close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10771

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/571
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ
УРОГЕНИТАЛЬНОГО МИКОПЛАЗМОЗА MYCOPLASMA HOMINIS
И UREAPLASMA UREALYTICUM
(21) Номер заявки: a 20050482
(22) 2005.05.18
(43) 2007.02.28
(71) Заявитель: Государственное учреждение образования "Белорусская медицинская академия последипломного образования" (BY)
(72) Авторы: Бадыгина Наталья Александровна; Хулуп Геннадий Яковлевич; Костюк Светлана Андреевна
(BY)
BY 10771 C1 2008.06.30
BY (11) 10771
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение образования "Белорусская
медицинская академия последипломного образования" (BY)
(56) RU 2163638 С1, 2001.
JP 9094098 A, 1997.
JP 10066599 A, 1998.
RU 2177035 C2, 2001.
(57)
Способ определения концентрации ДНК возбудителя урогенитального микоплазмоза
Mycoplasma hominis или Ureaplasma urealyticum, заключающийся в том, что выделяют
ДНК возбудителя из соскоба эпителиальных клеток цервикального канала и уретры, проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени, причем детекцию амплификационной ДНК осуществляют по флуоресценции с использованием красителя SYBR Green I,
и определяют концентрацию ДНК Mycoplasma hominis, в количестве копий на 1 мл, по
формуле:
Конц. = 10(-0,278СТ + 11,493),
и концентрацию ДНК Ureaplasma urealyticum, в количестве копий на 1 мл, по формуле:
Конц. = 10(-0,242СТ + 10,484),
где СТ - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая флуоресценции амплификационного продукта пересекаются.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способам определения концентрации ДНК Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, присутствующую в соскобе
эпителиальных клеток.
Известен способ определения концентрации Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в исследуемом клиническом материале на основе культуральной диагностики урогенитальных микоплазмозов. Генитальные микоплазмы могут культивироваться как на
жидких, так и на плотных питательных средах. Посев клинического материала на жидкие
питательные среды используется как тест на ферменты уреазу (для U. Urealyticum) и аргиназу (для М. hominis). Под влиянием уреазы и аргиназы происходит расчепление субстратов, приводящих к защилачиванию жидкой питательной среды и изменению цвета
индикатора в течение 24-48 ч. Подсчет выросших микроколоний для определения этиологически значимой концентрации микоплазм производят при дальнейшем посеве клинического материала на плотные питательные среды [1].
BY 10771 C1 2008.06.30
Недостатком этого способа являются высокие требования к транспортировке проб,
данный метод требует сложных питательных сред, и при положительном результате необходимо дальнейшее тестирование образцов для определения концентрации Mycoplasma
hominis и Ureaplasma urealyticum.
Вместе с тем применение ПЦР в режиме реального времени позволяет проводить быстрое определение концентрации ДНК Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum с высокой чувствительностью и специфичностью.
Задачей заявленного способа является в короткие сроки определить концентрацию
ДНК Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, присутствующую в соскобе эпителиальных клеток с помощью ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего
красителя SYBR Green I на этапе детекции продуктов амплификации.
Поставленная задача достигается следующим образом:
Предложенный способ определения концентрации ДНК возбудителя урогенитального
микоплазмоза Mycoplasma hominis или Ureaplasma urealyticum, заключающийся в том, что
выделяют ДНК возбудителя из соскоба эпителиальных клеток цервикального канала и
уретры, проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени, причем детекцию
амплификационной ДНК осуществляют по флуоресценсии с использованием красителя
SYBR Green I, и определяют концентрацию ДНК Mycoplasma hominis, в количестве копий
на 1 мл, по формуле:
Конц. = 10(-0,278СТ + 11,493),
и концентрацию ДНК Ureaplasma urealyticum, в количестве копий на 1 мл, по формуле:
Конц. = 10(-0,242СТ + 10,484),
где СТ - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая флуоресценции амплификационного продукта пересекаются.
Предложенный способ поясняется графическим материалом. На фиг. 1 представлен
качественный анализ наличия ДНК Mycoplasma hominis в соскобах эпителиальных клеток
по кривым и пикам плавления.
На фиг. 2 представлен качественный анализ наличия ДНК Ureaplasma urealyticum в соскобах эпителиальных клеток по кривым и пикам плавления.
На фиг. 3 представлена стандартная кривая корреляции между СТ и log 10 концентраций копий на 1 мл ДНК-стандарта Mycoplasma hominis в диапазоне от 3,6 × 104 до
2,25 × 103 копий на 1 мл.
На фиг. 4 представлена стандартная кривая корреляции между СТ и log 10 концентраций копий ДНК-стандарта Ureaplasma urealyticum в диапазоне от 1,5 × 104 до 4,69 × 102
копий на 1 мл.
На фиг. 5 представлено СТ - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая
данных флуоресценции каждого амплификационного продукта пересекаются (где 1 - пороговая линия, 2 - кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта).
Из соскобов эпителиальных клеток ДНК выделяется сорбционным методом: адсорбции на частицах двуокиси кремния в присутствии гуанидинатицианата натрия, отмывая
этиловым спиртом. При этом к 100 мкл физиологического раствора, содержащего клинический материал в пробирке объемом 1,5 мл (типа Eppendorf), добавляют 300 мкл раствора I (лизирующего, 6 М раствор гуанидина изотиоцианата) и 10 мкл суспензии сорбента
(SiO2). Пробы инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, 1-2 раза перемешивая на микроцентрифуге "Вортекс CV-1500" ("Хеликон", Россия) при 1500 об/мин.
Пробы центрифугируют в течение 15 сек на центрифуге "Циклотемп-201" ("СТМ", Россия) при 12 тыс. оборотов в минуту, супернатант удаляют. К осадку добавляют 100 мкл
раствора II (промывочного, 96 % этанол, содержащий 100 мМ ацетат натрия (рН 4,8),
встряхивают и центрифугируют. Процедуру отмывки повторяют 2 раза с использованием
раствора III (промывочного, 70 % этанол). Пробирки помещают в твердотельный микротермостат (модель 205, "СТМ", Россия) и подсушивают пробы 5 мин при температуре
50 °С, оставляя пробирки открытыми. В пробирки с осадком добавляют 50 мкл ТЕ буфера
2
BY 10771 C1 2008.06.30
(на 1 л буфера: 0,04 М Трис-ацетат (242 г Трис, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты), 0,002 М
ЭДТА (100 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0) и инкубировали в течение 5 мин при 50 °С. Пробирки
центрифугируют в течение 15 сек при 12 тыс. оборотов. Водную фазу используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.
Для проведения количественного определения ДНК Mycoplasma hominis и Ureaplasma_urealyticum методом ПЦР в реальном времени на первом этапе для каждой панели
необходимо поставить 6 контрольных образцов-стандартов с известной концентрацией
ДНК в дублях и 2 контролей, не содержащих ДНК (NTC). NTC реактив состоит из амплификационной смеси, где мишень ДНК-стандарта заменена водой. Отбирают необходимое
количество пробирок с ПНР-смесью-1 для амплификации исследуемых и контрольных
проб. Готовят 2-кратное титрование ДНК-стандарта с известной концентрацией.
Размораживают пробирку с ПЦР-смесью-3 (флуорестентная метка - SYBR Green I) и
тщательно перемешивают содержимое. Готовят верхнюю ПЦР-смесь из расчета 7 мкл
ПЦР-смеси-2 (буфер и Tag-полимераза) и 3 мкл ПЦР-смесью-3 на одну реакцию. В пробирки с ПНР-смесью-1 на поверхность застывшего воска раскапывают по 10 мкл верхней
ПЦР-смеси, которая не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1. В
готовые таким образом пробирки вносят по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из клинических и контрольных проб. Ставят контрольные реакции амплификации: для отрицательного контроля. Вместо ДНК-пробы вносили 10 мкл ДНК-буфера, а для положительного
контроля вносили 10 мкл ДНК-стандарта. Помещали пробирки в ячейки ротора термоциклера "Rotor-Gene-3000" ("Corbettresearch", Австралия).
Амплификацию ДНК проводили по следующей программе для Mycoplasma hominis:
1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали) + 95 °С...5 мин.
2. Циклирование + 95 °С...25 с
+ 65 °С...25 с - 42 циклов
+ 72 °С...25с
3. Удержание + 72 °С... 2 мин.
4. Плавление в диапазоне 55 °С - 99 °С, поднимающейся на один градус на каждом
шаге время ожидания 30 с на первой ступени; время ожидания 10 с на каждой последующей ступени; измерение плавления на Sybr.
Амплификацию ДНК Ureaplasma urealyticum проводили по следующей программе:
1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали) + 95 °С...5 мин.
2. Циклирование + 95 °С...25 с
+ 61 °С... 25 с - 42 циклов
+ 72 °С...25 с
3. Удержание + 72 °С...2 мин.
4. Плавление в диапазоне 55 °С - 99 °С, поднимающейся на один градус на каждом
шаге время ожидания 30 с на первой ступени; время ожидания 10 с на каждой последующей ступени; измерение плавления на Sybr.
Детекция амплифицированной ДНК проводилась с использованием интеркалирующего красителя-Sybr-Green I (SG), основанная на том, что флуоресцентный сигнал от SG
сравнительно низкий в его свободном состоянии, однако сигнал значительно увеличивается, когда SG встраивается в двухцепочечную молекулу ДНК.
Для детекции SG флуорестенции используются FAM/Sybr (470/510 nm) канал. Флуоресцентный сигнал увеличивается пропорционально с увеличением количества ампликона, произведенного в каждом амплификационном цикле и что может быть использовано
для количественного определения ДНК. Учет специфичности результатов ПЦР проводился по анализу кривых плавления, так как Sybr-Green I не является специфическим красителем и будет встраиваться в любую двухцепочечную молекулу ДНК.
Положительные клинические образцы и положительные контроли будут иметь на графике пики в одном диапазоне температур плавления.
3
BY 10771 C1 2008.06.30
Температура плавления ДНК Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum
№ п\п
1
2
Наименование возбудителя
Mycoplasma hominis
Ureaplasma urealyticum
Диапазон, °С
86-88
78,5-81
Отсутствие исследуемой ДНК приведет к отсутствию пиков плавления. Наличие неспецифических продуктов амплификации, праймеров-димеров и т.д. приведет к появлению пиков с другой температурой плавления, отличающейся от температуры плавления
специфических ампликонов, как показано на фигурах 1, 2.
Для определения концентрации ДНК Mycoplasma hominis и Urea-plasma urealyticum,
присутствующую в исследуемом материале с помощью ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I на этапе детекции продуктов
амплификации построили стандартные кривые серий разведений стандартов ДНК М.
hominis и Ureaplasma urealyticum с известной начальной концентрацией геномной ДНК.
Для построения стандартной кривой корреляции между СТ и log 10 концентраций копий ДНК-стандарта Mycoplasma hominis была проведена амплификация 2-кратного титрования ДНК-стандарта Mycoplasma hominis в диапазоне от 3,6 × 104 до 2,25 × 103 копий на
1 мл и количественно проанализирована.
Каждая серия ДНК-стандарта Mycoplasma hominis была проамплифицирована в дублях вместе с двумя "NTC". NTC реактив состоял из сложной ДНК амплификационной
смеси, где мишень ДНК-стандарта заменена водой.
Корреляции между СТ и log 10 концентрации копий ДНК-стандарта Mycoplasma
hominis в мл составила R2 > 0,98, как показано на фиг. 3.
Значение концентрации ДНК Mycoplasma hominis в исследуемом материале высчитывалось по формуле: Конц. = 10(-0,278СТ + 11,493), копий на 1 мл, где СТ - значение цикла при
котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплификационного
продукта пересекаются, как показано на фиг. 5 (где 1-пороговая линия, 2-кривая данных
флуоресценции каждого амплификационного продукта).
Для построения стандартной кривой корреляции между СТ и log 10 концентраций копий ДНК-стандарта Ureaplasma urealyticum была проведена амплификация 2-кратного
титрования ДНК Ureaplasma urealyticum в диапазоне от 1,5 × 104 до 469 копий на 1 мл и
количественно проанализирована.
Каждая серия ДНК-стандарта Ureaplasma urealyticum была проамплифицирована в
дублях вместе с двумя "NTC". NTC реактив состоял из сложной ДНК амплификационной
смеси, где мишень ДНК-стандарта заменена водой.
Корреляции между СТ и log 10 концентрации копий ДНК Ureaplasma urealyticum в мл
составила R2 > 0,98, как показано на фиг. 4.
Значение концентрации Ureaplasma urealyticum в биологическом материале высчитывалось по формуле: Конц. = 10(-0,242СТ + 10,484), копий на 1 мл, где СТ - значение цикла, при
котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплификационного
продукта пересекаются, как показано на фиг. 5 (где 1-пороговая линия, 2-кривая данных
флуоресценции каждого амплификационного продукта).
Пример расчета № 1: больная З., 23 года, история родов № 1648, беременность 12 нед.,
угроза выкидыша. Методом ПЦР с электрофоретической схемой детекции продуктов амплификации в соскобе из цервикального канала и уретры обнаружена Ureaplasma urealyticum, которая является условно-патогенным возбудителем, причем развитие заболевания
зависит от "массивности" инфицирования организма. Такой пороговой концентрацией
принято считать 104 КОЕ и более в 1 мл исследуемого материала.
При определении концентрации ДНК Ureaplasma urealyticum методом ПЦР в реальном
времени у данной пациентки значение составило СТ = 30,32, поэтому
Конц. ДНК Ureaplasma urealyticum = 10(-0,242*30,32 + 10,484) = 1398,25 копий на 1 мл.
4
BY 10771 C1 2008.06.30
У данной пациентки концентрация ДНК Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале не превысила пороговую. Пациентка занесена в группу риска по невынашиванию,
осталась под наблюдением акушер-гинеколога, специфического антибактериального лечения не получала.
Пример расчета № 2: больная Ж, 27 лет, история родов № 560, преждевременные роды
33-34 нед. Методом ПЦР с электрофоретической схемой детекции продуктов амплификации выявлены такие возбудители инфекций урогенитального тракта как: Mycoplasma
hominis и Ureaplasma urealyticum. При определении концентрации ДНК Mycoplasma
hominis методом ПЦР в реальном времени у данной пациентки значение составило
СТ = 14,59, поэтому
Конц. ДНК Mycoplasma hominis = 10(-0,278*14,59 + 11,493) = 26548306,41 копий на 1 мл.
При определении концентрации ДНК Ureaplasma urealyticum методом ПЦР в реальном
времени у данной пациентки значение составило СТ = 21,97, поэтому
Конц. ДНК Ureaplasma urealyticum = 10(-0,242*21,97 + 10,484) = 146736,37 копий на 1 мл.
У данной пациентки выявлена этиологически значимая концентрация ДНК Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале, превышающая пороговую концентрацию в 10-1000 раз. В результате проведенного исследования пациентке
была назначена специфическая антибактериальная терапия.
Таким образом, по сравнению с прототипом заявленный способ позволяет получить
следующие преимущества: возможность определения концентрации ДНК Mycoplasma
hominis и Ureaplasma urealyticum в соскобе эпителиальных клеток в течение 1 дня, возможность мониторирования ПЦР активности в реальном времени, закрытая система исключает возможность контаминации, сокращение трудоемкости исследования.
Источники информации:
1. Хилькевич Н.Д., Скороход Г.А. Методы лабораторной диагностики урогенитальных
микоплазмозов: Метод. рекомендации. - Мн.: МГМИ, 1999. - С. 21.
Фиг. 1
Фиг. 2
5
BY 10771 C1 2008.06.30
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
372 Кб
Теги
by10771, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа