close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10670

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 10670
(13) C1
(19)
(46) 2008.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
C 12N 1/14
C 12P 19/00
(54) ШТАММ ГРИБА INONOTUS OBLIQUUS БИМ F-350 Д - ПРОДУЦЕНТ
МЕЛАНИНА, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИМУТАГЕННЫМИ
СВОЙСТВАМИ
(21) Номер заявки: a 20060292
(22) 2006.04.03
(43) 2007.12.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт микробиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Бабицкая Валентина Григорьевна; Щерба Виктор Васильевич; Иконникова Наталья Валерьевна; Пучкова Татьяна Антоновна;
Филимонова Татьяна Васильевна
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) BY 5057 C1, 2003.
Бабицкая В.Г. и др. Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36. № 4. - С. 439-444.
Щерба В.В. и др. Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36. № 5. - С. 569-574.
BY 10670 C1 2008.06.30
(57)
Штамм гриба Inonotus obliquus БИМ F-350 Д - продуцент меланина, обладающий антимутагенными свойствами.
Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения медицинских препаратов, в косметической промышленности для изготовления кремов, лосьонов, тоников, в пищевой промышленности
для разработки биологически активных добавок и касается нового штамма - продуцента
меланина.
Известен целый ряд культур микроорганизмов, синтезирующих меланиновый пигмент
в небольших количествах, - Microsporum ganis, Trichophyton rubrum [Малама А.А. и Касперович Т.В. Изучение пигментов грибов Microsporum ganis и Trichophyton rubrum // Микология и фитопатология. - Т. 10. - Ленинград, 1976. - С. 422], Pullularia prototropha, Asotobacter chroococcum [Малама А.А., Тернов В.И., Храменко Г.Б., Данильчик Н.И. Влияние
меланиновых пигментов, образуемых микроорганизмами, на резистентность мышей к
рентгеновскому облучению // Радиобиология. - Т. 12. - М.: 1972. - С. 289]. Для промышленного производства культуры интереса не представляют.
Известен меланинобразующий штамм гриба Cladosporium cladosporides-396 [1], предложенный авторами для связывания тяжелых металлов при очистке сточных вод. Штамм
не находит практического применения, так как имеет невысокую меланинобразующую
способность [1].
BY 10670 C1 2008.06.30
Известно использование гриба Inonotus obliquus для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний [2, 3].
Известно биостимулирующее средство, одним из компонентов которого является березовый гриб (чага, Inonotus obliquus) [4].
Известен состав, обладающий противоопухолевым, гепатопротекторным и иммуностимулирующим действием, в котором чага используется в качестве добавки к листовому
или гранулированному чаю [5].
Однако во всех этих способах используются плодовые тела чаги, произрастающие на
деревьях, а не чистая культура, выращенная в стерильных глубинных условиях. Плодовые
тела не являются продуцентами меланинов.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является
штамм гриба Aspergillus niger БМП-97/2, предложенный авторами для производства меланина [6].
Гриб является факультативным анаэробом, растет в интервале температур от 18 до
40 °С. Оптимальная температура для роста культуры - 28 °С, биосинтеза меланиа - 37 °С.
Оптимальный рН - 6,5 ± 0,5. Синтезирует меланин внутри клеток и внеклеточно.
В качестве источника углерода гриб использует большинство сахаров (глюкоза, сахароза, мальтоза, арабиноза), не усваивает этиловый спирт. Коагулирует и пептонизирует
молоко, разжижает желатину. Обладает протеазной и оксидазной активностью. Гриб выращивают на косяках (сусло-агар) 14 сут., суспензию спор получают 14 сут. Ферментацию
культуры ведут в анаэробных условиях при температуре 37 ± 1 °С в течение 20 сут. Получают 12 г меланина технического, после растворения которого в 40 % растворе едкого натра, нейтрализации и сушки получают 8 г субстанции меланина.
Данный штамм взят за прототип. Однако штамм имеет ряд недостатков:
длительный процесс получения посевного спорового материала гриба (два пересева по
14 сут.) - всего 28 сут.;
длительная ферментация культуры гриба (20 сут.);
анаэробные условия культивирования, что усложняет технологичность процесса выращивания культуры;
синтез меланина при высокой температуре - 37 ± 1 °С;
использование спорообразующей культуры, что загрязняет окружающую среду и может вызвать аллергию у работающих.
Задачей изобретения является получение нового штамма, более технологичного и продуктивного, способного расти при более низких температурах (ниже 37 °С), образовывать
меланинсодержащую субстанцию в более короткие сроки, а также обладающего новыми
для данного вида и рода гриба свойствами.
Предлагаемый штамм Inonotus obliquus БИМ F-350 Д выделен в виде тканевых изолятов плодовых тел, произрастающих в Минской области, Пуховичском районе, получен
путем естественной селекции и депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов
ГНУ "Институт микробиологии НАН Беларуси", коллекция мицелиальных грибов под регистрационным номером БИМ F-350 Д. Культура также поддерживается в коллекции мицелиальных грибов лаборатории экспериментальной микологии ГНУ "Институт микробиологии НАН Беларуси".
Штамм хранится при 4-6 °С на сусло-агаре.
Культурально-морфологические свойства. Штамм I. obliquus БИМ F-350 Д является
аэробом, способен расти в интервале температур 18-30 °С, оптимальная температура для
роста 24-25 °С, синтеза меланиновых пигментов - 25-27 °С. Оптимальные значения
рН 6,0-7,0. Характеризуется синтезом экзо- и эндомеланинов.
При культивировании на чашках Петри с сусло-агаром при температуре 24-25 °С колонии слаборадиальные, мицелий войлочный, густой, пушистый, светло-желтой окраски
(у молодых культур - белого цвета), по мере старения приобретает охристую, затем ржа2
BY 10670 C1 2008.06.30
во-коричневую окраску. Реверзум темнопигментированный по всей поверхности. Колонии медленнорастущие, скорость роста - 2-2,3 мм/сут. Полное зарастание чашки наблюдается к 20-23 сут. Генеративные гифы септированные, тонкостенные, гиалиновые до
желтоватых, ветвящиеся, переходящие в толстостенные, ржаво-бурые, параллельно расположенные гифы.
Физиолого-биохимическая характеристика. Культура активно усваивает в качестве
источника углерода моносахариды (глюкоза, галактоза, ксилоза, фруктоза, арабиноза), дисахариды (сахароза, мальтоза, целлобиоза, лактоза), полисахариды (крахмал), полиолы
(манит, сорбит).
В качестве источников азота используют неорганические ((NH4)2SO4, NH4NO3, NH4Cl,
(NH4)2HPO4, NH4H2PO4, NaNO3, KNO3) и органические (пептон, кукурузный экстракт) соединения.
Штамм не является зоо- и фитопатогенным. Токсикологические исследования штамма
проводились на лабораторных животных. При изучении острой пероральной токсичности
сухого глубинного мицелия гриба I. obliquus БИМ F-350 Д установлено, что мицелий в
максимальной дозе для крыс 3,75, для мышей - 10,0 г/кг практически нетоксичен (ЛД50
определить не удалось). Образец глубинного мицелия гриба I. obliquus БИМ F-350 Д не
обладает кожно-раздражающим действием. Изучение мицелия гриба I. obliquus БИМ
F-350 Д в хроническом эксперименте при ежедневном пероральном введении в течение
30 сут. сухого мицелия в дозе 100 мг/кг не выявило каких-либо существенных функциональных и структурных нарушений со стороны жизненно важных систем организма животных. Таким образом, глубинный мицелий базидиального гриба I. obliquus БИМ F-350 Д
(чага) является безвредным для организма.
На модели ДНК фага λ установлено предотвращение меланинсодержащей субстанцией I. obliquus БИМ F-350 Д повреждений ДНК фага λ продуктами пероксидазного окисления дианизидина.
Исследования антимутагенной активности меланинсодержащей субстанции на самцах
мышей линии "Af" показало, что внутрибрюшинное введение ее в дозе 50 мг/кг веса животного снижает уровень радиоиндуцированных транслокаций в сперматоцитах в 2 раза,
что свидетельствует о высоких антиоксидантных и генопротекторных свойствах меланинсодержащей субстанции гриба I. obliquus БИМ F-350 Д.
Сведения, подтверждающие образование меланинсодержащей субстанции штаммом I.
obliquus БИМ F-350 Д на различных питательных средах.
Пример 1.
Культуру гриба I. obliquus БИМ F-350 Д выращивают на скошенном сусло-агаре при
23-25 °С в течение 7-10 сут., затем переносят стерильной лопаткой или шпателем в качалочные колбы (1 косяк в 1 колбу) вместимостью 0,7 л со 150 мл стерильной среды - пивное
неохмеленное сусло 5 °Б, рН 6,0-7,0. Штамм культивируют на качалке (160-180 об/мин)
при 25-27 °С в течение 7-8 сут., полученный посевной материал используют для засева
посевной среды следующего состава (г/л):
глюкоза
30
KН2РО4
1,0
K2НРО4
1,0
MgSO4
0,25
(NH4)SO4
1,4
пептон
3,0
CuSO4 * 5H2O
0,08
кукурузный экстракт
2,0 мл
вода дистиллированная
до 1,0 л.
Культивирование ведут в колбах на качалке 8-10 сут. или в ферментере (5-6 сут.),
аэрация - 0,325 г О2/л⋅ч, начальный рН среды - 6,0-7,0, количество посевного материала 15 %.
3
BY 10670 C1 2008.06.30
Получают 10-11 г/л меланинсодержащей биомассы, которую экстрагируют 40 % раствором едкого натра. После хроматографической очистки и сушки получают 6 г/л субстанции меланина. Выход меланина из культуральной жидкости (осаждение ведут соляной кислотой до рН - 1,0) - 1,0 г/л. Общий выход субстанции меланина - 7,0 г/л.
Пример 2.
Выращивание гриба и получение меланинсодержащей биомассы осуществляется аналогично изложенному в примере 1. В качестве питательной среды используется следующая (г/л):
глюкоза
KН2РО4
K2НРО4
MgSO4
(NH4)2SO4
пептон
CuSO4 * 5H2O
тирозин
кукурузный экстракт
вода дистиллированная
30
1,0
1,0
0,25
1,4
3,0
0,08
0,2
2,0 мл
до 1,0 л.
Выход меланинсодержащей биомассы - 12 г/л. Выход меланинсодержащей субстанции - 7,2 г/л. Выход меланина из культуральной жидкости - 1,3 г/л. Общий выход субстанции меланина - 8,5 г/л.
Пример 3.
Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примерах 1, 2. В среду вносится тиамин в количестве 300 мкг/л.
Состав питательной среды (г/л):
глюкоза
30
KН2РО4
1,0
K2НРО4
1,0
MgSO4
0,25
(NH4)2SO4
1,4
пептон
3,0
CuSO4 * 5H2O
0,08
тирозин
0,2
тиамин
300 мкг
кукурузный экстракт
2,0 мл
вода дистиллированная
до 1,0 л.
Выход меланинсодержащей биомассы - 12,5 г/л. Выход меланинсодержащей субстанции - 7,5 г/л. Выход меланина из культуральной жидкости - 1,4 г/л. Общий выход субстанции меланина - 8,9 г/л.
Меланин I. obliquus БИМ F-350 Д - пигмент полифенольной природы. Порошок от
темно-коричневого до черного цвета. Умеренно растворим в воде, хорошо - в щелочах.
Содержит 38,2 % углерода, 50,5 % кислорода, 5,5 % водорода, 5,8 % азота, алифатические
(- ОН), фенольные, карбонильные и карбоксильные группы. Молекулярная масса находится в пределах 52-60 кDа, содержится незначительное количество пигмента с молекулярной массой 100-120 кDa.
Таким образом, предлагаемый новый штамм имеет более высокую физиологическую
активность, характеризуется высоким выходом меланинсодержащей субстанции (табл. 1).
4
BY 10670 C1 2008.06.30
Таблица 1
Предлагаемый новый штамм
Прототип
Длительность получения субстанции меланина. Весь цикл выращивания гриба - 24-30 сут.:
Весь цикл выращивания гриба - 48 сут.:
8-10 сут. - выращивание на косяках, 8-10 сут. 14 сут. - выращивание на косяках, 14 сут. ферментация в колбах - получение инокулюма,
на плотных средах, 20 сут. - в колбах.
8-10 сут. культивирования - получение
субстанции.
Температура культивирования - 25 °С.
37 °С.
Общий выход субстанции меланина
8,0 г/л
8,5-8,9 г/л.
Существенно и то, что новый штамм является высшим базидиомицетом, вегетативный
мицелий не образует спор, что очень важно с экологической точки зрения. Aspergillus niger - спорообразующая культура. Поскольку основой субстанции является поверхностный
мицелий + споры, велика опасность спор для здоровья человека (аспергиллезы).
У предлагаемого штамма обнаружены новые свойства: генопротекторная, антимутагенная и фагоцитарная (иммуностимулирующая) активности, сорбционная способность.
С целью изучения генопротекторных свойств меланинсодержащей субстанции
I. obliquus БИМ F-350 Д исследовалось влияние ее на процесс повреждения ДНК фага λ
продуцентами пероксидазного окисления дианизидина (ДА). При концентрации ДА 3·10-5 М
наблюдается 100 % повреждение ДНК. При концентрации в реакционной смеси меланинсодержащей субстанции 6,0 мкг/мл число перекрестных сшивок ДНК-ДНК уменьшалось в
2 раза. В концентрации 20 мкг/мл субстанция полностью предотвращала этот процесс.
Антимутагенная активность субстанции меланина проверена на мышах. Внутрибрюшинное введение субстанции в дозе 50 мг/кг снижает уровень радиоиндуцированных
транслокаций в сперматоцитах в 2 раза (табл. 2).
Таблица 2
Антимутагенная активность субстанции меланина
Количество
% реципрок- t уровень
Вариант
ных транс- значимометафазных реципрокных
семенников
локаций
сти
клеток
транслокаций
Интактные мыши
8
1027
1
0,09
Облученные дозой
8
665
21
3,15 ± 0,58
4 Гр
4 Гр + технический меланин
8
516
10
1,93 ± 1,32
5,57
I. obliquus БИМ
F-350 Д
В опытах in vitro меланинсодержащая субстанция, полученная из глубинного мицелия
гриба, стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов по отношению к Staphylococcus aureus в концентрации 100 мкг/мл.
Субстанция меланина характеризуется высокими сорбирующими свойствами по отношению к ионам тяжелых металлов.
Сорбционная емкость, мг/г:
Рb2 + (свинец)
2,8
2+
Сu (медь)
2,9
Zn2 + (цинк)
1,8
Ni2 + (никель)
1,6.
5
BY 10670 C1 2008.06.30
Полученные результаты свидетельствуют о высоком биологическом действии: антимутагенных, генопротекторных и сорбционных свойствах меланина гриба I. obliquus БИМ
F-350 Д в условиях in vivo и in vitro. Эти свойства субстанции меланина могут быть использованы при создании антиканцерогенных и иммуностимулирующих препаратов.
Источники информации:
1. А.с. СССР 1063834 А, МПК С 12N 15/00; С 02F 3/34; С 12R 1/645, 1983.
2. Патент RU 93028693, МПК А 61K 35/78, 1995.
3. Патент RU 20767282, МПК А 61K 35/78, 1997.
4. Патент RU 97118466, МПК А 61K 35/78, 1999.
5. Патент RU 2002130119, МПК А 61K 35/78, 2004.
6. Патент BY 5057 С1, МПК С 12N 1/14, 1999.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
104 Кб
Теги
by10670, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа