close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11240

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/02
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕВОМИЦЕТИНА В МОЛОКЕ
(21) Номер заявки: a 20060502
(22) 2006.05.25
(43) 2006.12.30
(71) Заявитель: Учреждение образования
"Могилевский государственный университет продовольствия" (BY)
(72) Авторы: Шуляк Татьяна Леонидовна;
Коротченко Наталья Федоровна (BY)
(73) Патентообладатель: Учреждение образования "Могилевский государственный университет продовольствия"
(BY)
BY 11240 C1 2008.10.30
BY (11) 11240
(13) C1
(19)
(56) Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению
остаточных количеств левомицетина в
продуктах животного происхождения. Минск-Москва, 1991.
Инструкция 4.1.10-15-59-2005. Определение левомицетина в продуктах животного происхождения. - Минск, 2005.
ГОСТ Р 51600-2000. Молоко. Методы
определения антибиотиков.
EP 0285792 A1, 1988.
GB 2026693 A, 1980.
RU 2180748 C1, 2002.
LONG R.A. et al. / Journal of Agricultural
and Food Chemistry. - 1990. - V. 38. № 2. - P. 427-429.
WO 2005/010168.
SU 1702302 A1, 1991.
(57)
Способ определения левомицетина в молоке, включающий отбор пробы, восстановление левомицетина до аминопроизводного добавлением соляной кислоты, диазотирование
аминопроизводного левомицетина и оценку окраски пробы, отличающийся тем, что пробу молока отбирают объемом 2-5 мл, восстановление левомицетина до аминопроизводного проводят концентрированной соляной кислотой объемом 0,6-1,2 мл в присутствии
цинковой пыли в количестве 0,02-0,04 г, смесь выдерживают 5 мин при комнатной температуре и затем 5 мин на водяной бане при температуре 58-62 °С, диазотирование аминопроизводного левомицетина проводят 10 %-ным раствором нитрита натрия в смеси с
концентрированной соляной кислотой в соотношении 100:1 объемом 0,3-0,7 мл, после чего смесь встряхивают и выдерживают в течение 1-2 мин, затем фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный фильтрат добавляют β-нафтол в виде 2 %-ного
раствора в 40 %-ном растворе гидроокиси натрия в количестве 1-2 капель, смесь тщательно перемешивают и при появлении красной окраски через 30-60 с делают вывод о наличии левомицетина в молоке.
Изобретение относится к молочной промышленности и может быть использовано для
контроля сырого молока на наличие антибиотика левомицетина.
Известен способ определения левомицетина в молоке, включающий отбор пробы и
подготовку ее к анализу, восстановление левомицетина до аминопроизводного добавлением соляной кислоты, диазотирование аминопроизводного левомицетина и оценку окраски
BY 11240 C1 2008.10.30
пробы. Подготовку пробы к анализу осуществляют путем экстракции левомицетина органическим растворителем, далее пробу концентрируют выпариванием, полученный экстракт
подвергают хроматографическому разделению, идентифицируют и ориентировочно оценивают концентрацию левомицетина в экстракте. Восстановление левомицетина в пробе
осуществляют 10 %-ным раствором соляной кислоты. Диазотирование проводят продувкой
азота. Окрашивание достигают путем взаимодействия пробы с n-диметиламинобензальдегидом. Появление желтых пятен на хроматографической пластине свидетельствует о
наличии левомицетина в пробе.
Недостатками известного способа являются длительность и трудоемкость. Для реализации способа необходимо сложное и дорогостоящее оборудование, особо чистые реактивы и стандарты, наличие высококвалифицированного персонала. Данный метод не может
использоваться для повседневного контроля молока на молочных заводах.
Задачей настоящего изобретения является упрощение способа, обеспечение его экспрессности.
Технический результат достигается тем, что в способе определения левомицетина в
молоке пробу молока отбирают объемом 2-5 мл, восстановление левомицетина до аминопроизводного проводят концентрированной соляной кислотой объемом 0,6-1,2 мл в присутствии цинковой пыли в количестве 0,02-0,04 г, смесь выдерживают 5 мин при комнатной
температуре и затем 5 мин на водяной бане при температуре 58-62 °С, диазотирование
аминопроизводного левомицетина проводят 10 %-ным раствором нитрита натрия в смеси
с концентрированной соляной кислотой в соотношении 100:1 объемом 0,3-0,7 мл, после
чего смесь встряхивают и выдерживают в течение 1-2 мин, затем фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный фильтрат добавляют β-нафтол в виде 2 %-ного
раствора в 40 %-ном растворе гидроокиси натрия в количестве 1-2 капель, смесь тщательно перемешивают и при появлении красной окраски через 30-60 с делают вывод о наличии левомицетина в молоке.
Молоко представляет собой сложную многокомпонентную систему, в которой содержатся вещества, способные реагировать с используемыми реактивами аналогично левомицетину. Прежде всего, это относится к белкам, содержащимся в молоке в значительных
количествах (2,7-3,3 %) и имеющим в своей структуре аминогруппы NH2 и ароматические
бензольные ядра подобно аминопроизводному левомицетина. Поэтому без исключения
влияния белков на протекание химической реакции на левомицетин и без использования
определенных приемов реализации способа невозможно обнаружение микроколичеств
левомицетина в молоке.
Согласно предлагаемому способу пробу молока отбирают объемом 2-5 мл. Так как
молоко является жидкостью, то более простым и целесообразным способом отбора пробы
является отбор по объему, а не по массе.
В предлагаемом способе соляная кислота используется не только для восстановления
левомицетина до аминопроизводного, но и для коагуляции основного белка молока - казеина. Выпадение казеина в осадок резко снижает его реакционную способность, что позволяет исключить влияние белка на ход протекания реакции на левомицетин. Для
коагуляции казеина и полного восстановления левомицетина, содержащегося в 2-5 мл молока, необходимо 0,6-1,2 мл концентрированной соляной кислоты. Использование кислоты в концентрированном виде позволяет в минимальной степени разбавлять пробу молока
и тем самым повысить чувствительность способа.
Согласно химизму способа:
H HN COCHCl2
H HN COCHCl2
O2N
C C CH2OH
Zn
HCl(H2↑)
OH H
левомицетин
H2N
C C CH2OH
аминопроизводное левомицетина
2
BY 11240 C1 2008.10.30
NaNO 2
H HN COCHCl 2
N≡N +
C C CH 2OH
HCl
Cl-
OH H
диазосоединение
OH
H HN COCHCl 2
N=N
NaOH
C C CH2OH
OH H
азокраситель красного цвета ,
соляная кислота необходима также и на стадии диазотирования аминопроизводного левомицетина нитритом натрия.
В предлагаемом способе невозможно использовать соляную кислоту в избытке один
раз на стадии восстановления левомицетина, так как казеин, выпавший в осадок, начинает
повторно растворяться, что в конечном итоге отрицательно влияет на ход протекания реакции на левомицетин (появляется красное окрашивание пробы молока, не содержащего
левомицетин). Поэтому соляная кислота применяется дважды: на стадии восстановления
левомицетина и на стадии диазотирования. Результаты хорошо воспроизводятся при использовании для диазотирования аминопроизводного левомицетина смеси 10 %-ного раствора нитрита натрия с концентрированной соляной кислотой в соотношении 100:1 объемом
0,3-0,7 мл. Использование 10 %-ного раствора нитрита натрия без соляной кислоты не позволяет получать стабильной красной окраски при наличии левомицетина в молоке.
Для прохождения любой химической реакции необходим определенный промежуток
времени. Для реакции восстановления микроколичеств левомицетина, содержащегося в
2-5 мл молока, до аминопроизводного необходимо 10 мин, причем в течение первых 5 мин
реакция протекает при комнатной температуре, а затем 5 мин при нагревании на водяной
бане. В течение первых 5 мин хватает собственной теплоты реакции на восстановление
левомицетина до аминопроизводного. Дальнейшее протекание реакции обеспечивается за
счет внешнего подвода тепла от водяной бани, причем температура водяной бани должна
составлять 58-62 °С. Указанная температура водяной бани обеспечивает интенсивное протекание реакции восстановления левомицетина и исключает денатурацию сывороточных
белков молока при нагревании. Как известно, при температуре 63 °С и выше происходит
денатурация сывороточных белков молока, при этом ранее "скрытые" группы сывороточных
белков (в частности, аминогруппы NH2) высвобождаются, их реакционная способность
возрастает, и они могут вступать в реакцию с используемыми реактивами аналогично левомицетину, вызывая появление красного окрашивания пробы молока, не содержащего
левомицетин.
Для обеспечения полного протекания реакции диазотирования аминопроизводного левомицетина во времени и получения наиболее стабильных результатов необходима выдержка
пробы молока после добавления смеси 10 %-ного нитрита натрия с концентрированной
соляной кислотой в соотношении 100:1 в течение 1-2 мин. Такая выдержка позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты и не растягивать анализ во времени.
3
BY 11240 C1 2008.10.30
В предлагаемом способе необходимым приемом является фильтрование пробы через
двухслойный марлевый фильтр, что позволяет отделить осадок белка и повысить яркость
получаемой окраски.
Для образования азокрасителя красного цвета взаимодействие диазосоединения с β-нафтолом должно происходить в щелочной среде. Наиболее яркое красное окрашивание пробы
наблюдается при использовании 2 %-ного раствора β-нафтола в 40 %-ном растворе гидроокиси натрия в количестве 1-2 капель. Использование 40 %-ного раствора щелочи позволяет создать щелочную среду при минимальном использовании реактива (1-2 капли), что
в свою очередь повышает чувствительность способа, так как проба практически не разбавляется.
Окраску пробы молока необходимо оценивать через 30-60 с после добавления 2 %-ного
раствора β-нафтола в 40 %-ном растворе гидроокиси натрия. Эта выдержка является достаточной, чтобы реакция образования азокрасителя прошла полностью, и наблюдалось
стабильное красное окрашивание.
Способ определения левомицетина в молоке осуществляется следующим образом.
В чистую пробирку отбирают 2-5 мл исследуемого молока, добавляют пипеткой
0,6-1,2 мл концентрированной соляной кислоты и цинковую пыль в количестве 0,02-0,04 г.
Содержимое пробирки тщательно встряхивают, выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 5 мин на водяной бане при температуре 58-62 °С. После
этого в пробирку добавляют 0,3-0,7 мл смеси 10 %-ного раствора нитрита натрия с концентрированной соляной кислотой в соотношении 100 : 1, встряхивают и выдерживают в
течение 1-2 мин. Содержимое пробирки фильтруют через двухслойный марлевый фильтр,
в полученный фильтрат добавляют 1-2 капли 2 %-ного раствора β-нафтола в 40 %-ном
растворе гидроокиси натрия, тщательно перемешивают. При появлении красной окраски
через 30-60 с делают вывод о наличии левомицетина в молоке.
Пример 1
В молоко, отсутствие левомицетина в котором подтверждено стандартизированным в
Республике Беларусь хроматографическим методом, добавляют левомицетин в концентрации 1,5 мкг/г. В чистую пробирку отбирают 2 мл исследуемого молока. К молоку добавляют пипеткой 0,6 мл концентрированной соляной кислоты и цинковую пыль в
количестве 0,02 г. Содержимое пробирки тщательно встряхивают, выдерживают в течение
5 мин при комнатной температуре и в течение 5 мин на водяной бане при температуре
58 °С. После этого в пробирку добавляют 0,3 мл смеси 10 %-ного раствора нитрита натрия
с соляной кислотой в соотношении 100:1, встряхивают и выдерживают в течение 1 мин.
Содержимое пробирки фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный
фильтрат добавляют 1 каплю 2 %-ного раствора β-нафтола в 40 %-ном растворе гидроокиси натрия, тщательно перемешивают. Через 30 с оценивают окраску содержимого пробирки. Содержимое пробирки имеет красное окрашивание.
Пример 2
В чистую пробирку отбирают 5 мл молока, отсутствие левомицетина в котором подтверждено стандартизированным в Республике Беларусь хроматографическим методом. К
молоку добавляют пипеткой 1,2 мл концентрированной соляной кислоты и цинковую
пыль в количестве 0,04 г. Содержимое пробирки тщательно встряхивают, выдерживают в
течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 5 мин на водяной бане при температуре 62 °С. После этого в пробирку добавляют 0,7 мл смеси 10 %-ного раствора нитрита
натрия с соляной кислотой в соотношении 100:1, встряхивают и выдерживают в течение
2 мин. Содержимое пробирки фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный фильтрат добавляют 2 капли 2 %-ного раствора β-нафтола в 40 %-ном растворе
гидроокиси натрия, тщательно перемешивают. Через 60 с оценивают окраску содержимого пробирки. Содержимое пробирки имеет желтое окрашивание.
4
BY 11240 C1 2008.10.30
Пример 3
В молоко, отсутствие левомицетина в котором подтверждено стандартизированным в
Республике Беларусь хроматографическим методом, добавляют левомицетин в концентрации 1,4 мкг/г. В чистую пробирку отбирают 3,5 мл исследуемого молока, добавляют
пипеткой 0,9 мл концентрированной соляной кислоты и цинковую пыль в количестве 0,03 г.
Содержимое пробирки тщательно встряхивают, выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 5 мин на водяной бане при температуре 60 °С. После этого
в пробирку добавляют 0,5 мл смеси 10 %-ного раствора нитрита натрия с соляной кислотой в соотношении 100:1, встряхивают и выдерживают в течение 1,5 мин. Содержимое
пробирки фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный фильтрат добавляют 1 каплю 2 %-ного раствора β-нафтола в 40 %-ном растворе гидроокиси натрия,
тщательно перемешивают. Через 45 с оценивают окраску содержимого пробирки. Содержимое пробирки имеет желтое окрашивание.
Таким образом, красный цвет свидетельствует о присутствии левомицетина в молоке в
концентрации 1,5 мкг/г и выше. Желтый цвет свидетельствует об отсутствии левомицетина в молоке или его концентрации в молоке ниже 1,5 мкг/г. Для реализации предлагаемого
способа содержание левомицетина в молоке не должно быть менее 1,5 мкг/г. Данное количество левомицетина является той минимальной концентрацией, которую удается обнаружить качественно по красной окраске.
Предлагаемый способ позволяет обнаруживать микроколичества левомицетина в молоке на основе качественной реакции на левомицетин за счет использования определенных приемов выполнения способа с обязательным соблюдением всех условий его
реализации.
Использовать пробу молока объемом менее 2 мл нецелесообразно, так как это приводит к уменьшению количества всех применяемых реактивов, и после фильтрования пробы
объем фильтрата оказывается настолько незначительным, что затрудняется оценка получаемой окраски. Использование пробы объемом свыше 5 мл нецелесообразно из-за неоправданного перерасхода сырья и реактивов.
Использование цинковой пыли в количестве менее 0,02 г приводит к получению кремово-желтой окраски, что свидетельствует о том, что этого количества недостаточно для
полного восстановления микроколичеств левомицетина, содержащегося в 2-5 мл молока.
Увеличение количества цинковой пыли выше 0,04 г приводит к появлению нехарактерного черно-серого оттенка пробы, что затрудняет конечную оценку получаемой окраски.
Применение соляной кислоты на стадии восстановления левомицетина объемом менее
0,6 мл не вызывает полной коагуляции казеина, что может привести к появлению красной
окраски в молоке, не содержащем левомицетин. При использовании концентрированной
соляной кислоты объемом более 1,2 мл происходит повторное растворение казеина, что
также отрицательно влияет на достоверность получаемых результатов.
При выдержке пробы после добавления соляной кислоты и цинковой пыли менее
10 мин не удается достичь постоянно воспроизводимой красной окраски. По-видимому,
этого времени не всегда бывает достаточно, чтобы до конца прошла реакция восстановления микроколичеств левомицетина, содержащегося в молоке. Выдерживать пробу молока
свыше 10 мин нецелесообразно, так как при этом увеличивается продолжительность способа в целом. К неоправданному расходу энергии приводит также выдержка пробы в течение 10 мин при нагревании, так как экспериментальным путем установлено, что хорошо
воспроизводимые результаты наблюдаются при выдерживании пробы первых 5 мин при
комнатной температуре. Выдержка пробы при комнатной температуре свыше 5 мин приводит к приостановке реакции, что не позволяет при наличии левомицетина в молоке стабильно получать красную окраску пробы. При температуре водяной бани ниже 58 °С не
удается получить хорошо воспроизводимых результатов, так как при таком нагревании
реакция восстановления левомицетина до аминопроизводного происходит недостаточно
5
BY 11240 C1 2008.10.30
интенсивно. При температуре свыше 62 °С наблюдается красное окрашивание пробы молока, не содержащего левомицетин, что может свидетельствовать о влиянии на ход протекания реакции денатурированных при нагревании сывороточных белков молока.
Использование смеси 10 %-ного раствора нитрита натрия с соляной кислотой в соотношении 100:1 объемом менее 0,3 мл не дает стабильной красной окраски при наличии
микроколичеств левомицетина в молоке, что свидетельствует о том, что используемых
реактивов недостаточно, чтобы реакция диазотирования прошла полностью. Использование
смеси объемом свыше 0,7 мл нецелесообразно, так как разбавляется исследуемая проба и
чувствительность способа снижается.
При выдержке пробы после добавления смеси 10 %-ного нитрита натрия с концентрированной соляной кислотой в соотношении 100 : 1 менее 1 мин не обеспечивается полного
протекания реакции диазотирования аминопроизводного левомицетина во времени и получения стабильных результатов. Выдержка свыше 2 мин увеличивает продолжительность способа и снижает его экспрессность.
При выдержке пробы после добавления 2 %-ного раствора β-нафтола в 40 %-ном растворе гидроокиси натрия менее 30 с не наблюдается воспроизводимости результатов, так
как этого времени недостаточно, чтобы реакция образования азокрасителя прошла полностью. При выдержке пробы свыше 60 с окраска может измениться (от красной до темнобурой или зеленой), что может быть вызвано разрушением азокрасителя и взаимодействием различных соединений молока с используемыми реактивами.
Таким образом, предлагаемый способ открывает принципиально новые возможности
обнаружения малых доз антибиотика левомицетина в молоке. Способ прост в исполнении,
не предъявляет особых требований к квалификации персонала, не требует дорогостоящего
оборудования и реактивов, имеет хорошую воспроизводимость результатов, сравнительно
высокую чувствительность и обладает всеми признаками экспрессности, то есть осуществляется в течение 15-17 мин, что в 35 раз быстрее по сравнению с используемым в настоящее время в Республике Беларусь способом-прототипом, продолжительность которого
составляет не менее 10 ч.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
106 Кб
Теги
патент, by11240
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа