close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10709

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07K 5/00
A 61K 38/07
ПЕПТИДНЫЙ ИНГИБИТОР ЭЛАСТАЗЫ
(21) Номер заявки: a 20051031
(22) 2005.10.27
(43) 2007.06.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Чемитова Лилия Михайловна;
Голубович Владимир Петрович; Поликарпова Валентина Ивановна; Кирковский Валерий Васильевич (BY)
BY 10709 C1 2008.06.30
BY (11) 10709
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) RU 2159249 C2, 2000.
RU 2222539 C2, 2004.
RU 94045847 A1, 1996.
(57)
Пептидный ингибитор эластазы, выбранный из группы, включающей Thr-Arg-Val-ValOH с константой ингибирования, равной 16,6 мкМоль, Leu-Val-Val-OMe с константой ингибирования, равной 13,3 мкМоль, Thr-Lys-Val-Val-OH с константой ингибирования, равной
11,9 мкМоль, Boc-Thr-Asn-Val-Val-OMe с константой ингибирования, равной 10,6 мкМоль,
Thr-Met-Val-Val-OH с константой ингибирования, равной 7,3 мкМоль, Boc-Thr-Met-ValVal-OH с константой ингибирования, равной 7,3 мкМоль, Boc-Thr-Arg-Val-Val-OMe с
константой ингибирования, равной 6,6 мкМоль, Boc-Leu-Val-Val-OMe с константой ингибирования, равной 5,3 мкМоль, Boc-Leu-Val-Val-OH и Boc-ε-Ak-Leu-Val-Val-OMe,
где Boc - трет-бутилоксикарбонильная группа,
Me - метильная группа,
ε-Ak - остаток ε-аминокапроновой кислоты.
Данное изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к новым пептидным ингибиторам Thr-Arg-Val-Val-OH, Leu-Val-Val-OMe, Thr-Lys-Val-Val-OH,
Boc-Thr-Asn-Val-Val-OMe, Thr-Met-Val-Val-OH, Boc-Thr-Met-Val-Val-OH, Boc-Thr-ArgVal-Val-OMe, Boc-Leu-Val-Val-OMe, Boc-Leu-Val-Val-OH, Boc-ε-Ak-Leu-Val-Val-OMe,
которые могут быть использованы в медицинской практике для ингибирования действия
эластазы.
Протеолитический фермент эластаза участвует в развитии многих воспалительных
процессов, таких как эмфизема, артриты, хронический бронхит, хронический и острый
панкреатиты, новообразование (рак) поджелудочной железы и мн. др. [1].
Известны синтетические пептидные ингибиторы эластазы общей формулы Х-Р4-Р3-Р2P1-OY (где Х = Н-; Y = -H; -СН3), имеющие в положении Р1 и Р2 остатки валина, а в положениях Р3 и Р4 остатки аспарагина и треонина соответственно. Наиболее распространенными ингибиторами эластазы являются Thr-Asn-Val-Val-OH (I) и Thr-Asn-Val-Val-OMe
(II) - пептидные фрагменты естественного белкового ингибитора эластазы Eglin C [2].
BY 10709 C1 2008.06.30
Задачей изобретения является создание новых пептидных ингибиторов с формулами
Thr-Arg-Val-Val-OH (III), Leu-Val-Val-OMe (IV), Thr-Lys-Val-Val-OH (V), Boc-Thr-AsnVal-Val-OMe (VI), Thr-Met-Val-Val-OH (VII), Boc-Thr-Met-Val-Val-OH (VIII), Boc-ThrArg-Val-Val-OMe (IX), Boc-Leu-Val-Val-OMe (X), Boc-Leu-Val-Val-OH (XI), Boc-ε-AkLeu-Val-Val-OMe (XII), обладающих высокой ингибиторной активностью по отношению к
эластазе. Для решения данной задачи с помощью методов теоретического конформационного анализа разработаны структуры соединений III-XII, обеспечивающие конформационное строение молекулы, необходимое для лучшего их связывания в активном центре
эластазы. На основе проведенного конформационного анализа синтезированы оригинальные пептидные ингибиторы, которые проявляют повышенную, по сравнению с соединением I, ингибиторную активность по отношению к эластазе, а также соединение XII
обладает большей специфичностью по отношению к данному ферменту.
Синтез ингибиторов проводят постепенным наращиванием пептидной цепи по N-концу.
При этом используют методы пептидной конденсации - карбодиимидный метод и метод
смешанных ангидридов. Так, для синтеза метилового эфира С-концевого дипептида
Boc-Val-Val-ОСН3 к раствору HCl⋅Val-ОСН3 в ДМФА в присутствии N-метилморфолина
прибавляют эквимолярное количество раствора Boc-Val-OH в ТГФ, охлажденного до
-10 °С, в присутствии эквимолярного количества этилхлорформиата. Реакционную смесь
перемешивают при температуре -10 °С в течение 2 ч и оставляют на ночь в морозильной
камере. Полученный Boc-Val-Val-ОСН3 деблокируют действием раствора НСl в ЭА, для
чего к взвеси Boc-Val-Val-ОСН3 в ЭА прибавляют 5 н раствор НСl в ЭА при комнатной
температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 часа (деблокирование всех
N-концевых защитных групп проводят аналогичным способом). Далее к раствору
HCl⋅Val-Val-ОСН3 в ДМФА в присутствии N-метилморфолина (триэтиламина) и противорацемической добавки HOBt (N-гидроксибензотриазола) прибавляют эквимолярное количество N-защищенной аминокислоты (например, для соединений III и IX такой кислотой
является Boc-Arg-OH, а для соединений VII и VIII - Boc-Met-OH), охлаждают до 0 °С и
добавляют раствор 1,1-кратного избытка DCC в ДМФА. Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при 0 °С и 20 ч при комнатной температуре. Полученный метиловый
эфир трипептида деблокируют. На этой стадии синтез соединения IV завершен.
Далее к раствору деблокированного метилового эфира трипептида в ДМФА прибавляют
эквимолярное количество Boc-Thr⋅ДЦГА (в случае соединения XII вместо Boc-Thr⋅ДЦГА
прибавляют Вос-Nε-аминокапроновую кислоту и N-метилморфолин) и перемешивают в
течение 15 мин. Затем к реакционной смеси прибавляют эквимолярное количество НОВТ,
охлаждают до 0 °С и добавляют раствор 1,1-кратного избытка DCC в ДМФА. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 0 °С и 20 ч при 20 °С. На этой стадии синтез
соединений VI, IX, X, XII завершен.
Далее проводят щелочной гидролиз полученных метиловых эфиров тетрапептидов.
Для этого к раствору метилового эфира тетрапептида в МеОН прибавляют равный объем
4 н раствора NaOH и перемешивают в течение 1 ч. Затем к реакционной смеси прибавляют 15 мл ЭА и подкисляют при охлаждении 1 н раствором НСl до рН 4. На этой стадии
синтез соединений VIII и XI завершен.
Для получения соединений III, V и VII проводят деблокирование полученных тетрапептидов, как описано выше.
Температуры плавления соединений определяют в открытых капиллярах. Упаривание
растворов проводят на ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении
10-15 мм рт. ст. Однородность полученных соединений проверяют методом тонкослойной
хроматографии на пластинках "Силуфол" с использованием следующих систем: хлороформ : метанол : аммиак (6 : 4 : 1), бутанол : уксусная кислота : вода : этилацетат
(3,5 : 1 : 1 : 3,5).
2
BY 10709 C1 2008.06.30
Активность и специфичность заявляемых пептидных ингибиторов подтверждена исследованиями их ингибирующей активности по отношению к эластазе и другим сериновым протеиназам (примеры 1 и 2).
Пример 1.
Кинетические исследования ингибиторной активности пептидных соединений III-XII
по отношению к эластазе в сравнении с известным эластазным ингибитором I.
Исследования проводят на приборе SPECORD UV VIS при длине волны 410 нм.
Используют водную суспензию эластазы фирмы Sigma.
В опытную кювету помещают 0,88 мл 0,1 М Трис-HCl буферного раствора рН 8,5 и
0,02 мл раствора субстрата Boc-Glu(OBu)-Pro-Nva-pNA (С 1⋅10-3 Моль/л в ДМСО), в кювету сравнения дополнительно вводят 0,015 мл уксусной кислоты. Кюветы находятся при
постоянном термостатировании при 37 °С. В отдельную пробирку помещают 0,97 мл
0,1 М Трис-HCl буферного раствора, 0,01 мл фермента с концентрацией С 150 мкг/мл и
0,02 мл раствора ингибитора (С 1⋅10-3 Моль/л в ДМСО). Смесь инкубируют в термостате
при 37 °С в течение 2 мин, затем быстро отбирают 0,1 мл реакционной смеси и помещают
ее в опытную кювету.
Полученные значения констант ингибирования Ki для заявляемых соединений III-XII
по сравнению с известным аналогом I приведены в табл. 1.
Таблица 1
№ п/п
I
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
Название соединения
Thr-Asn-Val-Val-OH
Thr-Arg-Val-Val-OH
Leu-Val-Val-OMe
Thr-Lys-Val-Val-OH
Boc-Thr-Asn-Val-Val-OMe
Thr-Met-Val-Val-OH
Boc-Thr-Met-Val-Val-OH
Boc-Thr-Arg-Val-Val-OMe
Boc-Leu-Val-Val-OMe
Boc-Leu-Val-Val-OH
Boc-ε-Ak-Leu-Val-Val-OMe
Кi, мкМоль
Vi, Моль⋅с-1
-6
22,6
9,2⋅10
-6
16,6
6,8⋅10
-6
13,3
5,4⋅10
-6
11,9
4,8⋅10
-6
10,6
4,2⋅10
-6
7,3
3,0⋅10
-6
7,3
2,8⋅10
-6
6,6
2,6⋅10
-6
5,3
2,0⋅10
никакого прироста поглощения
не наблюдалось
Результаты исследования показывают, что защищенные по N-концу аминокислоты
проявляют большее ингибирующее действие на эластазу, нежели их незащищенные аналоги, что может быть обусловлено наличием дополнительной гидрофобной Вос-группы на
N-конце, а также наличием в положении Р3 либо остатков гидрофобных аминокислот, либо остатков аминокислот с положительным зарядом. Также можно сказать, что все вышеприведенные пептидные соединения являются ингибиторами эластазы и проявляют
повышенную ингибирующую активность по отношению к данному ферменту (соединения
XI и XII полностью инактивируют действие эластазы) по сравнению с известным тетрапептидным аналогом Thr-Asn-Val-Val-OH (I).
Пример 2.
Исследование специфичности соединений I, II, IV, V, XII по отношению к пулу протеиназ.
В работе используют бактоагар типа "Difco" (Sigma), казеин по Гаммерстену, образцы
α-химотрипсина (ЕС 3.4.21.1), пепсина (ЕС 3.4.23.1) фирмы "Sigma", субтилизина Вас.
subtilis (EC 3.4.21.62), металлопротеиназы Вас. subtilis (EC 3.4.24.4) "Диагностикум",
Москва.
В качестве растворителя при работе с пепсином используют 0,2 М ацетатный буфер
рН 1,5, при работе с остальными протеиназами - 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4.
3
BY 10709 C1 2008.06.30
Расщепление казеина исследуют методом лизиса в тонком слое агара при конечной
концентрации белков 10 г/л и агара 10 г/л. Белок-агаровые пластины с нанесенными образцами инкубируют 24 ч при 37 °С, зоны лизиса (мм2) визуализируют, обрабатывая пластины 2 н раствором трихлоруксусной кислоты [3]. Конечная концентрация пептидов
составляет 10-3 Моль/л.
Результаты исследований приведены в табл. 2.
Таблица 2
Название соединения
Контроль
Thr-Asn-Val-Val-OH (I)
Thr-Asn-Val-Val-OMe (II)
Leu-Val-Val-OMe (IV)
Thr-Lys-Val-Val-OH (V)
Boc-ε-Ak-Leu-Val-Val-OMe (XII)
α-химотрипсин
580±25
545±29
586±11
731±23*
539±22
470±19
Субтилизин
Пепсин
546±30
541±14
547±0
497±19
491±21
543±12
262±15
260±0
265±8
231±22
249±20
253±11
Металлопротеиназа
276±21
268±18
267±3
229±22
265±16
274±10
По результатам исследований практически все соединения проявляют ингибирующее
действие на ряд протеиназ за исключением соединения Leu-Val-Val-OMe (IV), которое
достаточно сильно активирует α-химотрипсин. Следует отметить, что соединение Boc-εAk-Leu-Val-Val-OMe (XII) проявляет не сильное ингибирующее действие на этот ряд протеиназ, тогда как по отношению к эластазе это соединение является одним из самых сильных ингибиторов, что выявляет его селективность по отношению к данному ферменту.
Источники информации:
1. Janoff A. Elastase in tissue injury // Ann. Rev. Med. - 1985. - V. 36. - P. 207-216.
2. Tsuboi S., Takeda M., Okada Y., Nagamatsu Y., Yamamoto J. Amino acids and peptides.
XXX. Synthesis of Eglin С (41-49) and Eglin С (60-63) and examination of their inhibitory activity towards human leukocyte elastase, cathepsin G, porcine pancreatic elastase and αchymotrypsin // Chem. Pharm. Bull. - 1991. - V. 39. - № 1. - P. 184-186.
3. Никандров В.Н., Пыжова Н.С, Шатило Н.Л. Современное состояние и перспективы
развития микробиологии и биотехнологии. - Мн., 2004. - С. 89-91.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
88 Кб
Теги
by10709, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа