close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11136

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11136
(13) C1
(19)
C 08B 37/00
ШТАММ ГРИБА LENTINUS EDODES БИМ F-305 Д - ПРОДУЦЕНТ
ПОЛИСАХАРИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОТРОПНОЙ
АКТИВНОСТЬЮ
(21) Номер заявки: a 20070168
(22) 2007.02.19
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Бабицкая Валентина Григорьевна; Пучкова Татьяна Антоновна; Щерба Виктор Васильевич;
Рожкова Зоя Афанасьевна; Филимонова Татьяна Васильевна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) US 2006/0094689 A1, 2006.
FUJII T. et al. The Journal of Antibiotics,
1978, vol 31, No 11, p. 1079-1090.
US 5560914 A, 1996.
MD 1947 F1, 2002.
US 4163780 A, 1979.
BY 11136 C1 2008.10.30
(57)
Штамм гриба Lentinus edodes БИМ F-305 Д - продуцент полисахаридов, обладающих
иммунотропной активностью.
Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в медицинской
промышленности и касается нового штамма гриба Lentinus edodes - продуцента полисахаридов. Биомасса и полисахариды гриба могут найти применение в качестве источника
лекарственных и лечебно-профилактических веществ, усиливающих иммунитет, обладающих антиоксидантной, радиопротекторной, антимикробной, гиполипидемической и др.
активностями.
Высший базидиальный гриб шиитаке (Lentinus edodes (Berk) Sing) более 2000 лет
используется в народной медицине стран Юго-Восточной Азии. В его плодовых телах и
мицелии обнаружены вещества, стимулирующие иммунную систему, обладающие противоопухолевыми, гепатопротекторными, антиоксидантными, антибактериальными, противовирусными и противогрибными свойствами, способные регулировать кровяное
давление, понижать содержание холестерина и сахара в крови и др. [1]. Биологическую
активность этого гриба, наряду с другими соединениями, определяют полисахариды, важнейший из которых - полисахарид лентинан ((β-1-3-гликан), получаемый из плодовых тел
и одобренный в Японии в качестве лекарственного препарата при лечении некоторых онкологических заболеваний. Однако выращивание плодовых тел - достаточно длительный
и трудоемкий процесс (3-4 месяца). В настоящее время более перспективно глубинное
культивирование грибов на жидких питательных средах, позволяющее получать за короткие сроки стандартизированную полисахаридсодержащую биомассу.
BY 11136 C1 2008.10.30
Известен штамм Lentinus edodes (Berk) Sing CNM-FB-01 - продуцент биомассы, обладающий высокой продуктивностью и ярко выраженным грибным ароматом [2], и способ
получения биомассы гриба [3]. Гриб выращивают на питательной среде следующего
состава, г/л: пивное сусло - 270-320, меласса - 50-70, подсолнечное масло - 0,5-1,5, вода остальное. Культивирование осуществляют в течение 8-10 дней при температуре 26-27 °С
и рН 4,5-5,0. Недостатком штамма является необходимость культивирования его на питательных средах с высоким содержанием углеводов, неизвестно количество образуемых
полисахаридов.
Известен способ выращивания съедобных грибов Lentinus edodes, включающий приготовление мицелиальной биомассы путем глубинного культивирования на питательной
среде и получение плодовых тел путем посева мицелиальной биомассы на субстрат. Культивирование осуществляют в присутствии хлорида марганца, а мицелиальную биомассу
готовят до стадии образования пигментированной мицелиальной пленки [4]. Известно использование глубинного мицелия L. edodes для получения косметических средств [5]. Однако в этих патентах отсутствуют данные об образовании эндо- и экзополисахаридов.
Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому результату являются
штаммы: L. edodes IHEM 18992, способный образовывать иммуностимулирующие экзополисахариды [6] и штамм L. edodes KSLE 007 - продуцент противоопухолевого и антивирусного эндополисахарида KS-2 [7]. Штамм L. edodes IHEM 18992 выращивают на
питательной среде, содержащей глюкозу, сусло-экстракт, дрожжевой экстракт и пептон в
различных концентрациях. Гриб культивируют при температуре 22-31 °С, рН = 3-7 в течение 8-33 сут. (в колбах (инокулюм) - 6-21 сут., затем в ферментере - 2-12,5 сут. (50-300
ч)). Однако штамм характеризуется недостаточно высокой продуктивностью.
Штамм L. edodes KSLE 007 выращивают в колбах, а затем в ферментере на среде, основу которой составляют отходы производства ячменной водки. Выход эндополисахарида
- 0,7 г/л или 5,8 % в биомассе. (Гриб выращивают в ферментере объемом 10 л. Получено
12,5 г/л сухой биомассы, рис. 1 в ссылке [7]. Из этой биомассы - 125 г/10 л - получено 7 г
полисахарида, что составляет 5,8 % в биомассе, либо 0,7 г/л).
Данные штаммы взяты за прототип. Однако штаммы характеризуются недостаточно
высокой физиологической активностью и низким образованием полисахаридов.
Недостатками данных штаммов являются:
Для L. edodes IHEM 18992:
низкий выход биомассы - 3-5 г/л;
низкий выход экзополисахаридов - 0,1-0,23 г/л;
длительное культивирование (до 300 ч (12,5 сут.) в ферментере).
Для L. edodes KSLE 007:
длительность культивирования - 30 сут. (10 суток в колбах объемом 500 мл, 10 суток в
колбах объемом 1000 мл, 10 суток в 10 л ферментере).
низкий выход эндополисахаридов - 5,8 % в сухой биомассе либо 0,7 г/л.
Задачей изобретения является получение путем естественной селекции более продуктивного по синтезу полисахаридов штамма, способного расти на более широком спектре
относительно дешевых и простых по составу питательных сред, сокращения сроков получения конечного продукта.
Предлагаемый штамм L. edodes БИМ F-305 Д выделен в виде тканевых изолятов коммерческих плодовых тел (фармкультура), получен путем естественной селекции и депонирован в коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ "Институт микробиологии
НАН Беларуси". Культура также поддерживается в коллекции мицелиальных грибов лаборатории экспериментальной микологии ГНУ "Институт микробиологии НАН Беларуси". Штамм хранится при 4-6 °С на сусло-агаре, на сусло-агаре с добавлением 0,5 %
опилок.
2
BY 11136 C1 2008.10.30
Культурально-морфологическая характеристика.
Агаризованное сусло. Колонии ватообразные, средней плотности, белые, воздушный
мицелий невысокий, в начале роста паутинистый, сравнительно негустой, затем преобразуется в более высокий ватообразный, запах слабый, грибной. Край колонии ровный, с
возрастом поднимающийся, на реверзуме заметны концентрические круги (зоны роста) и
темнопигментированные участки разной величины. Генеративные гифы септированные,
разветвленные, переплетающиеся в разных направлениях. На мицелии хорошо видны
многочисленные мутовчатые пряжки, как простые, так и медальонные. Изредка встречаются анастомозы.
В глубинной культуре на средах с молочной сывороткой рост мицелия дисперсный,
пеллеты удлиненные, на концах округлые, иногда с тяжами, длиной - 3-6 мм, шириной 0,1-0,6 мм.
Физиолого-биохимическая характеристика.
Культура утилизирует моносахариды (арабиноза, галактоза, глюкоза, ксилоза, манноза, фруктоза), дисахариды (лактоза, мальтоза, сахароза, целлобиоза), полиолы (маннит,
сорбит, дульцит), полисахариды (крахмал, целлюлоза). В качестве источников азота использует неорганические (NaNO3, NH4NO3, NH4Cl, (NH4)2SO4) и органические (пептон,
аспарагиновую кислоту, кукурузный, дрожжевой экстракт).
Растет в диапазоне температур 15-30 °С, оптимальная температура для роста - 2325 °С. Диапазон рН - 3,0-7,0, с оптимумом - 4,5-5,0.
Для роста требует кислород воздуха.
Штамм не патогенен, токсических метаболитов не образует.
Токсикологические исследования штамма (глубинного и поверхностного мицелия)
проводились на лабораторных животных: крысы, беспородные белые мыши, морские
свинки, кролики. Установлено, что сам штамм и мицелий не обладают кумулятивными
свойствами, в условиях повторного внутрижелудочного введения в массивных дозах не
способны к формированию токсических факторов, приводящих к нарушению жизнедеятельности отдельных органов, систем и организма в целом. Не обладают раздражающим и
общерезорбтивным действием, не обладают сенсибилизирующей активностью и не представляют опасности аллергенного поражения, не обладают кожным ирритативным и кожно-раздражающим действием. Не выявлены функциональные и структурные нарушения
со стороны жизненно важных систем организма. Проведенные исследования позволяют
сделать заключение о безвредности гриба для организма.
На модели окисления линолевой кислоты установлена высокая антиоксидантная активность глубинного и поверхностного мицелия (до 90 % и выше по отношению к ионолу
- известному антиоксиданту). Спиртовые экстракты подавляли автоокисление линолевой
кислоты и образование продуктов перекисного окисления, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой.
Сведения, подтверждающие образование полисахаридов и других компонентов штаммом L. edodes БИМ F-305 Д на различных питательных средах.
Пример 1
Культуру гриба L. edodes БИМ F-305 Д выращивают на скошенном сусло-агаре при
23-25 °С в течение 7-10 сут., затем переносят культуру стерильной лопаткой или шпателем в качалочные колбы вместимостью 1 л с 300 мл стерильной среды - пивное неохмеленное сусло 5°Б, рН среды 5,0-6,0. Штамм культивируют на качалке (160-180 об./мин.)
при 23-25 °С в течение 8-10 сут. Общее время культивирования - 15-20 сут. Полученный
мицелий фильтруется, промывается водой и сушится в токе теплого воздуха при температуре не выше 60 °С. В культуральной жидкости и полученном мицелии определяют содержание экзо- [8] и эндополисахаридов [9], другие показатели.
3
BY 11136 C1 2008.10.30
Биомасса, г/л
10,0
Эндополисахарид, %
10,0
Экзополисахарид, г/л
4,0
Белок, %
23,0
Липиды, %
9,0
Линолевая кислота, % в липидах
69,0
Фенольные соединения, мг/%
1800,0
Меланин, %
0,7
Антиоксидантная активность, %
80,0.
Использование предложенного штамма позволило увеличить по сравнению с прототипом:
выход экзополисахаридов - в 17-40 раз;
эндополисахаридов - в 1,8 раза.
Пример 2
Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примере 1. В качестве
питательной среды используется минеральная среда с глюкозой: глюкоза - 30,0 г/л,
(NH4)2SO4 - 5 г/л, KН2РО4 - 1,0 г/л, K2НРО4 - 1,0 г/л, MgSO4 - 0,25, кукурузный экстракт 2,0 г/л, вода водопроводная до 1 л, рН - 5,0-6,0.
Показатели:
Биомасса, г/л
10,0-12,0
Эндополисахарид, %
10,0
Экзополисахарид, г/л
4,0
Белок, %
20,0
Липиды, %
8,0
Линолевая кислота, % в липидах
65,0
Фенольные соединения, мг/%
1700,0
Меланин, %
1,2
Антиоксидантная активность, %
80,0.
Использование предложенного штамма и подбора питательной среды позволило
увеличить по сравнению с прототипом:
экзополисахариды - в 17-40 раз;
эндополисахариды - в 1,8 раза.
Пример 3
Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примерах 1, 2. В качестве питательной среды используется сухая молочная сыворотка - 20 г/л, меласса - 20 г/л,
(NH4)2SO4 - 5,0 г/л, дрожжевой экстракт - 1,0 г/л, вода водопроводная - остальное, рН 5,0-6,0.
Показатели:
Биомасса, г/л
15,0-16,0
Эндополисахарид, %
11,0-12,0
Экзополисахарид, г/л
3,5-4,0
Белок, %
24-25
Липиды, %
9-10,0
Линолевая кислота, % в липидах
70,0
Фенольные соединения, мг/%
1900,0
Меланин, %
1,5
Антиоксидантная активность, %
85,0.
Использование предложенного штамма и подбора питательной среды позволило увеличить по сравнению с прототипом:
экзополисахариды - в 17-40 раз;
эндополисахариды - в 1,9 раза.
4
BY 11136 C1 2008.10.30
Пример 4
Выращивание гриба осуществляется аналогично, изложенному в примерах 1-3. Выращенный в колбах мицелий стерильно переносят в ферментер объемом 10 л с 7 л любой (по
пп. 1-3) питательной среды. Культивирование ведется при аэрации 0,5 л воздуха, /л среды/мин, температуре 23-25 °С. Длительность культивирования - 72-96 ч.
Показатели:
Биомасса, г/л
11,0-15,0
Эндополисахарид, %
8,0-10,0
Экзополисахарид, г/л
4,5-5,0
Белок, %
23,0-25,0
Липиды, %
11,5-12,0
Линолевая кислота, % в липидах
60,0-70,0
Фенольные соединения, мг/%
1600,0-1800,0
Меланин, %
1,3
Антиоксидантная активность, %
85,0-90,0.
Использование предложенного штамма и способа культивирования позволило увеличить по сравнению с прототипом:
экзополисахариды - в 22-45 раз;
эндополисахариды - в 1,4-1,8 раз.
Пример 5
Глубинный мицелий гриба получают аналогично изложенному в примерах 1-4. Полисахариды из глубинного мицелия и культуральной жидкости выделяют по [8, 9]. Растворы
эндополисахаридов готовят в дистиллированной воде при нагревании, экзополисахаридов - в дистиллированной воде при нагревании (водорастворимая фракция) или в 10 %
NaOH при нагревании с последующим диализом против дистиллированной воды (щелочерастворимая фракция). Для определения способности полисахаридов стимулировать
фагоцитарную активность нейтрофилов использовался "фагоцитарный тест". Метод основан
на определении с помощью светового микроскопа поглотительной способности нейтрофилов крови по отношению к микробной тест культуре после их совместной инкубации.
В качестве тест-культуры использован Staphylococcus aureus. Установлено, что в опыте
in vitro эндополисахариды, полученные из глубинного мицелия L. edodes БИМ F-305 Д,
активно стимулируют фагоцитарную активность нейтрофилов по отношению к S. aureus в
концентрации свыше 100 мкг/мл. Более низкие концентрации (1 и 10 мкг/мл) также влияют на интенсивность фагоцитоза, однако различия с контролем статистически незначимы
(табл. 1).
Так же как и эндополисахариды, внеклеточные полисахариды, синтезируемые грибом
в культуральную среду, оказывают стимулирующий эффект на интенсивность фагоцитоза.
Статистически значимое увеличение фагоцитарного числа по сравнению с контролем получено для обеих фракций экзополисахаридов также при концентрации 100 мкг/мл и выше.
Таблица 1
Влияние полисахаридов L. edodes БИМ F-305 Д
на фагоцитарную активность нейтрофилов
Полисахариды
Эндополисахариды
Концентрация, мкг/мл
Контроль
1
10
100
200
300
5
Фагоцитарное число
6,59
6,60
6,72
9,27*
9,33*
9,28*
BY 11136 C1 2008.10.30
Продолжение табл. 1
Полисахариды
Концентрация, мкг/мл
Фагоцитарное число
Контроль
7,61
1
7,74
Экзополисахариды, водо10
7,97
растворимая фракция
100
9,34*
200
9,38*
300
9,40*
Контроль
9,32
1
9,66
Экзополисахариды, щело10
9,73
черастворимая фракция
100
11,67*
200
11,74*
300
11,69*
Примечание: * - отличие от контроля статистически значимо при Р<0,05.
Пример 6
Глубинный мицелий гриба получают аналогично изложенному в примерах 1-4. Для
изучения иммунотропной активности использовали контрольную и опытную группу мышей, получавших ежедневно в течение 10 сут. per os глубинный мицелий гриба из расчета
2,5 г/кг. Индукция иммунного ответа производилась суспензией эритроцитов барана
(0,1 мл суспензии в концентрации 1×108 клеток/мл на мышь) по стандартной схеме иммунизации.
Исследование иммунотропной активности глубинного мицелия L. edodes БИМ F-305
Д показало, что мицелий гриба стимулировал развитие гуморального иммунного ответа,
индуцированного эритроцитами барана по стандартной схеме. Так, в опытной группе обнаружена тенденция к увеличению селезеночного индекса, числа антителообразующих
клеток селезенки. Достоверностью отличались различия титра гемагглютининов: в опытной группе мышей увеличен по сравнению с контрольной группой уровень гемагглютининов класса М. В отношении гемагглютининов класса G также прослеживалась
тенденция к увеличению (табл. 2). Гриб при введении per os меньше влиял на неспецифическую резистентность: массу тела, уровень лейкоцитов, лейкоцитарную формулу и состояние системы комплемента, на показатель специфического клеточного иммунитета,
индуцированного эритроцитами барана - реакцию гиперчувствительности замедленного
типа (ГЗТ).
Таблица 2
Влияние глубинного мицелия L. edodes БИМ F-305 Д
на специфическую резистентность
Контрольная группа
(n = 10)
0,26 ± 0,07
1,04 ± 0,38
Показатели
Опытная группа
(n = 10)
0,28 ± 0,08
1,25 ± 0,48
Масса селезенки, г
Селезеночный индекс
Число антителообразующих клеток селезенки
143,2 ± 41,6
165,8 ± 20,8
(в 1000 спленоцитов)
Титр гемагглютининов IgM, log2
3,5 ± 0,55
5,3 ± 0,52
Титр гемагглютининов IgG, log2
2,5 ± 0,5
2,9 ± 0,4
Выраженность реакции ГЗТ - индекс ГЗТ, %
6,7 ± 2,6
6,9 ± 2,9
Таким образом, использование предлагаемого штамма позволяет повысить выход биомассы, экзо- и эндополисахаридов, сократить время культивирования (табл. 3).
6
BY 11136 C1 2008.10.30
Таблица 3
Сравнительная характеристика предлагаемого нового штамма
L. edodes БИМ F-305 Д и штаммов-прототипов
Предлагаемый новый штамм L. edodes
Прототипы
БИМ F-305 Д
L. edodes IHEM 18992
L. edodes KSLE 007
Биомасса - 10,0-16,0 г/л
3,0-5,0 г/л
12,5 г/л
Время культивирования (всего: выра8-33 сут.
30 сут. (колбы)
щивание инокулюма и биомассы)
(В колбах - инокулюм) 6-21 сут.
В колбах на качалке - 14 сут.
В ферментере - 2-12,5
В ферментере - 11 сут. (7 сут. в колбах
сут. (50-300 ч)
(инокулюм), 4 сут. - ферментер)
Эндополисахарид - 8-12 %
5,8 %
либо 1,0-1,9 г/л
либо 0,7 г/л
Экзополисахарид - 4,0-5,0 г/л
0,1-0,23 г/л
Существенно и то, что у штамма обнаружены новые, не известные ранее для грибов
L. edodes свойства: высокая антиоксидантная активность, способность синтезировать значительное количество фенольных соединений - натуральных антиоксидантов, образовывать большое количество липидов с высоким содержанием (до 70 %) непредельной
линолевой кислоты, меланина - до 1,3 %.
В опытах in vitro установлено, что эндо- и экзополисахариды гриба L. edodes БИМ F305 Д оказывают стимулирующий эффект на фагоцитарную активность нейтрофилов в
концентрации свыше 100 мкг/мл.
В опытах in vivo на мышах установлено иммунотропное действие глубинного мицелия
предлагаемого штамма. Мицелий стимулировал развитие гуморального иммунного ответа, индуцированного эритроцитами барана.
Источники информации:
1. Wasser S.P., Weis A.L. Medicinal mushrooms. Lentinus edodes (Berk.) Sing. Shiitake
mushroom. - San Antonio, Haifa, Kyiv. - 1997. - 95 p.
2. Патент MD 1947F1, МПК C 12N 1/14. Опубл. 30.06.2002.
3. Патент MD 2171F1, МПК C 12N 1/14. Опубл. 31.05.2003.
4. Патент RU № 2239983, МПК A 01G 1/04; A 01G 1/04. Опубл. 20.11.2004.
5. Патент RU № 2232571, МПК A 23L 1/28; A 23L 1/28; A 61K 7/48; A 23L 1/28; A 61K
35/84. Опубл. 20.11.2004.
6. United States Patent № 2006/0094689 A1. Опубл. 4.05.2006.
7. Fuji Т., Maeda H., Suzuki F., Ishida N. Isolation and characterization of a new antitumor
polysaccharide, KS-2, extracted from culture mycelia of lentinus edodes // J. of Antibiotics.
1978. Vol. 31, Nо 11. P. 1079-1090.
8. Babitskaya V.G., Scherba V.V., Mitropolskaya N.Y. Exopolysaccharides of some medicinal mushrooms: production and composition // Int. J. of Medicinal Mushrooms. - 2000. - Vol. 2. P. 51-54.
9. Tang Y.J., Zhong J.J. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction
of polysaccharide and ganoderic acid // Enzyme and Microbial Technology. - 2002. - Vol. 31. P. 20-28.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
7
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
118 Кб
Теги
by11136, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа