close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11205

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/48
G 01N 33/48
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАНТОТЕНАТКИНАЗЫ
(21) Номер заявки: a 20051115
(22) 2005.11.22
(43) 2007.08.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Научно-производственный
центр "Институт фармакологии и
биохимии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Мойсеенок Андрей Георгиевич; Гуринович Валерий Александрович; Петухова Тамара Паатовна (BY)
BY 11205 C1 2008.10.30
BY (11) 11205
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Научно-производственный центр "Институт фармакологии и
биохимии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) ГУРИНОВИЧ В.А. Биотрансформация
и протеидизация производных пантотеновой кислоты в печени животных:
Автореф. дис. - Гродно, 2003. - С. 5-9.
МОЙСЕЕНОК А.Г. Биосинтез кофермента А в метаболической активности
производных пантотеновой кислоты:
Автореф. дис. - М., 1996. - С. 9-10.
WO 2003/008626 A2.
JP 62166896 А, 1987.
(57)
Способ определения активности пантотенаткиназы, включающий проведение фосфорилирования пантотенаткиназой 14С-меченого пантотената натрия в инкубационной смеси
с pH 6,5, содержащей 0,05 М трис-малеатный буфер, 5 мкмоль АТФ, 5 мкмоль MgCl2, выделение 4'-фосфо-пантотеновой кислоты из смеси и определение активности пантотенаткиназы по количеству 14С-меченой 4'-фосфо-пантотеновой кислоты, отличающийся тем,
что выделение 14С-меченой 4'-фосфо-пантотеновой кислоты осуществляют путем обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии на аналитической колонке
4×250 мм, заполненной бондапаком C18, в течение 6 мин.
Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биохимии и может
использоваться для определения активности пантотенаткиназы.
Пантотенаткиназа (АТФ:Д-пантотенат-4'-фосфотрансфераза, КФ 2.7.1.33) является
ключевым ферментом цепи реакций, приводящих к образованию кофермента А из пантотеновой кислоты и других предшественников, и основным механизмом регуляции биосинтеза кофермента А - важнейшего кофактора метаболических путей высших и низших
организмов.
В последние годы появилось значительное число работ, обусловленное открытием генетического дефекта пантотенаткиназы при нейродегенеративном синдроме [Gordon N.
Pantothenate kinase - associated neurodegeneration // Eur. J. Pediatr. Neurol. - 2002. - Vol. 6. № 5. - P. 243-247], а также разработана технология патогенетической терапии на основе
нуклеиновой кислоты, кодирующей синтез белка пантотенаткиназы [патент WO
03008626]. Значение данного направления исследований и углубленное изучение пантоте-
BY 11205 C1 2008.10.30
наткиназо-ассоциированной нейродегенерации объясняется этиопатогенетической близостью синдрома таким широко распространенным нейродегенеративным заболеваниям, как
болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, боковой амиотрофический синдром,
рассеянный склероз. В 2005 г. исследование пантотенаткиназы предложено как биомаркер
на развитие стафилококковой инфекции [патент GB 2387600].
Основным препятствием развития этих исследований является отсутствие доступного
метода изучения активности пантотенаткиназы, позволяющего осуществлять лабораторный анализ in vivo как при моделировании нейродегенеративной патологии, так и при исследовании клеток крови человека с диагностическими и прогностическими целями.
Известен метод определения активности пантотенаткиназы, основанный на анализе
убыли субстрата реакции - пантотеновой кислоты - с использованием микробиологического метода исследования витамина специфической тест-культурой [Abiko Y. Investigations on Pantothenic Acid and Its Related Compounds. IX Biochemical Studies. Separation and
Substrate Specificity of Pantothenate Kinase and Phosphopantothenoylcysteine Synthetase //
J. Biochem - 1967. - Vol. 61. - № 3. - P. 290-298].
Основным недостатком метода, ограничивающим его широкое использование, является громоздкость, длительность и трудновоспроизводимость микробиологического
анализа, малодоступность тест-микроорганизмов и невозможность применения в диагностических целях.
Известны способы определения активности пантотенаткиназы на основе радиометрического подхода с использованием меченого радионуклида пантотеновой кислоты. Такие
методы и их модификации успешно применены в изучении свойств пантотенаткиназы,
выделенных из различных источников, при клонировании фермента, как с использованием меченого витамина [Rock С.О., Calder R., Karim V., Jackowski S. Pantothenate Kinase
Regulation of the Intracellular Concentration of Coenzyme A // J. Biol. Chem. - 2000. Vol. 275. - № 2. - P. 1377-1383], так и с использованием второго субстрата реакции, позволяющего анализировать фосфорилированный продукт ферментативного превращения [патент США 6.720.162].
Недостатком этих методов является использование устаревшего метода ионообменной
хроматографии (ИОХ), требующего значительных затрат времени и не позволяющего
осуществлять массовые исследования.
Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности пантотенаткиназной реакции по наработке в ферментативной системе 4'-фосфо-пантотеновой
кислоты, т.е. продукта реакции с использованием ИОХ [Хомич Т.И., Воскобоев А.И.,
Черникевич И.П., Мойсеенок А.Г. Радиометрический метод определения активности АТР:
Д-пантотенат-4'-фосфотрансферазы // Вопр. мед. химии. - 1984. - Т. 30. - № 1. - С. 131132].
Недостаток способа заключается в длительности, недостаточно высокой специфичности и невозможности использования для массовых исследований.
Задача изобретения - сократить время проведения анализа и повысить специфичность
способа.
Поставленная задача решается путем разделения пробы радиоактивного витамина на
субстрат - пантотеновую кислоту и продукт реакции - 4'-фосфо-пантотеновую кислоту в
результате проведения ферментативной реакции в инкубационной среде, обеспечивающей
ее оптимальное течение, при этом отличительным моментом является то, что для выделения 14С-меченого продукта реакции осуществляют обращенно-фазную высокоэффективную жидкостную хроматографию пробы, используя аналитическую колонку (4 × 250 мм),
заполненную бондапаком C18, в течение 6 мин.
Способ осуществляют следующим образом. Аликвоту инкубационной среды после
депротеинизации (150 мкл) фильтруют через фильтр 0,45 мкм и 50 мкл вводят в хроматограф. Осуществляют обращенно-фазную высокоэффективную жидкостную хроматогра2
BY 11205 C1 2008.10.30
фию (ВЭЖХ) меченой пробы, используя аналитическую колонку (4 × 250 мм), заполненную бондапаком С18. Время разделения одной пробы на колонке составляет 6 мин. Осуществляют изократное элюирование подвижной фазой, содержащей 50 мМ калийфосфатный буфер, pH 5,0 и метанол в соотношении (91,5 : 8,5; v/v). Фракции собирают по
0,8 мл и определяют в них радиоактивность субстрата и продукта пантотенаткиназной реакции после внесения аликвоты полученного супернатанта во флаконы с диоксановым
сцинтиллятором.
Целесообразность использования ВЭЖХ в качестве ключевого элемента, позволяющего изолировать продукт пантотенаткиназной реакции в предлагаемом способе, определяется высокой специфичностью метода, скоростью разделения и возможностью
массового исследования (до 3-4 проб в час).
Таблица 1
Сравнительная характеристика предлагаемого способа и прототипа
Общее время 1 ана- Количество проб
Характер выделения про- Время вылиза (с подготовкой в одновременСпособ дукта, степень его выхо- деления,
колонки и инкубаци- ном исследовада
мин
ей), час
нии
Предла- ВЭЖХ, 45 % при содергаемый
жании белка 3 мг/мл ин6
2
64 пробы/16 ч
способ
кубационной среды
ИОХ, 29,1 % при содерПрототип жании белка 3 мг/мл ин95
10,5
10 проб/11,5 ч
кубационной среды
Приводим доказательства возможности осуществления метода.
Пример 1.
Использование метода ВЭЖХ для определения активности пантотенаткиназы в печени крысы.
Пантотенаткиназную реакцию проводили в течение 1 часа при 37 °С. Состав инкубационной смеси: 0,05 М трис-малеатный буфер (pH 6,5), 5 µмоль АТФ, MgCl2 5 µмоль,
14
С-ПАК 2,5⋅10-8 М, пантотенат натрия 6⋅10-5 М и источник фермента (цитозоль печени
крыс, полученный после центрифугирования гомогената печени 1 час при 10000 g) в общем объеме 1 мл. В контрольную пробу источник фермента добавляли непосредственно
перед остановкой реакции. Реакцию останавливали помещением пробирок с инкубационной средой в кипящую водяную баню на 3 мин. Образцы центрифугировали 10 мин при
700 g.
Содержание 4'-фосфопантотената рассчитывали исходя из известной удельной радиоактивности [14С]-пантотената.
150 мкл супернатанта инкубационной среды фильтровали через фильтр 0,45 мкм и
50 мкл вводили в хроматограф. Хроматографирование осуществляли в режиме изократической элюции на хроматографе "Ликвохром-2010" с УФ-детектором, насос высокого давления ЛКБ 2150, скорость элюции 0,8 мл/мин. В качестве подвижной фазы применяли
50 мМ калий-фосфатный буфер pH 5,0 - метанол, (91,5 : 8,5) (v/v). Скорость элюции
0,8 мл/мин. При анализе смеси стандартов пантотеновой кислоты (ПК) и фосфопантотената (ФПК) измеряли абсорбцию при 210 нм. Подсчет радиоактивности субстрата и продукта пантотенаткиназной реакции осуществляли внесением содержимого фракций во
флаконы с диоксановым сцинтиллятором с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика "Mark-2". Время удерживания для фосфопантотената и пантотената было
4 и 5,5 мин соответственно.
На фиг. 1 показана радиохроматограмма депротеинизированного супернатанта инкубационной смеси (1-3 - реакционная смесь, содержащая экстракт печени крысы), отражающая воспроизводимость способа.
3
BY 11205 C1 2008.10.30
В табл. 2 представлены результаты определения активности пантотенаткиназы в печени крысы, 1-3 - три параллельных опыта, содержание белка равно 1 мг/мл инкубационной
среды.
Таблица 2
Активность пантотенаткиназы
Удельная активность пантотенаткиназы
Опыт
(нмоль ФПК в час)
(нмоль ФПК мг белка-1·ч-1)
1
9,8
10 ± 0,15
2
10,3
3
9,9
Пример 2.
Использование метода ВЭЖХ для определения зависимости активности пантотенаткиназы из печени крысы от количества белка.
Исследовали применение метода ВЭЖХ для выделения продукта реакции в случае
внесения в реакционную среду количества белка от 0,5 до 4 мг/мл. Другие компоненты,
вносимые в смесь, были аналогичны, как и в примере 1.
На фиг. 2 показана радиохроматограмма, отражающая образование продукта пантотенаткиназной реакции (ФПК) в зависимости от концентрации белка в 1 мл инкубационной
смеси.
В табл. 3 представлены результаты определения активности пантотенаткиназы в печени крысы в зависимости от концентрации белка в 1 мл инкубационной смеси.
Таблица 3
Удельная активность
Активность
Белок, мг/мл инкубаципантотенаткиназы
пантотенаткиназы
%
онной смеси
-1 -1
(нмоль ФПК в ч)
(нмоль ФПК⋅мг белка ·ч )
0,5
5,98
11,96
9
1
8,52
8,52
14
2
19,36
9,68
32
3
26,98
8,99
45
4
32,18
8,04
54
Примечание: % - указана степень фосфорилирования субстрата.
Таким образом, приведенные примеры свидетельствуют о специфичности способа, его
воспроизводимости и скорости анализа, превышающих аналогичные параметры прототипа. Все это позволяет использовать его для массовых исследований биологического материала с фармакологическими, диагностическими и прогностическими целями.
Фиг. 1
ВЭЖХ депротеинизированного супернатанта инкубационной смеси (1-3-реакционная
смесь, содержащая экстракт печени крысы). ПАК - пантотеновая кислота, субстрат реакции; ФПК - фосфопантотеновая кислота, продукт реакции.
4
BY 11205 C1 2008.10.30
Фиг. 2
Радиохроматограмма, отражающая использование субстрата (ПАК) и образование продукта пантотенаткиназной реакции (ФПК) в зависимости от концентрации белка 1 мл инкубационной смеси.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
152 Кб
Теги
by11205, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа