close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY10966

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 10966
(13) C1
(19)
(46) 2008.08.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 1/20
ШТАММ PASTEURELLA MULTOCIDA КМИЭВ-13-Х ШТАММ-АНТИГЕН
(21) Номер заявки: a 20051258
(22) 2005.12.16
(43) 2006.10.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени
С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Автор: Лях Юрий Григорьевич (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее
унитарное предприятие "Институт
экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) Лях Ю.Г. Эпизоотология и специфическая профилактика пастереллеза свиней,
обусловленного Pasteurella multocida
сероварами А и Д. Автореферат диссертации. Минск, 2003. - С. 4-6, 25-27.
BY 6012 C1, 2004.
Лях Ю.Г. и др. Ученые записки Учреждения образования «Витебская ордена
«Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины». Т.40. Ч. 1. - Витебск, 2004. - С. 243-244.
Геведзе В.И. Пастереллез крупного
рогатого скота. - Мн.: Ураджай, 1989. С. 18-21.
Домарадский И.В. Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. М.: Медицина, 1971. - С. 38-41.
BY 10966 C1 2008.08.30
(57)
Штамм Pasteurella multocida КМИЭВ-13-Х - штамм-антиген.
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к биотехнологии,
и касается штамма, выделенного от поросят, больных пастереллезом, обладающего антигенной активностью, и может быть использован для конструирования диагностических и
профилактических биопрепаратов.
Известен штамм Pasteurella multocida Д, населяющий слизистые оболочки органов дыхания млекопитающих (редко человека) и птиц [1]. Возбудитель пастереллеза - неподвижная овальная грамотрицательная бактерия шириной 0,25-0,5 мк, длиной 0,5-1,5 мк,
жгутиков и спор не имеет, анилиновыми красками окрашивается биполярно, имеет капсулу.
Штаммы пастерелл представляют собой единый род бактерий с почти одинаковыми
морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами, но различаются
вирулентными свойствами. Вирулентные штаммы пастерелл, выделенные из трупов животных и птиц, павших при остром течении болезни, чаще всего растут на агаре в виде
гладких, выпуклых, слегка опалесцирующих серовато-белых блестящих колоний с ровными краями - S-форма. R-формы растут на агаре в виде голубоватых матовых шероховатых колоний с неровными краями. Вирулентность таких штаммов понижена, иногда они
авирулентны.
В мазках, взятых из бульонных или полужидких культур S-формы пастерелл, видны
однородные мелкие овоиды или коккобактерии, иногда биполярно окрашенные. В мазках
BY 10966 C1 2008.08.30
бактерий R-формы наблюдается полиморфизм: единичные овоиды или коккобактерии,
короткие или длинные нити. Штамм чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда.
Недостатком данного штамма является слабая вирулентность. Заражение лабораторных животных практически не вызывает их гибели.
Известен штамм Pasteurella multocida Д, участвующий в патологических процессах органов дыхания свиней и крупного рогатого скота. Заражение вызывает разведение 10-6-10-9
вирулентных пастерелл. Вирулентность определяется путем постановки биологической
пробы на белых мышах массой 16-18 г для заражения которых используют 18-24-часовую
бульонную культуру пастерелл.
Для изоляции отдельных колоний пастерелл из первичных высевов применяют дробный
посев исследуемого патологического материала на чашки Петри с обогащенным МПА. На
простом аминопептидном и сывороточном МПА P. multocida Д образует прозрачные серовато-белого цвета колонии с ровными краями, диаметром 2-3 мм. Первичный рост может быть также в виде тонкого налета на поверхности среды. На необогащенном МПА
пастереллы растут в виде нежных мелких росинчатых колоний, слегка опалесцирующих в
проходящем свете. По внешнему виду различают три основных типа колоний: слизистые
(М-форма), гладкие (S-форма) и шероховатые (R-форма). Слизистые колонии наиболее
крупные, имеют белый цвет, гладкие края и характерную влажную поверхность [2].
Слабый рост указанного штамма на жидких питательных средах указывает на невозможность использования данного штамма в биологической промышленности.
Известен штамм Pasteurella multocida Д, участвующий в патогенезе пастереллеза, выделенный из крови животных и птиц, который в разведении 10-21 вызывал гибель белых
мышей. В мазках, приготовленных из бульонных культур и окрашенных по Грамму,
данный микроорганизм имеет вид мелких грамотрицательных кокко-овоидов размером
0,2-1,6×0,15-0,26 мкм, располагающихся изолированно, попарно и реже цепочками. Указанный штамм пастерелл имеет специфический капсульный антиген и продуцирует гиалуроновую кислоту [3].
Чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда, стрептомицину.
Иммуногенность указанного штамма составляет 81 %.
Такого показателя иммуногенности для изготовления высокоактивных вакцин недостаточно, и поэтому данный штамм Pasteurella multocida Д не может быть использован при
изготовлении вакцин.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение
штамма, пригодного для конструирования диагностических и профилактических препаратов, обладающего высокой (90-97 %) иммуногенностью.
Поставленная задача достигалась тем, что в качестве штамма-антигена использовали
полученный штамм Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х), выделенный в 1990 году в
колхозе «Рассвет» Несвижского района Минской области из легочной ткани телят возрастом 1-1,5 месяцев. В результате отбора и проведения исследований был селекционирован
штамм Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х), отличающийся наличием высокой иммуногенности, что позволяет использовать его для изготовления вакцины.
Штамм бактерий Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х) депонирован в коллекции
РНИУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Национальной
академии наук Беларуси». Использование штамма Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-X)
для получения антигена в качестве составной части противопастереллезных вакцин позволяет применять его в комплексе мер по профилактике пастереллеза телят и поросят.
Таксонометрическая принадлежность. Согласно определителю бактерий Берджи Pasteurella
multocida относится к 5-й группе факультативно анаэробных грамотрицательных палочек,
подгруппе 3 - семейство Pasteurellaceae, роду Pasteurella, виду Pasteurella multocida.
Патогенность для животных. Штамм Pasteurella multocida 90 (КМИЭВ-13-Х) патогенен - при внутрибрюшинном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г.
2
BY 10966 C1 2008.08.30
ЛД100 для белых мышей составляет 0,5 мл3 18-часовой бульонной культуры. Гибель животных наступает в течение 24-48 ч.
Тинкториально-морфологические признаки. Данный микроорганизм в мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, при окраске по Граму может иметь вид сферических, овальных или палочковидных клеток, 0,3-1,5×0,15-0,25 мкм, одиночные, реже в
парах или коротких цепочках. Обычно окрашиваются биполярно, особенно в препаратах,
приготовленных из инфицированных тканей животных. Грамотрицательные. Неподвижные.
Культуральные, физиологические, биотехнологические и биохимические признаки.
Факультативный анаэроб. Хемоорганотофоры, обладающие и дыхательным, и бродильным типами метаболизма. В МПБ в бульоне на основе перевара Хоттингера в первые дни
выращивания (24-48 ч) дает легкое равномерное помутнение сред, в большинстве случаев
без образования на поверхности бульона пленки и пристеночного кольца. На 3-5-й день на
дне пробирки образуется характерный слизистый осадок, поднимающийся при встряхивании
пробирки в виде неразбивающейся косички с полным просветлением бульона. Хороший
рост пастереллезных бактерий отмечается при обогащении сред 5-10 %-ной инактивированной стерильной сывороткой лошади и 2 %-ным стерильным 40 %-ным раствором глюкозы. Ростовые качества питательных сред для выращивания пастерелл можно улучшить
добавлением 2 %-ного стерильного дрожжевого экстракта.
Для роста пастерелл необходима слабощелочная среда. Наиболее оптимальный рост
их наблюдается при рН 7,2-7,4 и температуре воздуха + 37 °С в течение 24-48 ч.
Маркерные признаки (генетические, иммуногенные, биохимические, физиологические).
В биохимическом отношении катболизируют D-глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты. Восстанавливают нитрат до нитрита. Пробы с метиловым красным и на
образование ацетоина (Фогеса-Проскауэра) отрицательные.
Антигенный состав. Имеет в своем составе К- и О-антигены. Исследуемые культуры
засевают в центрифужные пробирки, содержащие по 3 мл МПБ из перевара Хоттингера с
добавлением 10 % нормальной сыворотки крови лошади, инкубируют 18-24 ч при 37 °С,
затем центрифугируют при 1000 об./мин в течение 30 мин. После чего удаляют 2,5 мл надосадочной жидкости, а в оставшихся 0,5 мл ресуспендируют осевшие бактериальные клетки.
В каждую пробирку вносят по 0,5 мл раствора трипофлавина, тщательно перемешивают, выдерживают 30 мин при комнатной температуре, затем учитывают результаты.
Культуры, относящиеся к серовару Д, образовывают флокулят, оседающий на дне пробирки и не разбивающийся при встряхивании.
Чувствительность к антибиотикам. Штамм Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х)
устойчив к основным антибиотикам кроме антибиотиков тетрациклинового ряда.
Условия хранения. Хранят в ампулах при +2-4 °С после лиофильного высушивания в
полужидком агаре в течение 5 лет. Жизнеспособность поддерживается путем пересева на
питательные среды - МПБ Хоттингера и МПА на основе перевара Хоттингера 1 раз в течение 1 месяца при условии хранения +2-4 °С.
Вирулентность. Штамм Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х) обладает вирулентностью. При внутрибрюшинном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г.
ЛД100 для белых мышей составляет 0,5 мл3 18-часовой бульонной культуры.
Иммуногенность. Иммуногенность штамма Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х)
составляет 90-97 %.
Онкогенность. Данные отсутствуют.
1. Пример выделения штамма Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х) - штамма антигена. Штамм Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х) выделяли путем посева кусочков патологически измененных легких телят, больных пастереллезом, на МПБ и МПА на
основе перевара Хоттингера. Для приготовления бульона Хоттингера перевар разводят
дистиллированной водой до содержания азота 200 мг %. К бульону добавляют 0,5 % натрия хлорида и 1 % пептона, и 10 % дрожжевого экстракта. рН доводят до 7,4-7,6.
3
BY 10966 C1 2008.08.30
2. Пример определения патогенности штамма Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х) штамма-антигена. Изучение патогенных свойств штамма Pasteurella multocida 90-Д
(КМИЭВ-13-Х) провели на белых мышах. Исследования проводили путем введения
20 белым мышам массой 14-16 г подкожно в дозе 0,5 мл суточной культуры пастерелл.
Животные заболели и в течение 24-48 ч пали. При вскрытии павших животных на внутренних органах отмечены точечные кровоизлияния, пневмония.
3. Пример определения иммуногенной активности штамма Pasteurella multocida 90-Д
(КМИЭВ-13-Х) - штамма-антигена.
Иммуногенную активность штамма Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х) изучали
на белых мышах массой 14-16 г (100 иммунизированных и 100 контрольных).
В результате исследований иммуногеной активности вакцины, изготовленной на основании выращенных пастерелл, установлено, что двукратная иммунизация лабораторных
животных приготовленным экспериментальным образцом вакцины в дозах 0,2 и 0,3 мл с
интервалом 7 дней в 97 % случаях предохраняет их от заболевания и падежа при заражении пастереллами.
Таким образом, штамм Pasteurella multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х) является активным в
антигенном отношении, обладает необходимой иммуногенной активностью (97 %) по
сравнению с известным штаммом (81 %) и может быть использован для конструирования
диагностических и профилактических препаратов в качестве штамма-антигена.
Источники информации:
1. Краткий определитель бактерий Берги / Под ред. Дж. Хоулта. - М.: Мир, 1980. С. 180-203.
2. Геведзе В.И. Пастереллез крупного рогатого скота. - Мн.: Ураджай, - 1989. - С. 19-21.
3. Домарадский И.В. Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. - М.:
Медицина, 1971. - С. 39-41 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
85 Кб
Теги
by10966, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа