close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11321

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11321
(13) C1
(19)
C 07H 21/00
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК UREAPLASMA UREALYTICUM
ИЛИ MYCOPLASMA HOMINIS
(21) Номер заявки: a 20060462
(22) 2006.05.16
(43) 2007.12.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение образования "Белорусская
медицинская академия последипломного образования" (BY)
(72) Авторы: Бадыгина Наталья Александровна; Костюк Светлана Андреевна; Полещук Николай Николаевич;
Рубаник Лариса Владимировна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение образования "Белорусская
медицинская академия последипломного образования" (BY)
(56) KNOX C.L. et.al. Journal of Clinical Microbiology. - 1998. - V. 36. - № 10. P. 3032-3039.
ХУЛУП Г.Я. и др. Медицина. - 2004. № 4. - С. 17-18.
RU 2232768 C2, 2004.
RU 2116795 C1, 1998.
BY 11321 C1 2008.12.30
(57)
Способ выделения ДНК Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis, включающий
лизирование бактерий, осаждение и ресорбцию ДНК, отличающийся тем, что лизис бактерий проводят гуанидин тиоционатом, осаждают ДНК на частицах силикагеля, а после
ресорбции ДНК дополнительно проводят ее очистку и концентрирование путем обработки
сначала изопропанолом, а затем 70 % этанолом.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способам выделения ДНК
Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis из жидкой культуральной среды.
Известен способ выделения ДНК из культуры Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma
hominis с использованием фенольно-хлороформного метода, включающего ферментативный протеолиз с последующими депротеинизацией и осаждением ДНК [1].
Недостатком этого способа является использование в работе таких агрессивных веществ, как фенол и хлороформ.
Разработанный способ выделения ДНК Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma
hominis позволяет получить из жидкой культуральной среды очищенную и концентрированную ДНК (> 20 мкг/мл), необходимую для дальнейших фундаментальных или аналитических исследований, создания калибратора с известной концентрацией ДНК
Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis.
Задачей заявленного способа является получение высококонцентрированной и очищенной ДНК Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis, выделенной из жидкой
культуральной среды.
Поставленная задача достигается следующим образом.
Предложен способ выделения ДНК Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis,
включающий лизирование бактерий, осаждение и ресорбцию ДНК, причем лизис бактерий проводят гуанидин тиоционатом, осаждают ДНК на частицах силикагеля, а после ресорбции ДНК дополнительно проводят ее очистку и концентрирование путем обработки
сначала изопропанолом, а затем 70 % этанолом.
BY 11321 C1 2008.12.30
Из культуры микроорганизмов ДНК выделялась сорбционным методом. При этом к
100 мкл жидкой культуральной среды, в пробирке объемом 1,5 мл, добавляли 300 мкл лизирующего раствора, содержащего гуанидин тиоционат. Пробы тщательно перемешивали
на вортексе и инкубировали в течение 5 мин при 65 °С. Пробы центрифугировали в течение 5 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость использовали для выделения ДНК,
перенеся в новую пробирку. Тщательно ресуспензировали сорбент (на частицы силикагеля) на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавляли по 20 мкл ресуспензированного сорбента. Перемешивали на вортексе каждую пробирку, инкубировали
при комнатной температуре 2 мин, затем еще раз перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 5 мин. Осаждали сорбент в пробирках центрифугированием при
5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удаляли супернатант, используя отдельный наконечник для
каждой пробы и вакуумный аспиратор в колбу-ловушку. К осадку добавляли по 500 мкл
раствора для отмывки, перемешивали на вортексе до полного ресуспензирования сорбента. Центрифугировали пробы 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Удаляли супернатант, используя отдельный наконечник для каждой пробы и вакуумный аспиратор в
колбу-ловушку. Отмывку повторяли еще раз и удаляли супернатант. Пробирки помещали
в твердотельный микротермостат и подсушивали пробы 5-10 мин при температуре 65 °С,
оставляя пробирки открытыми. В пробирки с осадком добавляли 100 мкл ТЕ-буфера для
элюции ДНК, перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 5 мин при 65 °С, периодически встряхивая на вортексе. Пробирки центрифугировали в течение 1 мин при
12 тыс. об/мин на микроцентрифуге, супернатант переносили в чистую пробирку.
После чего дополнительно проводят осаждение ДНК путем добавления к 100 мкл супернатанта 100 мкл изопропанола и инкубировали при комнатной температуре в течение
1 ч, затем центрифугировали при 12000 g 15 мин. Супернатант тщательно удаляли. ДНК
дополнительно очищали путем добавления к осадку 1 мл 70 %-го этанола, затем перемешивали на вортексе. Центрифугировали пробы 30 с при 10 тыс. об/мин. Супернатант удаляли, осадок высушивали в течение 5 мин и элюировали в 50 мкл ТЕ-буфера.
Пример расчета.
Из жидкой культуральной среды ("BIOMERIEUX", Франция), содержащей Ureaplasma
urealyticum, предлагаемым способом была выделена ДНК Ureaplasma urealyticum в концентрации 29,05 мкг/мл. Измерение концентрации ДНК Ureaplasma urealyticum проводилось
спектрофотомером при длине волны 260 нм: соотношение А260/А280 составило 1,8, а А320 0,02. Данные показатели свидетельствуют о достаточной очистке и концентрировании раствора ДНК Ureaplasma urealyticum. При этом без дополнительных этапов осаждения ДНК
изопропиловым спиртом, очистки 70 % этанолом и элюции ДНК в 50 мкл ТЕ-буфера концентрация ДНК составила 17,3 мкг/мл, соотношение А260/А280 = 1,2, а А320 - 0,28, что свидетельствует о недостаточной концентрации и чистоте полученного препарата ДНК.
Таким образом, по сравнению с прототипом заявленный способ позволяет получить
следующие преимущества: выделить очищенную и концентрированную геномную ДНК
Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis из жидкой культуральной среды, что необходимо для создания стандартного положительного образца с известной концентрацией, расширения диапазона фундаментальных исследований уникального нуклеинового
материала из жидкой культуральной среды.
Источники информации:
1. Christine L. Knox, Peter Timms Comparison of PCR, Nested PCR, and Random Amplified Polymorphic DNA PCR for Detection and Typing of Ureaplasma urealyticum in Specimens
from Pregnant Women//Journal of Clinical Microbiology. 1998. Vol. 36, No. 10. p. 3032-3039.
Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
71 Кб
Теги
патент, by11321
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа