close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11170

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11170
(13) C1
(19)
C 12N 1/20
C 12N 9/90
ШТАММ БАКТЕРИЙ ARTHROBACTER NICOTIANAE
БИМ В-391 Д - ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ
(21) Номер заявки: a 20061327
(22) 2006.12.22
(43) 2008.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Сапунова Леонида Ивановна; Лобанок Анатолий Георгиевич;
Казакевич Ирина Олеговна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(56) RU 2031947 C1, 1995.
JP 08187080 A, 1996.
US 4317883 A, 1982.
US 4348481 A, 1982.
US 4355103 A, 1982.
BY 11170 C1 2008.10.30
(57)
Штамм бактерий Arthrobacter nicotianae БИМ В-391 Д-продуцент глюкозоизомеразы.
Изобретение относится к микробиологии, предназначено для использования в биотехнологии получения фермента, применяемого в пищевой промышленности для производства глюкозо-фруктозного сиропа и фруктозы, и касается нового штамма - продуцента
глюкозоизомеразы.
Коммерческое применение глюкозоизомеразы, являющейся исключительно клеточносвязанным ферментом, обусловливает постоянное усовершенствование технологии ее
производства, включая поиск и селекцию не только более активных, но и технологичных
штаммов-продуцентов, в т.ч. обладающих высоким уровнем конститутивного синтеза
ферментного белка.
Известны природные штаммы прокариотических микроорганизмов pp. Aerobacter, Arthrobacter, Escherichia, Lactobacillus с невысоким уровнем конститутивного синтеза глюкозоизомеразы [1-4]. Высокой глюкозоизомеразной активностью характеризуются полученные
с использованием химических мутагенов мутантные штаммы Streptomyces coelicolor
NRRL 15398 и Streptomyces thermoviolaceus ATCC 15615 [5, 6]. Однако максимальные активность и стабильность продуцируемых указанными стрептомицетами ферментов проявляются в присутствие катионов кобальта, который является тяжелым металлом и
относится к разряду веществ, загрязняющих окружающую среду.
Наиболее близким предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является природный штамм Streptomyces olivocinereus ВКПМ S-1169 - продуцент
глюкозоизомеразы [7], обладающий высокими уровнями синтеза глюкозоизомеразы (74
ед/г сухой биомассы) и продуктивности (444 µ/мин в расчете на 1 л среды).
К недостаткам указанного штамма следует отнести следующие:
штамм продуцирует глюкозоизомеразу на обогащенных органическим азотом средах,
включающих дорогостоящие компоненты;
BY 11170 C1 2008.10.30
штамм продуцирует глюкозоизомеразу исключительно при наличии в среде культивирования специфического индуктора ксилозы;
штамм для синтеза фермента нуждается в катионах кобальта;
штамм синтезирует фермент, который эффективно катализирует реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу при наличии в реакционной среде кобальта - тяжелого металла,
требующего детоксикации;
использование штамма для получения глюкозоизомеразы, а также ферментного препарата для приготовления глюкозо-фруктозного сиропа предполагает детоксикацию отходов
микробиологического производства и дополнительную очистку получаемого пищевого
продукта от ионов кобальта.
Задачей изобретения является получение нового высокотехнологичного штамма, активно растущего на питательных средах, не содержащих дефицитных и дорогостоящих
субстратов, и характеризующегося высоким уровнем конститутивного синтеза глюкозоизомеразы, которая катализирует реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу без участия ионов кобальта.
Удовлетворяющий указанным критериям штамм получен путем направленного отбора
адаптированных к высоким концентрациям мочевины вариантов Arthrobacter nicotianae
БИМ В-5 и депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ "Институт
микробиологии НАН Беларуси" под регистрационным номером БИМ В-391Д.
Штамм при внутрижелудочном, внутрибрюшинном и интраназальном введении не
оказывает патогенного, токсигенного и токсического действия на лабораторных белых
мышей, крыс и морских свинок.
Штамм без потери культурально-морфологических и физиолого-биохимических
свойств, в том числе и глюкозоизомеразной активности, длительно хранится в лиофильно
высушенном состоянии, а также при +4 °С на агаризованных средах с мочевиной под слоем вазелинового масла и методом периодических пересевов дважды в год.
Культурально-морфологические свойства. Относится к группе актино-бактерий. На
агаризованной среде с глюкозой и мочевиной образует колонии правильной круглой формы
диаметром 2-3 мм с конусовидным профилем, непрозрачные. Окраска колоний сначала
светло-бежевая, с возрастом приобретающая зеленоватый оттенок. Поверхность колоний
гладкая, блестящая, край ровный, структура гомогенная, консистенция маслообразная.
Клетки бактерий сначала круглые, собранные в цепочки, а затем удлиняющиеся и распадающиеся на группы, по 1-3 в каждой.
Окраска по Граму положительная. Эндоспоры отсутствуют.
Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Оптимальные условия для
роста - рН 6,0-8,0 и температура 27-29 °С.
Хемоорганотроф. Ассимилирует глюкозу, сахарозу, лактозу, галактозу, ксилозу, арабинозу, рамнозу, фруктозу, мальтозу, дульцит, инозит, ксилит, сорбит, маннит, глицерин,
этанол, пектин, органические кислоты - лимонную, уксусную, пировиноградную, янтарную, фумаровую. Гидролизует ксилан, крахмал и пектин. На среде с ксилозой образует
полисахарид.
Усваивает аммонийную и белковую формы азота; желатину и казеин разжижает, молоко пептонизирует. Нитраты не утилизирует.
Клетки штамма Arthrobacter nicotianae БИМ В-391Д при глубинном выращивании на
питательных средах, содержащих, как минимум, по одному из указанных выше субстратов в качестве источников углерода и азота, характеризуются способностью эффективно
трансформировать D-глюкозу в D-фруктозу.
Реакционная смесь для определения глюкозоизомеразной активности штамма включает:
0,2 мл 1 М раствора глюкозы, 0,5 мл 0,2 М K,Na-фосфатного буфера, рН 7,8; 0,1 мл 0,1 М
MgSO4⋅7H2O; 0,2 мл суспензии клеток бактерий и дистиллированную воду до объема 2 мл.
2
BY 11170 C1 2008.10.30
За единицу глюкозоизомеразной активности принимают такое количество фермента,
которое при 70 °С и рН 7,8 за 1 мин трансформирует 1 мкмоль D-глюкозы в D-фруктозу.
Ферментативную активность штамма выражают в единицах ферментативной активности в
расчете на 1 г сухой биомассы (ед/г), продуктивность - в мкмоль фруктозы, образовавшейся в реакции изомеризации за 1 мин, в расчете на 1 л культуральной жидкости
(µМ/мин⋅л).
Определение D-фруктозы проводят цистеин-карбазольным методом [8].
Суть изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Питательная среда для культивирования актинобактерий Arthrobacter nicotianae БИМ
В-391Д - продуцента глюкозоизомеразы содержит (в %): К2НРО4 - 0,3 и MgSO4⋅7H2O - 0,1,
качественный и количественный состав источников углеродного и азотного питания приведен в табл. 1.
Таблица 1
Характеристика глюкозоизомеразной активности заявляемого штамма,
растущего на средах различного состава, и штамма-прототипа
Источники
питания
Ксилоза
Глюкоза
Пептон
Кукурузный
экстракт
Мочевина
СоС12⋅6Н2О
Глюкозоизомераза
Концентрация
Наличие источника питания в среде культивирования*:
источника
Streptomyces olivocinereus
питания, % Arthrobacter nicotianae БИМ В-391Д
ВКПМ S-1169 (прототип)
0,5
+
+
+
0,5
+
+
+
+
+
+
1,0
+
+
+
+
+
2,0
+
+
+
-
+
-
+
0,25
+
+
+
+
0,015
+
+
ед/г
125 116 130 135 128 129
74
698 695 712 718 720 715
444
µМ/мин⋅л
Примечание: ( + ) - источник питания присутствует; (-) - источник питания отсутствует
В качестве посевного материала применяют водную суспензию бактерий (0,5⋅1071⋅107 клеток/мл среды), выращенных на глюкозо-мочевинном агаре при 28-29 °С в течение 3 сут.
Глубинное выращивание штамма проводят в 250 мл колбах Эрленмейеpa, содержащих
50 мл стерильной питательной среды различного состава, на биологической качалке (180200 об/мин) в течение 60-72 ч при 27-29 °С.
По окончании культивирования клетки бактерий отделяют центрифугированием (6000
g, 20 мин), промывают дистиллированной водой и используют для определения глюкозоизомеразной активности.
По сравнению со штаммом-прототипом предлагаемый штамм Arthrobacter nicotianae
БИМ В-391Д характеризуется существенно более высокими показателями уровня синтеза
фермента (в 1,57-1,82 раза) и продуктивности (в 1,57-1,62). Причем, указанный результат
достигается при использовании для выращивания штамма-продуцента питательных сред,
не содержащих специфический субстрат - ксилозу, а также дорогостоящих, ростактивирующих и требующих детоксикации соединений.
Пример 2.
Питательная среда для культивирования актинобактерий Аrthrobacter nicotianae БИМ
В-391Д содержит (в %): мочевину - 0,25; К2НРО4 - 0,3; MgSO4⋅7H2O - 0,1 и один из приведенных в табл. 2 источников углеродного питания. Условия культивирования описаны в
примере 1.
3
BY 11170 C1 2008.10.30
Таблица 2
Глюкозоизомеразная активность заявляемого штамма в зависимости
от утилизируемого источника углерода
Глюкозоизомеразная активность:
ед/г
µМ/мин⋅л
Ксилоза
120±1,7
612±10
Глюкоза
132±1,9
712±12
Фруктоза
125±2,0
450±8
Дульцит
78±2,1
425±13
Инозит
75±2,3
457±11
Ксилит
84±2,5
496±15
Манит
83±2,1
453±13
Сорбит
82±1,9
446±8
Лактоза
80±1,8
480±10
Сахароза
90±2,4
549±15
Крахмал*
94±3,0
489±7
Ксилан*
87±2,1
583±15
Пектины: свекловичный*
88±1,3
634±12
цитрусовый*
90±1,7
648±13
яблочный*
95±2,0
703±16
Кислота лимонная
99±1,5
436±9
Примечание: * - источник углерода вносили 1 % по весу
Заявляемому штамму присущ конститутивный характер синтеза фермента, что обеспечивает его несомненное технологическое преимущество (возможность неограниченного
выбора источников углеродного питания) перед штаммом-прототипом, продуцирующим
глюкозоизомеразу исключительно при наличии в среде культивирования ксилозы.
Пример 3.
Масштабирование процесса культивирования штамма-продуцента осуществляют в
ферментере объемом 100 л. Условия культивирования и состав питательной среды, как в
примере 2, за исключением того, что в качестве дешевого источника углерода используют
отход производства кристаллической глюкозы из крахмала - зеленую патоку в количестве
1,5-2 % в пересчете на содержание в ней глюкозы.
Глюкозоизомеразная активность Arthrobacter nicotianae БИМ В-391Д составляет 135 ед/л,
продуктивность - 750 µМ/мин⋅л.
Пример 4.
При установлении влияния катионов кобальта на активность глюкозоизомеразы, продуцируемой предлагаемым штаммом, выращенную в ферментере (пример 3) биомассу
бактерий отделяют от культуральной жидкости, промывают дистиллированной водой,
подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугируют (10000 g, 30 мин). Фермент,
содержащийся в бесклеточном экстракте (супернатанте), подвергают исследованию. Реакционная смесь для определения активности содержит: 0,2 мл 1 М раствора глюкозы, 0,5
мл 0,2 М К,Na-фосфатного буфера, рН 7,8; 0,1 мл 0,1 М MgSO4⋅7H2O; 0,2 мл ферментного
раствора, 0-0,1 % СоС12⋅6Н2О и дистиллированную воду до объема 2 мл.
В отличие от глюкозоизомеразы штамма-прототипа, фермент актинобактерий Arthrobacter nicotianae БИМ В-391Д не требует присутствия в реакционной среде катионов кобальта для эффективной изомеризации глюкозы во фруктозу (табл. 3). Указанное свойство
фермента является одним из неоспоримых преимуществ заявляемого штамма, которое исключает необходимость очистки глюкозо-фруктозного сиропа, производимого ферментативным путем, от тяжелого металла - кобальта.
Источник углерода, 1 % по углероду
4
BY 11170 C1 2008.10.30
Таблица 3
Влияние катионов кобальта на активность глюкозоизомеразы
Streptomyces olivocinereus
Arthrobacter nicotianae БИМ В-391Д
ВКПМ S-1169 (прототип)
СоС12⋅6Н2O, %
% к максимуму
% к максимуму
µM/мин⋅л
µМ/мин⋅л
0
712
100
нет данных
0,010
712
100
нет данных
0,025
710
99,7
444
100
0,050
695
97,6
нет данных
0,100
650
91,3
нет данных
В табл. 4 суммированы данные, касающиеся экономики технологических стадий поддержания предлагаемого штамма и штамма-прототипа, получения посевного материала и
культивирования. Как видно, заявляемый штамм в 1,6-1,82 раза превосходит штамм-прототип
по глюкозоизомеразной активности (127-135 ед/г) и продуктивности (710-750 µM/мин⋅л).
При этом указанный эффект достигается за существенно более короткий промежуток времени (126-156 ч против 206-216 ч) и при использовании в технологическом процессе
более простых и дешевых питательных сред.
Таблица 4
Сравнительная характеристика экономичности технологических стадий
поддержания штаммов-продуцентов глюкозоизомеразы,
получения посевного материала и культивирования
Наличие параметра сравнения
в среде культивирования*:
Питательные
Параметры сравнения
Arthrobacter
Streptomyces olivoсреды
nicotianae БИМ cinereus ВКПМ S-1169
В-391Д
(прототип)
ксилоза
+
глюкоза
+
+
Для поддержамочевина
+
ния штамма
+
СоС12⋅6Н2О
длительность выращивания, ч
72
120
ксилоза
+
глюкоза
+
+
+
Для приготовле- мочевина
ния посевного пептон
+
материала:
кукурузный экстракт
+
+
СоС12⋅6Н2О
длительность выращивания, ч
18-24
72
ксилоза
+
глюкоза
+
+
мочевина
+
пептон
+
Для культивиро+
вания штамма- кукурузный экстракт
продуцента
+
СоС12⋅6Н2О
длительность выращивания, ч
36-60
14-24
127-135
74
глюкозоизомераз- ед/г
ная активность:
710-750
444
µМ/мин⋅л
Примечание: "+" - присутствует; "-" - отсутствует
5
BY 11170 C1 2008.10.30
Таким образом, заявляемый штамм Arthrobacter nicotianae БИМ В-391Д по важнейшим
показателям - глюкозоизомеразной активности, продуктивности, технологичности - превосходит известные аналоги и может использоваться для разработки экономичной ресурсосберегающей технологии получения ферментного препарата глюкозоизомеразы, предназначенного
для производства глюкозо-фруктозного сиропа - натурального заменителя сахара диетического и лечебно-профилактического питания.
Источники информации:
1. Yamanaka К.//Agr. Biol. Chem. - 1963. - Vol. 27. - № 4. - P. 271-278.
2. Natake M., Yoshimura S.//Agr. Biol. Chem. - 1963. - Vol. 27. - № 5. - P. 342-348.
3. Natake M., Yoshimura S.//Agr. Biol. Chem. - 1964. - Vol. 28. - № 8. - P. 505-509.
4. Ананьин В.М., Головлев Е.Л.//Прикладная биохимия и микробиология. - 1981. Т. 17. - № 6. - С. 826-831.
5. Патент США 4 532 208, МПК С12Р 19/24, 9/92, C12N 1/20, C12R 1/465, 1985.
6. Патент США 4 551 430, МПК С12Р 19/24, 9/92, C12N 1/20, C12R 1/465, 1985.
7. Патент России 2 031 947, МПК C12N 9/92, C12R 1:465, 1995.
8. Dische Z., Borenfreund E.//J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 192. - P. 583-587.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
118 Кб
Теги
by11170, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа