close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10512

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.04.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 10512
(13) C1
(19)
G 01N 33/50
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
24R-МЕТИЛБРАССИНОСТЕРОИДОВ И СОСТАВ
ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
(21) Номер заявки: a 20050844
(22) 2005.08.26
(43) 2007.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Хрипач Владимир Александрович; Свиридов Олег Васильевич;
Литвиновская Раиса Павловна;
Прядко Андрей Георгиевич; Драч
Светлана Васильевна; Матвеенцев
Виталий Демидович; Михайлопуло
Константин Игоревич; Жабинский
Владимир Николаевич; Завадская
Маргарита Ивановна; Новик Татьяна Валентиновна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) HORGEN P.A. et al // Can.J.Biochem.
Cell Biol. - 1984. - V. 62. - P. 715-721.
YOKOTA T. et al. J. // Plant Growth
Regul. - 1990. - V. 9. - P. 151-159.
Теория и практика иммуноферментного анализа. - Москва: Высшая школа,
1991. - С. 68-72, 176-267.
(57)
1. Способ количественного определения 24R-метилбрассиностероидов формулы I:
BY 10512 C1 2008.04.30
OH
HO
,
(I)
HO
HO
Z
где Z означает CO или C(O)O,
путем иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что анализируемый образец
смешивают с конъюгатом 24-эпикастастерон-пероксидаза хрена в полимерной лунке с
иммобилизованными поликлональными антителами к 24-эпикастастерону, инкубируют,
разделяют свободную и связанную антителами формы брассиностероидов, добавляют к
связанной форме хромоген-субстратную смесь, измеряют оптическую плотность полученного раствора и рассчитывают количество 24R-метилбрассиностероидов.
BY 10512 C1 2008.04.30
2. Состав для количественного определения 24R-метилбрассиностероидов способом
по п. 1, включающий
антитела к 24-эпикастастерону, иммобилизованные на полимерной лунке;
конъюгат 24-эпикастастерон-пероксидаза хрена;
буферный раствор для разведения конъюгата;
промывочный буферный раствор;
хромоген-субстратную смесь - раствор 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина в субстратном
буфере с перекисью водорода;
стоп-реагент - 4,8 %-ный раствор H2SO4.
Изобретение относится к области иммунохимического анализа, а именно количественному определению 24R-метилбрассиностероидов, и предназначено для контроля выпуска действующего вещества и измерения его концентрации в агропрепаратах на основе
24-эпибрассинолида и 24-эпикастастерона (например ЭПИН), а также может быть использовано для оценки качества сельскохозяйственной продукции, полученной с их применением, определения остаточных количеств в почве, сточных водах и т.п.
Применение иммунохимического анализа для количественного определения брассиностероидов с использованием антител описано в ряде работ. Так, для радиоиммунного
анализа были получены антитела к кастастерону, на базе которых удалось создать систему
для анализа брассинолида и кастастерона [1], однако из-за сложности работы с радиоактивными изотопами и необходимости комбинирования с инструментальными методами
разработка не получила развития. Кроме того, полученная система имела низкую специфичность: показатели перекресных реакций с другими брассиностероидами составляли
20-50 %.
Аналогом заявляемого способа по назначению является единственный описанный в
литературе подход, в котором моноклональные антитела, полученные к 24-эпибрассинолиду, были использованы для распознавания различных стероидов, включая антиген
(прототип) [2]. Для проведения анализа брассиностероид растворяли в смеси метанолхлороформ и наносили на стенки полистирольной аналитической кюветы путем испарения растворителя. Дальнейший анализ проводили с использованием вторичных поликлональных антител кролика к моноклональным мышиным антителам, вступившим во
взаимодействие со стероидом, и конъюгата протеин А-пероксидаза хрена, позволяющего
осуществить анализ фермента, вступившего во взаимодействие с кроличьими антителами.
Оказалось, что описанный способ не обеспечивает селективного определения брассиностероида (24-эпибрассинолида) даже в сопоставлении со стероидами отдаленных структурных типов. В частности, экдизон и β-ситостерин обнаружили 50 %-ную перекрестную
реакцию.
Целью настоящего изобретения является способ количественного определения 24Rметилбрассиностероидов путем иммуноферментного анализа, повышающий специфичность и чувствительность и отличается экологической безопасностью, простотой, надежностью и технологичностью.
Поставленная цель достигается предлагаемым способом, заключающимся в смешивании анализируемого образца брассиностероида с конъюгатом 24-эпикастастерон-пероксидаза хрена в полимерной лунке с иммобилизованными поликлональными антителами к
24-эпикастастерону, последующей инкубации, разделении свободной и связанной антителами форм брассиностероидов, добавлении к связанной форме хромоген-субстратной
смеси, определении оптической плотности полученного раствора и расчете количества
определяемого 24R-метилбрассиностероида.
Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.
2
BY 10512 C1 2008.04.30
Пример 1
В полистирольные лунки вносят по 0,05 мл калибровочных проб и анализируемых образцов в дубликатах. Вносят во все лунки по 0,1 мл раствора конъюгата 24эпикастастерон-пероксидаза. Инкубируют лунки 2 часа при 37 °С. Промывают лунки 4
раза промывочным раствором, добавляя во все лунки по 0,15 мл. Во все промытые лунки
добавляют по 0,15 мл хромоген-субстратного буфера и инкубируют при 37 °С в течение
15 минут. Останавливают реакцию добавлением во все лунки по 0,05 мл раствора стопреагента. Измеряют на спектрофотометре оптическую плотность раствора во всех лунках
при 450 нм. Результаты анализа рассчитывают методом интерполяции по калибровочной
кривой [3].
Рассчитывают величину В/В0 100 % для каждой калибровочной и исследуемой пробы,
где В - среднее значение оптической плотности раствора в лунках, содержащих калибровочные и исследуемые образцы; В0 - среднее значение оптической плотности в лунках,
содержащих калибровочную пробу "0 нмоль/л".
В координатах "logit-log" строят для калибровочных проб график зависимости
В/В0⋅100 % от концентрации эпикастастерона в калибровочных пробах (нмоль/л). По калибровочному графику определяют содержание брассиностероида в исследуемых образцах.
Заявляемый способ является экологически безопасным, простым, надежным и технологичным. Применение заявляемого способа обеспечивает быстрое и прямое (без многоступенчатых стадий выделения, подготовки образца и/или его модификации) определение
24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида. Кроме того, способ отличается высокой надежностью и чувствительностью, достаточной для обнаружения 24-эпикастастерона и 24эпибрассинолида (в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л), которой другими методами добиться
не удалось.
Другой задачей изобретения является состав для количественного определения 24Rметилбрассиностероидов указанным иммуноферментным анализом.
Аналоги заявляемому составу неизвестны.
Состав для количественного определения 24R-метилбрассиностероидов включает:
антитела к 24-эпикастастерону, иммобилизованные на полимерной лунке;
конъюгата 24-эпикастастерон-пероксидазой хрена;
буферный раствор для разведения конъюгата;
промывочный буферный;
хромоген-субстратная смесь - раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в субстратном
буфере с перекисью водорода.
стоп-реагент - 4,8 % раствор H2SO4.
Возможность осуществления количественного определения 24R-метилбрассиностероидов (24-эпибрассинолида и 24-эпикастастерона) с помощью заявляемого состава по
описанному выше способу подтверждается примерами конкретного исполнения.
Пример 2
Стадия 1. Получение конъюгата 24-эпикастастерон-БСА
Растворяют 0,11 г (0,21 ммоль) {[(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил5α-холест-6-илиденамино]окси}уксусной кислоты и 0,019 г (0,165 ммоль) N-оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана, охлаждают до 5 °С и при перемешивании добавляют раствор 0,029 г (0,14 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного
диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 °С и 20 часов при комнатной
температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают,
фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным Na2SO4, упаривают. Выход N-сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон-NOS
0,105 г (92 %). Растворяют 72 мг (101,55 мкмоль) N-оксисукцинимидного эфира 6-Окарбоксиметоксиламиноксима 24-эпикастастерона в 7 мл диоксана и добавляют 0,1 г
3
BY 10512 C1 2008.04.30
(1,4 мкмоль) БСА в 7 мл 0,1 М раствора бикарбоната натрия (рН 8,3). Перемешивают в
течение 20 часов при комнатной температуре.
Реакционную смесь подвергают диализу при 20 °С против дистиллированной воды в
течение 36 часов, затем против 1 % суспензии активированного угля в воде 20 часов, лиофилизуют и замораживают при температуре -20 °С.
Стадия 2. Получение конъюгата 24-эпикастастерон-пероксидаза хрена
Растворяют 0,11 г (0,21 ммоль) {[(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил5α-холест-6-илиденамино]окси}уксусной кислоты и 0,019 г (0,165 ммоль) N-оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана, охлаждают до 5 °С и при перемешивании добавляют раствор 0,029 г (0,14 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного
диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 °С и 20 часов при комнатной
температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают,
фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным Na2SO4, упаривают. Выход N-сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон-NOS
0,105 г (92 %).
К раствору 6 мг пероксидазы хрена в 600 мл диcт. воды в присутствии 2-3 капель 0,1М
раствора гидрокарбоната натрия (рН 8,35) добавляют раствор 2 мг (0,003 ммоль) Nсукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон-NOS, перемешивают при комнатной
температуре в течение 1,5 ч. Очищают на колонке с сефадексом, элюент - дист. вода. Собирают окрашенную фракцию (желто-коричневая), затем разбавляют глицерином (1:2) и
хранят в морозильнике (при -18 °С).
Стадия 3. Получение антисыворотки к 24-эпикастастерону
Группу из десяти кроликов иммунизируют конъюгатом 24-эпикастастерон-БСА с
плотностью посадки 25 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят
подкожно в 4-5 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл
фосфатно-буферного раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном
объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляют 3 недели.
Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб
крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие
связывающей способности в отношении 24-эпикастастерона и определяют их титры и
значения констант ассоциации (Ка). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,50,2 ОЕ.
Таблица 1
Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных
конъюгатом 24-эпикастастерона с БСА
Антисыворотка
Титр
Ка×109М-1
А1
1,5
1:10000
А2
1,9
1:20000
Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало,
что ее разбавление в 20000 раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения
24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида. Таким образом, система обладает чувствительностью, достаточной для обнаружения 24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида в
концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 20-50 пг в 50 мкл образца.
Аналитические характеристики заявляемого состава для количественного иммунохимического определения 24R-метилбрассиностероидов.
1. Специфичность. Перекрестная реакция антител к эпикастастерону с другими стероидами приведена в табл. 2.
4
BY 10512 C1 2008.04.30
Таблица 2
Кросс-реактивность антисыворотки А2 с различными стероидами
Стероид
Связывание по отношению к ЭК (%)
1. Эпикастастерон
100
2. Эпибрассинолид
80,0-100,0
3. Гомокастастерон
15,0
4. 22S23S-эпикастастерон
7,2
5. 22S23S-эпибрассинолид
6,4
6. Кастастерон
3,0
7. Брассинолид
0,45
8. Гомобрассинолид
0,37
9. Экдистерон
0,3
10. (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмаст-2-ен-6-он
0,05
11. 22S,23S-гомокастастерон
0,04
12. Стигмастерин
<0,01
13. 24-эпиэргост-2-ен-6-он
<0,01
<0,01
14. 2α,3α-дигидроксиэргост-6-он
15. Кампастерин
<0,01
16. Эргостерин
<0,01
<0,01
17. (22R,23R)-22,23-дигидрокси-3α,5-цикло-5α-стигмаст-6-он
<0,01
18. (22S,23S)-22,23-дигидрокси-3α,5-цикло-5α-стигмаст-6-он
19. Холестерин
<0,01
20. Прегненолон
<0,01
21. Андростенолон
<0,01
Из таблицы видно, что заявляемый состав позволяет определять 24R-метилбрассиностероиды (24-эпибрассинолид и 24-эпикастастерон) с высокой степенью специфичности.
2. Коэффициент вариации результатов 10 определений эпибрассиностероидов в одном
и том же образце с использованием заявляемого способа и состава для его осуществления
не превышает 10 %.
3. Тест на "линейность". Зависимость концентрации 24-эпибрассиностероидов в исследуемых образцах: при разведении их раствором, не содержащим 24-эпикастастерона
или 24-эпибрассинолида, имеет линейный характер.
4. Тест на "открытие". При постановке теста процент открытия составил 90-110 %.
5. Чувствительность. Состав позволяет обнаружить 24R-метилбрассиностероиды в
концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 20-50 пг в 50 мкл образца.
Важным является тот факт, что брассиностероиды широко распространены в природе,
они свойственны всем или абсолютному большинству растительных видов - содержание в
растении около 10-6-10-9 % [4]. Брассиностероиды регулируют рост и развитие растений.
Обработка растений брассиностероидами на соответствующей стадии развития приводит
к увеличению урожая и, в ряде случаев, к улучшению его качества. Замечательно, что эффект достигается при обработке растений в концентрации 5-20 мг на гектар посевов, что
намного меньше, чем в случае традиционно применяемых средств повышения урожайности растений. На основе одного из брассиностероидов - 24-эпибрассинолида создан препарат ЭПИН, применяемый как регулятор роста и средство повышения урожайности
сельскохозяйственных культур [5]. Все это требует разработки эффективных и высокочувствительных методов определения брассиностероидов.
Применение заявляемого способа и состава для его осуществления позволит осуществлять иммуноферментное определение одного из самых перспективных с практической
5
BY 10512 C1 2008.04.30
точки зрения брассиностероидов - 24-эпибрассинолида (действующего вещества агропрепарата ЭПИН) и его химического и биохимического предшественника 24-эпикастастерона
в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 20-50 пг в 50 мкл образца.
Источники информации:
1. Yokota Т., Wanabe S., Ogino Y., Yamaguchi I., Takahashi N. // J. Plant Growth Regul. 1990. - Vol. 9. - P.151.
2. Horgen P.A., Nakagawa C.H., Irvin. R.T. Production of monoclonal antibodies to a steroid plant grouth regulator // Can. J. Biochem. Cell Biol.- 1984. - Vol. 62. - P. 715-721 (прототип).
3. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. шк., 1991.
4. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск: Навука i
тэхнiка, 1993. - 288 с.
5. Средства защиты и регуляторы роста растений: Справочник. - Минск, 1995. - С.75.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
107 Кб
Теги
by10512, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа