколом производителя набора для проведения анализа. Оптическую плотность продуктов ферментативной реакции измеряли на ридлере "Multiscan MS"
при длине волны, соответствующей поглощению конкретных продуктов ферментативной
реакции (в зависимости от используемого рабочего фермента и добавления стоп-реагента).
Для достоверного разграничения фоновых значений абсорбции и положительных результатов, унификации и сопоставления данных, полученных с помощью разных наборов
для проведения теста ИФА, высчитывали порог достоверности положительных результатов (Р) по формуле, предложенной в инструкции ВНИИКХ РАСХН, прилагаемой только к
наборам:
P=x+3E,
где х - среднее значение для отрицательного контроля (здоровый материал); 3Е - тройное
значение максимального положительного отклонения от среднего в отрицательном контроле.
Все значения выше Р считаются положительными результатами.
При расчете порога достоверности положительных результатов учитывали значение
оптического нуля. Для того чтобы избежать получения ошибочных данных сок каждого
исследуемого растения раскапывали на три лунки иммунологической планшеты, затем
вычисляли среднее по трем пробам. Чтобы исключить оптическое поглощение планшеты
и реактивов ИФА вычитали значение оптического нуля для планшеты, на которой был нанесен сок анализируемых образцов. Затем высчитывали среднее отклонение (СО) от поро5
BY 10495 C1 2008.04.30
га достоверности положительных результатов. Таким образом, формула расчета СО для
каждого конкретного растения была:
СО = (у1 + у2 + у3) / 3 - ОП - Pi,
где СО - среднее отклонение значения оптической плотности от порога достоверности положительных результатов;
y1, у2, у3 - значения оптического поглощения проб;
ОП - значение оптического нуля планшеты;
Pi - значение порога достоверности положительных результатов.
Отрицательные значения СО свидетельствовали об отсутствии в соке вируса в детектируемой для ИФА концентрации, положительные - о накоплении вируса в растении.
Сравнение эффективности одногодичного и двухгодичного заражения вирусом Y картофеля линий трансгенных образцов представлено в табл. 1. Линии а4у3 и а8у2 поражались
вирусом как при одногодичном, так и при двухгодичном инфицировании. Вегетативное
потомство 5-ти линий (а1у3, а5у2, а5у3, а8у4 и в3у5) было свободным от вируса после одногодичного заражения, однако растения достоверно накапливали YBК после двухгодичного инфицирования. Заражение вирусом линий в7у4, c1y1 и с12у2 в обоих случаях не
приводило к появлению пораженных растений в их вегетативном потомстве. Накопление
YBК при репродуцировании одногодично инфицированных линий исходного сорта Белорусский 3 (Бел3-1, -2, -3, табл. 1) наблюдали в разные годы экспериментов, но при двухгодичном заражении высокие значения экстинции (СО > 0,101) выявлены уже на втором
году.
Таблица 1
Сравнение эффективности одногодичного и двухгодичного заражения вирусом Y
картофеля линий трансгенных образцов и исходного сорта Белорусский 3
Значения среднего отклонения (СО), ед. оптической плотности
Линия
при одногодичном заражении
при двухгодичном заражении
1-й год
2-й год
3-й год
2-й год
3-й год
а1у3
0,004
-0,018
-0,021
0,017
0,046
а4у3
0,006
0,146
0,077
0,050
0,170
а5у2
0,020
-0,024
-0,015
0,021
0,126
а5у3
-0,002
-0,004
-0,009
0,022
0,070
а8у2
0,0
0,090
0,242
0,203
а8у4
-0,013
-0,021
0,024
0,187
в7у4
0,028
-0,010
-0,017
-0,013
-0,019
в3у5
0,013
-0,014
-0,020
-0,019
0,039
с1y1
0,017
-0,009
-0,022
-0,004
-0,017
с12у2
0,018
-0,009
-0,019
-0,014
-0,026
Бел3-1
0,130
0,015
0,231
0,267
Бел3-2
-0,018
0,136
0,096
0,105
Бел3-3
-0,015
-0,014
0,104
0,104 - курсором выделены достоверно положительные значения СО
В первый год после одногодичного заражения для 6-ти трансгенных линий (а1у3,
а5у2, в7у4, в3у5, c1y1, c12y2) характерны положительные значения СО (менее 0,05), однако их вегетативное потомство при дальнейшем репродуцировании после одногодичного
заражения было свободно от вируса. После двухгодичного заражения YBК количество
линий, вегетативное потомство которых не накапливало вирус, сократилось (табл. 1, в7у4,
c1y1 и с12у2).
6
BY 10495 C1 2008.04.30
При сопоставлении результатов визуальной диагностики и значений СО была составлена шкала для интерпретации экспериментальных данных:
1) СО < 0 - здоровые растения, симптомы отсутствуют;
2) 0 < СО < 0,05 - слабозараженные растения, симптомы отсутствуют либо не выражены;
3) 0,051 < СО < 0,1 - среднезараженные растения, слабые симптомы;
4) СО > 101 - сильнозараженные растения, четко выраженные симптомы, поражение
вирусом.
Таким образом, предлагаемый способ оценки трансгенного картофеля на устойчивость
к Y-вирусу, базирующийся (в отличие от прототипа и аналога) на двухгодичном заражении
вирусом, в том числе слабоинфицированных при одногодичном заражении линий и ежегодном увеличении совокупности растений тестируемого образца, имеет следующие преимущества:
1. Вовлечение в эксперимент на 2-м году оценки слабозараженных линий трансгенных
образцов позволило выявить линии и образцы с выздоравливающим фенотипом (в7у4,
c1y1, c12y2; табл. 1);
2. Двухгодичное заражение сократило период времени, необходимый для выявления
образцов, способных накапливать вирус до 2-х лет. Линии а1у3, а5у2, а5у3, а8у4 были
свободны от вируса (СО < 0,0) на 3-й год экспериментов после одногодичного инфицирования, несмотря на наличие инфекционного фона в поле, и были заражены вирусом, согласно данным ИФА, уже на первый год после двухгодичного инфицирования. На третий
год экспериментов трансгенные линии после двухгодичного заражения проявляли визуальные симптомы поражения вирусом. Для выявления линий, медленно накапливающих
вирус, после одногодичного инфицирования в основном требовалось 4-5 лет вегетативного размножения на инфекционном фоне в поле.
3. Ежегодное увеличение совокупности растений тестируемого образца позволило
оценить стабильность экспрессии целевого признака и отобрать трансгенные образцы, у
которых не наблюдали расщепления по признаку при вегетативном репродуцировании
(табл. 2).
Данные по отобранным в результате экспериментов 6-ти трансгенных образцов со стабильной экспрессией признака устойчивости к вирусу приведены в табл. 2 (в2, в7, c1, с3,
с4 и с12). Для сравнения в табл. 2 приведены данные для 3-х трансгенных образцов (а4,
а6, д5), у которых на третий год экспериментов доля растений с симптомами вирусной
инфекции была значительна и составила от 30 до 60 %.
На третий год полевые растения отобранных устойчивых к Y-вирусу образцов были
проанализированы в 2-х биологических тестах: испытание на индикаторных растениях,
испытание образцов методом прививок. Тест на индикаторных растениях обычно проводят для выявления латентной вирусной инфекции [1, 2]. Мы использовали этот тест для
выявления зрелых интактных частиц вируса в соке исследуемых образцов, так как в
трансгенных растениях, экспрессирующих белок оболочки вируса, присутствует вирусный белок, но отсутствует инфекционное начало (РНК вируса). В качестве растенийиндикаторов на Y-вирус картофеля использовали Nicotiana tabacum L. (сорт Самсун). Индикаторные растения (по пять на исследуемый образец) путем механической инокуляции
заражали соком полевых растений трансгенных образцов, причем каждому растению табака соответствовало конкретное полевое растение. Накопление вируса оценивали визуально и методом ИФА.
Индикаторные растения, инокулированные соком растений исходного сорта (Бел 3) и
накопителей YBК, имели симптомы системной инфекции (мозаика листьев верхушки) и
довольно высокую концентрацию YBК по результатам теста ИФА (табл. 3). Симптомов
вирусной инфекции на растениях-индикаторах, инокулированных соком растений трансгенных образцов, не выявлено, и согласно тесту ИФА они были здоровы (табл. 3).
7
BY 10495 C1 2008.04.30
Таблица 2
Распределение по оптической плотности растений 9-ти трансгенных образцов
картофеля с геном БО YBК при двухгодичном и исходного сорта (Бел3)
при одногодичном искусственном заражении YBК
Образец
Бел3
в2
в7
с1
с3
с4
с12
а4
а6
д5
год
1-й
2-й
3-й
1-й
2-й
3-й
1-й
2-й
3-й
1-й
2-й
3-й
1-й
2-й
3-й
1-й
2-й
3-й
1-й
2-й
3-й
1-й
2-й
3-й
1-й
2-й
3-й
1-й
2-й
3-й
СО < Р
63,2
25,0
48,7
40
100
88,8
0
33,3
100
0
100
100
33,3
100
100
0
50
100
0
100
100
80,0
0
0
33,3
0
0
75,0
33,3
33,3
Количество растений, %
Р < СО < 0,05
0,051 < СО < 0,1
26,3
7,9
68,8
0
18,9
2,7
60
0
0
0
11,2
0
100
0
66,7
0
0
0
66,7
33,3
0
0
0
0
33,3
33,3
0
0
0
0
100
0
50
0
0
0
100
0
0
0
0
0
20,0
0
66,7
33,3
50,0
12,5
66,7
0
0
100
0
40,0
0
0
66,7
0
16,7
16,7
СО > 0,101
2,6
6,2
29,7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
37,5
0
0
60,0
25,0
0
33,3
Примечание: искусственное заражение вирусом Y картофеля анализируемых трансгенных образцов проводили в 1-й и 2-й годы.
Следовательно, в соке растений инфицированных YBК трансгенных образцов, здоровых по результатам визуальной оценки и тесту ИФА, не содержится зрелых интактных
частиц вируса, способных заражать индикаторные растения табака сорта Самсун.
Прививку осуществляли техникой "в расщеп". Подвои: молодые растения томата (сорт
Невский), на стадии 3-4 пар настоящих листьев инфицированные вирусом. Для анализа
одного образца учитывали не менее 6 результативных прививок.
8
BY 10495 C1 2008.04.30
Таблица 3
Накопление вируса Y картофеля (согласно тесту ИФА) в растениях табака
сорта Самсун, инокулированных соком полевых растений опытных образцов
Опытные
варианты
контроль (-)
Накопитель YBК
Бел3
в2
в7
с1
с3
с4
с12
1
-0,027
1,565
0,861
-0,035
-0,034
-0,015
-0,009
-0,013
-0,015
Значения СО для индикаторных растений,
единицы оптической плотности
2
3
4
-0,025
-0,027
-0,028
1,507
1,011
1,100
0,536
0,865
-0,034
-0,039
-0,035
-0,038
-0,027
-0,027
-0,014
-0,014
-0,008
-0,009
-0,013
-0,010
-0,011
-0,006
-0,013
-0,013
-0,010
-0,008
5
-0,026
1,328
-0,029
-0,031
-0,009
-0,015
-0,009
-0,011
Примечание: контроль (-) - растения табака, инокулированные водопроводной водой,
накопитель YBК - растения табака, зараженные штаммами Y-виpyca картофеля; 0,536 - в
рамке достоверно положительные результаты ИФА.
В качестве подвоя для образцов c1, с3, с4 и с12 были использованы растения томата,
зараженные: 1) смесью штаммов YO + YN; 2) штаммом YNTN.
Для образцов в2, в7 использовали подвои, зараженные: 1) штаммом YN; 2) штаммом
YO. Для лучшей приживаемости прививок место прививки обматывали парафильмом и
затеняли на сутки. В прототипе и аналоге отмечается, что техника проведения прививок
довольно трудоемка, результативность метода напрямую зависит от условий внешней
среды, в частности от температуры и влажности. Для того чтобы предотвратить увядание
привоя место его соединения с подвоем фиксируют мочалом, а затем обматывают ватой,
которую постоянно смачивают до срастания. Применение парафильма в наших экспериментах обеспечивало надежную фиксацию прививки, предотвращало потерю влаги и пересыхание места соединения, а также не требовало в дальнейшем дополнительного
увлажнения. Через 30-35 суток были проведены визуальная оценка симптомов поражения
YBК привоев и определение накопления вируса в их соке методом ИФА.
Исходя из полученных данных (табл. 4), трансгенные образцы имели разные типы устойчивости к Y-вирусу картофеля и его штаммам. В случае заражения Y-вирусом сверхчувствительные образцы реагировали разными по интенсивности некротическими реакциями; чувствительные - системными, мозаичными симптомами; иммунные - не проявляли
симптомов поражения YBК.
Все трансгенные образцы (c1, с3, с4 и с12), привитые на подвои, зараженные штаммом
YNTN, были устойчивы к этому штамму. Привои образцов с3 и с4 проявили реакцию крайней сверхчувствительности к штамму YNTN. Об иммунности к штамму YNTN образца с12
свидетельствовали отсутствие симптомов вирусной инфекции на привоях и отрицательные значения СО по результатам ИФА. На привоях образца c1 наблюдали либо хлороз,
либо некротическую реакцию на заражение вирусом.
В случае прививок трансгенных образцов на растения томата, инфицированные смесью
штаммов YO + YN, наблюдали разные типы реакций у трансгенных привоев. Трансгенный
образец c1 был чувствителен с наибольшей вероятностью к штамму YO, так как отмечены
симптомы, характерные для этого штамма, - морщинистая мозаика; о чувствительности
трансгенного образца c1 свидетельствуют достоверно положительные значения экстинции
(табл. 4).
9
BY 10495 C1 2008.04.30
Таблица 4
Результаты визуальной оценки (30-35 сутки) и иммуноферментного анализа (ИФА)
при испытании трансгенных образцов методом прививок
образец
Подвой
инфицирующие наблюдаемые
штаммы вируса
симптомы
YO
в2
YN
в7
YO
YN
MM
БЛП,
MM
БЛП,
MM
MM
Привой
наблюдаемые
данные ИФА*
симптомы
а) хлороз привоя
от -0,032 до 0,007
б) полный некроз
а) некроз краев листа
от -0,018 до -0,029
б) некроз верхушки
без симптомов
от -0,035 до -0,027
без симптомов
от -0,026 до -0,009
а)
некротические
пятна
YO + YN
MM
от 0,063 до 0,107
б) морщинистая мозаика
с1
а) некротические пятна
YNTN
MM
от -0,012 до -0,009
б) хлороз привоя
а) без симптомов
YO + YN
MM
от -0,012 до -0,010
с3
б) точечные некрозы
YNTN
MM
полный некроз привоев
YO + YN
MM
полный некроз привоев
с4
NTN
Y
MM
полный некроз привоев
O
N
Y +Y
MM
без симптомов
от -0,013 до -0,008
с12
YNTN
MM
без симптомов
от -0,015 до -0,009
*- представлены значения CO в единицах оптической плотности, MM - морщинистая
мозаика, БЛП - бугристость листовой пластинки; 0,063 - в рамке достоверно положительные значения экстинции.
Отрицательные значения СО и данные визуальной оценки свидетельствуют о реакции
сверхчувствительности образца с3 на заражение смесью штаммов YO + YN. Полный некроз прижившихся привоев образца с4 позволяет предположить крайнюю сверхчувствительность у этого трансгенного образца. Привои образца с12 были здоровы по
результатам визуальной оценки и теста ИФА.
Образец в2 имел некротическую реакцию на заражение штаммами YO и YN, свидетельствующую о сверхчувствительности. Для образца в7 характерно отсутствие симптомов
и отрицательные значения ИФА, что позволило сделать вывод об иммунности в7 к YBК.
Таким образом, суммируя данные трех биологических тестов (инфицирование опытных образцов путем механической инокуляции, тестирование на индикаторных растениях,
заражение методом прививок) можно сделать вывод об иммунности к Y-вирусу картофеля
двух трансгенных образцов в7 и с12. Образцы в2, с3, с4, по-видимому, обладают устойчивостью по типу сверхчувствительности, a c1 - полевой устойчивостью к вирусу. Определение типа устойчивости к Y-вирусу картофеля: иммунитет (полная невосприимчивость),
сверхчувствительность, полевая (относительная) устойчивость [3, 4] - проведено за 3 года
оценки. Предлагаемый способ оценки с четкой последовательностью приемов, проводимых в течение 3-х лет, в равной степени пригоден как для оценки исходных образцов с
определением типа устойчивости, так и их полового потомства.
10
BY 10495 C1 2008.04.30
Источники информации:
1. Блоцкая Ж.В. Вирусные болезни картофеля. - Минск: Навука i тэхнiка, 1993. С. 150-164.
2. Методические указания по определению иммунности и сверхчувствительности селекционного материала картофеля к вирусам X и Y и полевой устойчивости к вирусным
болезням. - Москва, 1980. - 24 с. (ВАСХНИЛ, отделение растениеводства и селекции,
НИИКХ / Москва) - прототип.
3. Методика испытания картофеля на устойчивость к вирусным болезням / ВАСХНИЛ,
НИИКХ. - М., 1971. - С. 4-9.
4. Методические указания по созданию и оценке селекционного материала картофеля
на устойчивость к штаммам вирусов / ВАСХНИЛ, БелНИИЗР. - М., 1983. - С. 4.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
11
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
167 Кб
Теги
by10495, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа