close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11112

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11112
(13) C1
(19)
C 02F 3/34
ШТАММ RHODOCOCCUS OPACUS БИМ В-412Д ДЕСТРУКТОР МОНОХЛОРФЕНОЛА
(21) Номер заявки: a 20061180
(22) 2006.11.24
(43) 2008.06.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт микробиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Глушень Елена Михайловна;
Самсонова Алисса Самуиловна; Семочкина Наталья Федоровна; Филипшанова Людмила Ивановна; Петрова
Галина Михайловна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) SU 1652335 А1, 1991.
BY 1288 С1, 1996.
SU 1597384 А1, 1990.
КОЛОМЫЦЕВА М.П. и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т. 41. - № 5. - С. 541-546.
BY 11112 C1 2008.10.30
(57)
Штамм Rhodococcus opacus БИМ В-412Д - деструктор монохлорфенола.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для микробиологической очистки сточных вод и почвы от хлорированных фенолов.
Цель изобретения - получение нового штамма, обладающего способностью к разложению повышенных концентраций широкого спектра хлорированных фенолов.
Изобретение заключается в получении штамма Rhodococcus opacus БИМ В-412Д, деградирующего 2-хлор-, 3-хлор- и 4-хлорфенол. Штамм полностью разлагает монохлорфенолы
в концентрации 100 мг/л, используя их в качестве единственного источника углерода.
Штамм Rhodococcus opacus БИМ В-412Д выделен из почвы, подвергавшейся длительному загрязнению промвыбросами предприятия органического синтеза, депонирован в
Республиканской коллекции микроорганизмов ГНУ "Институт микробиологии НАН Беларуси" под № БИМ В-412Д.
Известны штаммы микроорганизмов: Rhodococcus opacus 1CP, Rhodococcus sp. ВКПМ
S-1192, используемые для разложения фенола и его монохлорпроизводных в качестве
единственных источников углерода и энергии [1-2]. Использование Mycobacterium stegmatis BKM В-1205 для очистки стоков, содержащих в своем составе в суммарном количестве
не более 100 мг/л различных фенольных и хлорфенольных соединений, позволяет достигнуть 70-98 % степени очистки [3].
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому
изобретению является штамм актиномицетов Streptomyces rochei BKM Ac-1284D, выбранный в качестве прототипа, и деградирующий 2-хлорфенол в концентрации 50 мг/л,
используя его в качестве единственного источника углерода [4].
Недостатком прототипа является отсутствие у данного штамма способности использовать
3-хлорфенол и 4-хлорфенол, а также разрушать 2-хлорфенол в концентрациях выше 50 мг/л.
BY 11112 C1 2008.10.30
Штамм Rhodococcus opacus БИМ В-412Д имеет следующие свойства.
Морфолого-культуральные свойства:
Грамположительные клетки образуют на ранней стадии развития рудиментарный мицелий, который в дальнейшем распадается на фрагменты, превращающиеся в результате
ряда последовательных делений в палочки, а затем в кокки.
Рост на плотных средах:
мясо-сусловый агар, 29 °С, 3 суток
штрих кремово-розовый, матовый, пастообразный;
колонии кремово-розовые, диаметром 1-5 мм, круглые, выпуклые, гладкие, сухие, легко снимаются с агара;
сусло-агар, 29 °С, 5 суток
штрих кремовый, матовый, пастообразный;
колонии кремовые, диаметром 1,5 мм, круглые, выпуклые, матовые, сухие, легко снимаются с агара;
минеральная агаризованная среда, г/л:
NaCl - 0,5; MgSO4·7H2O - 0,8; КН2РО4 - 0,7; (NH4)2HPO4 - 1,5; агар-агар - 20,0; растительное масло - 1,0; рН 7,3-7,5; 29 °С, 14 суток
штрих кремовый, матовый, пастообразный;
колонии кремовые, диаметром 1-3 мм, круглые, выпуклые, матовые, сухие, легко снимаются с агара.
Рост на жидких средах:
мясо-пептонный бульон, 29 °С, 7 суток
характер роста - пленка, кремовый осадок;
жидкая минеральная среда, г/л:
NaCl - 0,5; MgSO4·7H2O - 0,8; KH2PO4 - 0,7; (NH4)2HPO4 - 1,5; растительное масло 1,0; pH 7,3-7,5; 29 °С, 14 суток
характер роста - кремовый осадок, изменения среды не наблюдаются.
Физиолого-биохимические свойства:
Аэроб, частично кислотоустойчив, оксидазоотрицателен, дает отрицательный тест
Хью-Лейфсона с глюкозой, уреазо- и каталазоположителен.
На среде МСА при 30 °С формируют изолированные колонии через 18 часов.
В клеточной стенке обнаружены: галактоза, арабиноза, мезодиаминопимелиновая
кислота (мезо-ДАПК), липид LCN-A (IV тип).
Образует кислоту из глюкозы, сахарозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, манита, сорбита и глицерина, но не из арабинозы, лактозы, рамнозы, дульцита.
Усваивает натриевые соли органических кислот: лимонной, пропионовой, бензойной,
молочной, уксусной, но не щавелевой.
Восстанавливает нитраты в нитриты, растет на нитритном агаре, на безазотистой
среде Эжби, в присутствии 5 % NaCl, устойчив к тетрациклину (10 ед.) и бензилпенициллину (10 ед.).
Штамм способен разлагать тирозин, не гидролизует крахмал, не разжижает желатин,
не разлагает казеин, ксантин.
Оптимальная температура роста - + 28 °С.
Оптимальные значения рН - 6,5-7,5.
Штамм при росте на общепринятых средах и минеральной среде с растительным маслом не требует стимуляторов роста. Штамм использует растительное масло в качестве
единственного источника углерода и не требует стимуляторов деструкции; сохраняет
жизнеспособность и деструктивные свойства в течение 6 месяцев на МПА, МСА и агаризованной минеральной среде с растительным маслом (0,1 %).
Штамм Rhodococcus opacus БИМ В-412Д не токсичен и не патогенен.
2
BY 11112 C1 2008.10.30
Пример
Для выделения и культивирования бактерий-деструкторов хлорфенолов использовали
мясо-пептонный агар (МПА), мясо-сусловый агар (МСА), а также жидкие и агаризованные минеральные среды следующего состава (г/л):
№1
№ 2 (Е-8)
КН2РО4 - 1,0;
NaCl - 0,5;
К2НРO4 - 1,0;
(NH4)2HPO4 - 1,5;
NH4NO3 - 1,0;
КН2РO4 - 0,7;
MgSO4×7H2O - 0,7;
MgSO4⋅7H2O - 0,8;
СаС12 - 0,02;
рН 7,3.
FеС13 - 2 капли насыщенного р-ра
рН 7,0-7,2.
№ 3 (KSN)
К2НРО4⋅3Н2О - 4,0;
NaH2PO4·3H2O - 1,0;
(NH4)2SO4 - 0,5;
MgSO4×7H2O - 0,2;
Ca(NO3)·4H2O-0,001;
дрожжевой экстракт - 0,5
рН 7,0-7,3.
Хлорфенолы добавляли в среду в качестве единственного источника углерода после
стерилизации в повышающемся от 50 до 200 мг/л количестве монохлорфенолов.
Выделение микроорганизма, разрушающего ксенобиотики, проводили методом накопительных культур. Образцы помещали в жидкую минеральную среду с хлорфенолами в
качестве единственного источника питания в концентрации 40 мг/л.
Накопительные культуры получали путем 10-кратных пассажей в условиях повышающихся концентраций хлорфенолов в среде от 40 до 100 мг/л в течение 6 месяцев.
Культуры накопления рассевались на поверхности агаризованной минеральной среды с
хлорфенолами. Далее концентрацию хлорфенолов в селектирующей среде увеличивали от
посева к посеву до 200 мг/л и получали штаммы с повышенной деструктивной активностью в отношении хлорфенолов.
Способность выделенных микроорганизмов расти на хлорфенолах различного строения устанавливали ауксанографически на агаризованной минеральной среде с хлорфенолами. Чашки Петри с агаризованной средой засевали штрихом, результаты учитывали на
14-е сутки.
Изучение трансформационной активности микроорганизмов-деструкторов монохлорфенолов проводили в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой минеральной среды в условиях интенсивной аэрации на качалке, обеспечивающей 180 об./мин., при
29 °С.
Рост бактериальных культур контролировали путем измерения оптической плотности
культуральной жидкости на КФК-5 при 540 нм.
Определение количества жизнеспособных клеток проводили на МПА и агаризованной
минеральной среде Е-8 с добавлением хлорфенолов в количестве 20 мг/л, а массу сухих
клеток - взвешиванием.
Для качественного и количественного анализа галогенсодержащих соединений в КЖ
использовали метод газожидкостной хроматографии на газовом хроматографе Hewlett
Packard (ПИД и ДЭЗ). Определение проводили в надосадочной жидкости, полученной
центрифугированием КЖ в течение 15 мин при 5 тыс. об./мин.
При применении пламенно-ионизационного детектора (ПИД) использовали капиллярную колонку HP-INNOWAX длиной 30 метров, внутренним диаметром 0,32 мм, с нанесенной неподвижной фазой из полиэтиленгликоля толщиной 0,5 мкм.
3
BY 11112 C1 2008.10.30
При работе с детектором по электронному захвату (ДЭЗ) использовали капиллярную
колонку НР-5 длиной 30 метров, внутренним диаметром 0,25 мм, с нанесенной неподвижной фазой из 5 % бифенила и 95 % диметил-полисилоксана толщиной 0,25 мкм. Анализ
образцов проводили в режиме программирования температуры от 100 до 200 °С с целью
определения как более летучих интермедиатов биотрансформации, так и высококипящих
соединений.
Исследования проводили в следующих условиях: температура испарителя - 275 °С;
температура детектора - 300 °С; начальная температура в термостате в течение 5 минут 100 °С; нагрев до 200 °С осуществляли со скоростью 10 °С в минуту; изотермического
режима достигали в течение 20 минут; расход газа-носителя при 100 °С - 0,78 мл/мин, а
коэффициент деления потока - 1 : 10; объем вводимой пробы - 0,8 мкл.
Анализ динамики роста Rhodococcus opacus БИМ В-412Д в среде, содержащей монохлорфенолы в концентрации 200 мг/л, показал, что штамму в присутствии 4-ХФ характерна более высокая средняя удельная скорость по сравнению с ростом на 3-ХФ и 2-ХФ.
Через 48 часов оптическая плотность культуральной жидкости, содержащей 2-ХФ, 3-ХФ и
4-ХФ, составляет 0,25; 0,3 и 0,35, а средняя удельная скорость роста Rhodococcus opacus
БИМ В-412Д - 0,121; 0,124 и 0,144 ч-1 соответственно.
Полное разрушение 2-ХФ, 3-ХФ и 4-ХФ осуществляется культурой R. opacus БИМ В412Д за 72, 48 и 24 часа соответственно (таблица 1).
Таблица 1
Деградация монохлорфенолов в концентрации 100 мг/л
Rhodococcus opacus БИМ В-412Д
Содержание монохлорфенолов, %
Хлорфенол
2ХФ
3ХФ
4ХФ
Время, ч
0
100
100
100
24
93,6
6,1
0
48
32
0
0
72
0
0
0
Источники информации:
1. Коломыцева М.П. и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2005. - Т. 41. № 5. - С. 541-546.
2. BY 1288 С1, 1996.
3. SU 1597384 А1, 1990.
4. SU 1652335 А1, 1991.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
87 Кб
Теги
патент, by11112
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа