close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11160

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61B 5/00
СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОГО
ПОРАЖЕНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ У КРЫСЫ
(21) Номер заявки: a 20050239
(22) 2005.03.14
(43) 2006.12.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Научно-производственный
центр "Институт фармакологии и
биохимии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Мойсеенок Андрей Георгиевич; Омельянчик Софья Николаевна; Шевалье Анна Александровна;
Евкович Инна Николаевна; Радута
Елена Францевна; Гуринович Валерий Александрович; Слышенков
Вячеслав Степанович; Пеховская
Татьяна Александровна; Петухова
Тамара Паатовна (BY)
BY 11160 C1 2008.10.30
BY (11) 11160
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Научно-производственный
центр "Институт фармакологии и биохимии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(56) АГАДЖАНОВ М.И. и др. Нейрохимия. 2000. - Т. 17. - № 4. - С. 294-297.
BY 4907 C1, 2002.
EA 004766 B1, 2004.
(57)
Способ моделирования нейродегенеративного поражения центральной нервной системы у крысы, включающий введение хлорида алюминия внутрибрюшинно в дозе 190 мг/кг
массы тела в 1 и 3 дни опыта, отличающийся тем, что дополнительно на 14 день опыта
вводят липополисахарид Escherichia coli O111:В4 подкожно в дозе, инициирующей падение уровня кофермента А в нейроструктурах головного мозга.
Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к моделированию нейродегенеративных патологических процессов центральной нервной системы,
и может использоваться для выяснения патогенеза нейродегенеративных болезней, таких
как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, рассеянный склероз, синдром Халлервордена-Спатца, боковой амниотрофический склероз и др., а также разработки патогенетических способов лечения указанных заболеваний.
В последние годы при углубленном изучении нейродегенеративного синдрома Халлервордена-Спатца доказан генетический дефект ключевого фермента биосинтеза кофермента А
(КоА) - пантотенаткиназы [1], и предложена технология патогенетической терапии с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей синтез белка пантотенаткиназы [2]. Эта
область нейрохимии и нейропатологии быстро развивается. Синдром ХаллерворденаСпатца определен как аутосомальное рецессивное нейродегенеративное заболевание,
классифицированное в нозологической форме пантотенаткиназо-ассоциированная нейро-
BY 11160 C1 2008.10.30
дегенерация (ПКАН). Особенностью последней являются клинические симптомы и патогенетические механизмы, позволяющие рассматривать ПКАН в качестве модели нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона.
Наиболее близким к заявляемому является способ моделирования нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера и других) путем введения хлористого алюминия,
вызывающего алюминиевый нейротоксикоз и приводящего к повреждению нейрональных
мембран продуктами окислительного стресса [3]. Алюминиевый нейротоксикоз как модель болезни Альцгеймера характеризуется окислительными нарушениями в гиппокампе
(нейроструктура, страдающая при болезни Альцгеймера), что позволяет ее использовать
для изучения патогенеза заболевания и нейропротекторных препаратов. В наиболее распространенном варианте моделирование осуществляется путем двукратного внутрибрюшинного введения хлорида алюминия в дозе выше 120 мг/кг массы тела белых крыс на 1-й
и 3-й день эксперимента и наблюдением морфо-биохимических нарушений на 10-14-й день
эксперимента, в том числе изменения прооксидантно-антиоксидантного равновесия [4].
Патогенетическая роль окислительного стресса (ОС) при нейродегенерации является
показанием к назначению антиоксидантной терапии данной группы заболеваний [5].
Недостатком данного способа является невозможность моделирования болезней, сочетающихся с нарушением биосинтеза КоА и развитием ОС в нейроструктурах мозга,
подверженных нейродегенеративной патологии и воспроизводящих основной патогенетический механизм (нарушение системы КоА), характерный для ПКАН. Алюминиевый токсикоз
не обеспечивает синхронного индуциирования в коре больших полушарий и гиппокампе
ОС и выраженных нейродистрофических изменений. Дополнительным фактором, важным
для процесса моделирования нейродегенеративных процессов, является сочетание нейродегенеративных и флогоинициирующих механизмов, приводящих к повышенному образованию β-амилоидного пептида, что возможно при дополнительном введении противовоспалительного агента - липополисахарида.
Задача изобретения - осуществить моделирование дегенеративных поражений нейрональных структур коры больших полушарий и гиппокампа, сочетающихся с нарушением
биосинтеза КоА и развитием окислительного стресса.
Поставленная задача решается путем внутрибрюшинного введения лабораторным животным (белые крысы линии Wistar) хлористого алюминия в дозе до 190 мг/кг массы тела
в 1 и 3 день от начала опыта, при этом отличительным моментом является то, что дополнительно на 14-й день после первой инъекции алюминия вводят подкожно препарат липополисахарида Escherichia coli O111:В4 в дозе, инициирующей падение уровня кофермента
А в нейроструктурах головного мозга.
Способ осуществляют следующим образом.
Белым крысам линии Wistar массой 180-200 г, получающим сбалансированный рацион
вивария, производят двукратное (на 1-й и 3-й день от начала эксперимента) внутрибрюшинное инъецирование раствора хлорида алюминия в дозе до 190 мг/кг массы тела и на
14-й день после первой инъекции алюминия дополнительно вводят подкожно препарат
липополисахарида (ЛПС) Escherichia coli O111:В4. Спустя 24 ч наблюдают развитие гипертермии, окислительного стресса и дегенеративные изменения в нейроструктурах головного мозга.
Целесообразность использования алюминиевого нейротоксикоза в предлагаемом способе и его выбор в качестве прототипа определяются применением данной модели для
изучения патогенеза болезни Альцгеймера, характерным дистрофическим поражением
нейронов гиппокампа и, что подтверждено нашими сравнительными исследованиями,
инициированием ОС в коре больших полушарий головного мозга и последними сообщениями литературы [6, 7].
Необходимость дополнительного введения ЛПС E.coli связана с его способностью
стимулировать накопление в нейронах белка предшественника β-амилоида [8] и вызывать
2
BY 11160 C1 2008.10.30
дегенеративные изменения в гиппокампе и энторинальной коре [9]. Однако введение ЛПС
инициирует преимущественно эндогенную интоксикацию, гипертермию и в меньшей мере, по сравнению с алюминиевым нейротоксикозом, инициирует проявления ОС.
Величины использованных доз нейротоксикантов были установлены на основании
проведения дополнительных опытных испытаний, а также путем анализа литературных
данных. Дальнейшее их повышение и изменение соотношений, описанных в способе, не
сопровождалось увеличением степени развития ОС и нарушения биосинтеза КоА. В то же
время снижение доз не приводит к необходимому эффекту.
Приводим доказательства возможности осуществления способа.
Пример 1.
Использовали 18 белых крыс-самок массой 180-200 г, разделенных на 3 группы по 6
животных в группе: 1 группа - контрольная (интактная), 2 группа - введение AlCl3 двукратно в/б в дозе 190 мг/кг за 14 дней до декапитации, 3 группа - сочетанное действие: через
14 суток после введения А1С13 в/б в дозе 190 мг/кг вводится ЛПС E. coli в дозе 400 мг/кг
за сутки до декапитации.
На окрашенных по методу Ниссля препаратах головного мозга крыс под световым
микроскопом проводили общую оценку и анализ пирамидных нейронов ганглиозного
слоя сенсомоторной коры больших полушарий и пирамидных нейронов гиппокампа белых крыс [10]. Кроме того, проводили измерение объемов ядер вышеуказанных нейронов.
Измерение объемов производилось с помощью компьютерного анализатора изображений
BIOSCAN-NT.
При введении животным AlCl3 пирамидные нейроны гиппокампа сохраняют нормальное строение. В ганглиозном слое сенсомоторной коры больших полушарий наряду с нейронами, имеющими нормальное строение, встречаются в достаточно большом количестве
патологически измененные нейроны. Для них характерны набухание и лизис цитоплазмы
и ядрышек, гиперхромное набухание с последующим гиперхроматозом и сморщиванием
нейронов.
При сочетанном действии изменения морфологии затрагивают как пирамидные нейроны ганглиозного слоя сенсомоторной коры больших полушарий, так и гиппокампа. Изменения более выражены, чем при действии одного AlCl3. В коре наблюдаются случаи
гиперхромного набухания и лизиса нейронов с очагами клеточного опустошения; гиперхроматоза и сморщивания нейронов с последующей гибелью; отека апикальных отростков. В гиппокампе наблюдаются случаи набухания и лизиса цитоплазмы с последующим
некрозом клеток.
Объемы ядер пирамидных нейронов коры и гиппокампа у подопытных животных отличаются от таковых у контрольных животных. При введении AlCl3 объемы ядер возрастают и у нейронов коры, и у нейронов гиппокампа - на 13,9 и 7,5 % соответственно. При
сочетанном действии AlCl3 и ЛПС объем ядер нейронов коры уменьшается на 10,2 %,
объем ядер нейронов гиппокампа возрастает на 12,7 %. Однако достоверные различия с
контрольными показателями наблюдаются только у нейронов коры при сочетанном действии (табл. 1).
Таблица 1
Объем ядер пирамидных нейронов ганглиозного слоя сенсомоторной коры больших
полушарий и гиппокампа (мкм)3 у животных подопытных и контрольной групп
Вид
Объем ядер нейронов % к контроль- Объем ядер нейронов % к контвоздействия
коры, мкм3
ным
гиппокампа, мкм3
рольным
AlCl3
531,54 ± 126,32
113,9
364,43 ± 64,20
107,5
AlCl3 + ЛПС
418,83 ± 12,73 *
89,8
382,09 ± 142,63
112,7
Контроль
466,53 ± 18,98
338,91 ± 82,13
* - статистически достоверные различия с контрольными показателями.
3
BY 11160 C1 2008.10.30
Таким образом, как AlCl3, так и сочетание его с ЛПС приводят к нарушениям морфологии и снижению биосинтетической активности пирамидных нейронов ганглиозного
слоя сенсомоторной коры больших полушарий и гиппокампа. При этом выраженность
влияния существенно больше при сочетанном действии вышеуказанных препаратов, когда
изменения затрагивают и нейроны коры, и нейроны гиппокампа. Для нейронов коры нарушения морфологии выражаются в гиперхромном набухании цитоплазмы, гиперхроматозе и сморщивании нейронов с последующей их гибелью. Для нейронов гиппокампа эти
нарушения выражаются в набухании и лизисе цитоплазмы с последующим некрозом клеток. На снижение биосинтетической активности в нейронах коры косвенно указывает достоверное уменьшение объемов ядер нейронов при сочетанном действии препаратов.
Результаты биохимических исследований отражены в табл. 2-5.
Таблица 2
Содержание общего КоА (нмоль/г ткани)
в гомогенатах отделов головного мозга белых крыс
Группы
Контроль
Большие полушария
Гиппокамп
109,5 ± 4,8
102,5 ± 5,1
Алюминиевый
нейротоксикоз
97,5 ± 3,7
94,5 ± 4,9
Алюминиевый
нейротоксикоз + ЛПС
88,5 ± 4,6*
82,5 ± 4,7*
Как следует из табл. 2, только сочетанное применение двух нейротоксических факторов приводит к падению системы биосинтеза КоА - важнейшего патогенетического звена
ПКАН.
Таблица 3
Антиокислительная активность (АОА) и содержание малонового диальдегида
(наработка тиобаритурат-реагирующих продуктов - ТБРП) в субклеточных
фракциях больших полушарий головного мозга белых крыс
Группы
Контроль
Алюминиевый
нейротоксикоз
Алюминиевый нейротоксикоз + ЛПС
Синаптосомально-митохондриальная фракция
АОА, мин/мг белка
1,88 ± 0,27
1,57 ± 0,18
ТБРП, нмоль/мг белка (0 мин)
10,37 ± 1,06
7,99 ± 0,17
ТБРП, нмоль/мг белка (10 мин)
25,04 ± 1,24
33,79 ± 0,46*
ТБРП, нмоль/мг белка (30 мин)
34,65 ± 1,35
47,58 ± 3,69*
Постмитохондриальный супернатант
АОА, мин/мг белка
27,94 ± 2,98
26,30 ± 2,82
1,24 ± 0,11*
7,78 ± 1,3
79,19 ± 1,44*
131,37 ± 5,78*
20,74 ± 1,99*
Из табл. 3 видно, что только при предлагаемом способе наблюдается падение общей
антиокислительной активности в синаптосомально-митохондриальной фракции больших
полушарий головного мозга, а также выраженная индуцибельность активации перекисного окисления липидов (более чем в 2 раза превосходящую таковую в прототипе модели).
Кроме того, предлагаемый способ характеризуется падением основной антиокислительной активности в растворимом компартменте клеток нервной ткани и, следовательно, высокой предрасположенностью к развитию ОС.
В табл. 4 отображена отличительная способность предлагаемого способа в инициировании ОС. Относительно прототипа выраженные и достоверные изменения зарегистрированы
в следующих лабораторных показателях плазмы крови: общие продукты окислительного
стресса, содержание малонового диальдегида, реакции эритроцитов с нильским голубым и
концентрации продуктов эндогенной интоксикации.
4
BY 11160 C1 2008.10.30
Таблица 4
Показатели окислительного стресса в крови белых крыс
Группы
Общие продукты окислительного стресса, у.е./мл плазмы
Малоновый диальдегид,
нмоль/мл плазмы
Малоновый диальдегид,
нмоль/мл взвеси эритроцитов
Малоновый диальдегид,
нмоль/г гемоглобина
Реакция с нильским голубым,
у.е./г гемоглобина
Продукты эндогенной интоксикации, у.е./мл плазмы
Контроль
Алюминиевый
нейротоксикоз
Алюминиевый нейротоксикоз + ЛПС
244,0 ± 9,83
276,0 ± 9,83*
303,0 ± 11,0*
3,87 ± 0,21
4,28 ± 0,12
4,99 ± 0,05*
4,96 ± 0,16
5,77 ± 0,07*
5,73 ± 0,09*
23,2 ± 0,84
31,7 ± 1,09*
33,2 ± 0,97*
35,7 ± 0,74
36,8 ± 0,43
37,9 ± 0,49*
0,34 ± 0,01
0,28 ± 0,02
0,64 ± 0,15*
В табл. 5 отображены показатели, характеризующие развитие ОС в коре больших полушарий головного мозга и гиппокампе, свидетельствующие, что степень нарушения системы глутатиона в нейроструктурах практически одинакова при использовании
предлагаемого способа и прототипа (алюминиевый нейротоксикоз).
Таблица 5
Показатели системы глутатиона в гомогенатах отделов головного мозга белых крыс
Группы
GSH, нмоль/мг белка
GSSG, нмоль/мг белка
GSH/GSSG
GSH, нмоль/мг белка
Группы
GSSG, нмоль/мг белка
GSH/GSSG
Алюминиевый
нейротоксикоз
Большие полушария
10,43 ± 0,24
3,37 ± 0,25*
0,33 ± 0,02
0,46 ± 0,01*
31,94 ± 1,29
7,45 ± 1,22*
Гиппокамп
8,30 ± 0,84
6,13 ± 0,92*
Алюминиевый
Контроль
нейротоксикоз
0,29 ± 0,02
0,49 ± 0,02*
27,89 ± 1,19
12,39 ± 1,22*
Контроль
Алюминиевый нейротоксикоз + ЛПС
3,83 ± 0,17*
0,45 ± 0,01*
8,60 ± 1,19*
5,17 ± 0,97*
Алюминиевый нейротоксикоз + ЛПС
0,49 ± 0,01*
10,49 ± 1,27*
* Р<0,05 по отношению к контролю.
Как следует из представленных материалов, предлагаемый способ моделирования
приводит к достоверному снижению конечного продукта пантотенаткиназной реакции КоА - в коре больших полушарий головного мозга и гиппокампе. Тем самым достигается
реализация основного патогенетического механизма ПКАН - нарушение активности биосинтеза КоА.
Таким образом, предлагаемый способ действительно приводит к существенным различиям нарушений прооксидантно-антиоксидантного равновесия в нейроструктурах по
сравнению с алюминиевым нейротоксикозом, избранным в качестве прототипа. В частности,
на фоне падения уровня КоА, в больших полушариях и гиппокампе наблюдается более
чем 2-кратный рост наработки малонового диальдегида в синаптосомально-митохонд5
BY 11160 C1 2008.10.30
риальной фракции больших полушарий головного мозга подопытных животных по сравнению с алюминиевым нейротоксикозом, а также более выраженное падение антиокислительной активности в синаптосомах и постмитохондриальном супернатанте.
Предлагаемая модель проста, воспроизводима и может быть использована для изучения патогенетических механизмов, а также для разработки способов коррекции нейродегенеративных поражений центральной нервной системы.
Источники информации:
1. Gordon N. Pantothenate kinase-associated neurodegeneration // Eur. J. Pediatr. Neurol.2002. - Vol.6. - № 5. - P. 243-247.
2. Патент WO 03008626.
3. Ваградян А.Г., Галоян А.А., Агаджанов М.И., Симонян М.А., Зильфян А.В. Исследование некоторых иммунологических и нейрохимических аспектов болезни Альцгеймера
// Нейрохимия. - 2003. - Т. 20. - № 4. - С. 290-294.
4. Агаджанов М.И., Ваградян А.Г., Симонян М.А., Галоян А.А. Влияние обогащенного
пролином синтетического пептида на содержание металлопротеинов и перекисное окисление липидов у крыс при алюминиевом нейротоксикозе (модель болезни Альцгеймера) //
Нейрохимия. -2000. - Т. 17. -№ 4. - С. 294-297.
5. Emilien G., Durlach С., Minaker K.L., Winblad В., Gauthier S., Maloteaux J.-M. Alzheimer Disease. Neuropsychology and Neuropharmacology. Burkhauser Verlag, Basel et al. 2004. - P. 182-183.
6. Ваградян А.Г. Обогащенный пролином пептид (галармин) - нейропротекторный модулятор окислительного повреждения при хронической алюминиевой интоксикации //
Нейрохимия. -2003. -Т. 20. -№ 2. -С. 139-142.
7. Закарян А.Е., Агаджанов М.И., Погосян Г.А., Ашотян А.Г., Енкоян К.Б., Галоян А.А. Фотохемилюминесценция гомогенатов органов крыс при воздействии галармина
на фоне алюминиевого нейротоксикоза // Нейрохимия. -2004. -Т. 21. -№ 2. - С. 152-157.
8. Brugg В., Dubreul Y.L., Huber S., Wollman E.E., Delhaye-Bouchaud N., Mariani J. Inflammatory processes induce β-amyloid precursor protein changes in mouse brain // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. - 1995. - Vol. 92. - P. 3032-3035.
9. Vereker E., Campbell V., Roche E., McEntee E., Lynch M.A. Lipopolysaccharide inhibits
long term potentiation in the rat dentate gyrus by activating caspase-1 // J. Biol. Chem. -2000. Vol. 275. - № 34. - P. 26252-26258.
10. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. - М.:
Наука. - 1982. - 304 с.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
117 Кб
Теги
патент, by11160
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа