close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11361

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07K 7/00
ПЕПТИД, СВЯЗЫВАЮЩИЙ ИММУНОГЛОБУЛИН Е
(21) Номер заявки: a 20060307
(22) 2006.04.06
(43) 2007.12.30
(71) Заявители: Янченко Владимир Вилиянинович; Новиков Павел Дмитриевич; Новиков Дмитрий Кузьмич;
Мартинович Вера Павловна; Голубович Владимир Петрович; Мельник
Ольга Викторовна; Янченко Лилия
Кирилловна; Янченко Андрей Вилиянинович; Осененко Елена Ивановна (BY)
(72) Авторы: Янченко Владимир Вилиянинович; Новиков Павел Дмитриевич; Новиков Дмитрий Кузьмич;
Мартинович Вера Павловна; Голубович Владимир Петрович; Мельник
Ольга Викторовна; Янченко Лилия
Кирилловна; Янченко Андрей Вилиянинович; Осененко Елена Ивановна (BY)
BY 11361 C1 2008.12.30
BY (11) 11361
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатели: Янченко Владимир
Вилиянинович; Новиков Павел Дмитриевич; Новиков Дмитрий Кузьмич;
Мартинович Вера Павловна; Голубович
Владимир Петрович; Мельник Ольга
Викторовна; Янченко Лилия Кирилловна; Янченко Андрей Вилиянинович;
Осененко Елена Ивановна (BY)
(56) US 4369137, 1983.
US 6267958 B1, 2001.
US 5274075 A, 1993.
US 5342924 A, 1994.
WO 03/061561 A2.
(57)
Пептид, выбранный из RNWD, RNWDV, RNWDVY и RNWDVYK, имеющий последовательность аминокислотных остатков, соответствующую активному домену высокоаффинного рецептора FcεRI для иммуноглобулина Е, способный специфично связывать
иммуноглобулин E.
Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии и иммунологии, и
может быть использовано для диагностики, лечения и профилактики иммунопатологии.
Иммуноглобулины Е (IgE) - важные биологические молекулы-антитела, синтезируемые плазматическими клетками под влиянием аллергенов. Антитела IgE участвуют в развитии ряда аллергических заболеваний. Создание веществ, способных связывать IgE,
позволяет проводить диагностику, лечение и профилактику IgE-зависимых болезней.
В настоящее время для связывания иммуноглобулина Е используют моноклональные
или поликлональные антивидовые антитела [1-9].
Учитывая рост числа аллергических заболеваний во всех развитых странах и отсутствие в Республике Беларусь патентованных технологий производства каких-либо моноклональных антител, целью изобретения является создание новых биологически активных
пептидов, способных эффективно связывать IgE.
Нами был избран следующий подход для решения проблемы связывания IgE. На поверхности тучных клеток и базофилов присутствуют высокоаффинные рецепторы для IgE
BY 11361 C1 2008.12.30
(FcεRI). Выявив и синтезировав фрагменты активного домена FcεRI, можно получить пептиды, связывающие IgE.
Используя компьютерную программу Биоскан 9.0 ОДО "НИКП Ресан", Витебск, Беларусь; базу данных Национального центра биотехнологической информации США
(NCBI); базу данных известных структур протеинов и нуклеиновых кислот Великобритании (PDB) - файл 1f6a (авторы: S.C. Garman, B.A. Wurzburg, S.S. Tarchevskaya, J.P. Kinet,
T.S. Jardetzky), был произведен анализ С3- и С4-фрагмента иммуноглобулина Е (Fc3c4-IgE)
и высокоаффинного рецептора иммуноглобулина Е (FcεRI). По результатам анализа был
выбран пептидный фрагмент FcεRI, принимающий участие в лиганд-рецепторном взаимодействии с Fc участком IgE - RNWDVYK (использовано однобуквенное международное обозначение аминокислот).
Сравнительный анализ аминокислотной последовательности FcεRI с 923 другими белками показал, что последовательность активной части FcεRI (аминокислоты 111-117) уникальна и не встречалась в 923 проанализированных белках длиной от 54 до 4563
аминокислотных остатков. Учитывая эту особенность, можно получить 4 варианта пептидов, способных высокоспецифично связывать IgE.
Задачей данного изобретения является получение пептидов, входящих в активный домен высокоаффинного рецептора FcεRI для иммуноглобулина Е (последовательность 111117), которые способны высокоспецифично связывать IgE:
RNWD-тетрапептид;
RNWDV-пентапептид;
RNWDVY-гексапептид;
RNWDVYK-гептапептид.
Прототипами предлагаемых нами пептидов были: пентапептид H-ARG-X-Z-Y-TYR-R,
являющийся активной частью тимопоэтина - гормона вилочковой железы [10-12], и моноклональные антитела против иммуноглобулина Е - XOLAIR (omalizumab) [13]. Сопоставительный анализ предлагаемых IgE связывающих пептидов с прототипами показал, что
заявляемые IgE связывающие пептиды существенно отличаются от известных прототипов. Предлагаемые IgE связывающие пептиды являются новыми, потому что их состав
и структура неизвестны из существующего уровня техники.
Возможность использования изобретения подтверждена приводимыми ниже сведениями, относящимися к составу, способу получения и результатам экспериментальной
проверки.
Пептиды получали с использованием классических методов пептидного синтеза. При
получении тетрапептида RNWD использовали тактику минимальной защиты боковых
функциональных групп, при синтезе гексапептида RNWDVYK боковые функциональные
группы блокировали водородолабильными защитами. Основным методом образования
пептидной связи был выбран карбодиимидный, в качестве противорацемической добавки
использовали 1-оксибензотриазол. Для блокирования α-аминогрупп использовали
трет.бутилоксикарбонильную защиту. Ее отщепление проводили обработкой пептидов
3,5-5,0 н раствором НСl в этилацетате. Карбоксильные группы блокировали путем образования метиловых эфиров, для их удаления использовали щелочной гидролиз. Водородолабильные группы удаляли гидрированием пептида над катализатором - палладиевой
чернью, в растворе уксусной кислоты.
Чистота и структура созданных пептидов подтверждены методами масс-спектрометрии, аминокислотного анализа, ВЭЖХ, ТСХ.
Масс-спектры целевых пептидов получили на масс-спектрометре РЕ SCIEX AP1
150EX (Perkin Elmer, США) с использованием Turboionspray источника ионов. Аналитическую ВЭЖХ созданных соединений провели на хроматографе фирмы Waters (Millenium32,
966 фотодиодный детектор, колонка Vydac 201HS52 RP C18 (2,1*250 мм)). Используемый
градиент концентраций от 10 до 40 % ацетонитрила в воде с добавлением 0,1 % TFA. Скорость потока 1 мл/мин.
2
BY 11361 C1 2008.12.30
Хроматографические подвижности приведены в системах:
(A) - хлороформ/метанол/20 %-ный аммиак, 60:40:10;
(Б) - бутанол/уксусная кислота/вода, 40:10:10;
(В)- этилацетат/пиридин/уксусная кислота/вода, 50:30:30:10;
(Г) - бутанол/пиридин/уксусная кислота/вода; 45:30:9:18;
(Д) - хлороформ/метанол/20 %-ный аммиак/уксусная кислота, 60:45:15:3.
Удельное вращение определяли на спектрополяриметре J-20 ("Jasco", Япония).
Температуры плавления определяли на приборе Кофлера (приведены без коррекции).
Получение пептидов описано в следующих примерах.
Получение RNWD-тетрапептида (дигидрохлорида аргинил-аспарагинил-триптофиласпарагиновой кислоты)
а) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-триптофил-аспарагиновой кислоты диметилового эфира (I).
К раствору 0,86 г (3,7 ммоль) гидрохлорида диметилового эфира аспарагиновой кислоты в 3,5 мл диметилформамида (ДМФ) прибавили 1,0 мл триэтиламина (7,0 ммоль).
Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и затем внесли 0,97 г (3,2 ммоль)
трет.бутилоксикарбонил-триптофана. После охлаждения до 0 °С в реакционный сосуд
прибавили последовательно 0,46 г (3,4 ммоль) гидроксибензатриазола (НОВТ) и 0,78 г
(3,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК). Реакционную смесь перемешивали в
течение 2 час при 0 °С и 4 час при комнатной температуре. После окончания реакции
осадок дициклогексилмочевины (ДЦГМ) отфильтровали, промыли на фильтре 1 мл ДМФ.
В фильтрат добавили 10 мл этилацетата и полученный раствор промыли 9 %-ным раствором лимонной кислоты, 5 %-ным раствором NaHCO3, насыщенным раствором натрия
хлорида, водой, сушили над Na2SO4. После сушки этилацетат упарили, а образовавшийся
маслообразный остаток переосадили из эфира гексаном и сушили над Р2О5. Получили 1,07 г
(выход 76 %) соединения I, [α]20D + 4,0° (С 1, МеОН); Температура плавления (Т.пл.) 5557 °С; Rf 0,36 (Б), 0,97 (В).
б) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-аспаргинил-триптофил-аспарагиновой кислоты диметилового эфира (II).
К раствору 0,64 г (1,6 ммоль) HCl⋅Trp-Asp(OMe)2 (получен обработкой соединения I
НСl в этилацетате) в 2,5 мл ДМФ прибавили 0,29 мл триэтиламина (2,1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и внесли 0,35 г (1,5 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-аспарагина. После охлаждения до 0 °С в реакционный сосуд прибавили
последовательно 0,22 г (1,6 ммоль) НОВТ и 0,37 г (2,1 ммоль) ДЦГК. Время прохождения
реакции - 6 час. Обработку синтеза проводили по методике, описанной для соединения I.
Выход соединения II - 0,68 г (выход 81 %), Т. пл. 79-82 °С; [α]20D - 46,8° (С 1, МеОН);
Rf 0,95 (В), 0,33 (Б).
в) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-аргинил-аспаргинил-триптофил-аспарагиновой кислоты диметилового эфира (III).
К раствору 0,39 г (0,8 ммоль) HCl⋅Asn-Trp-Asp(OMe)2 (получен обработкой соединения II НСl в этилацетате) в 2,0 мл ДМФ добавили 0,19 г (0,7 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-аргинина и перемешивали полученный раствор в течение 30 мин.
Охладив реакционную колбу до 0 °С, в реакционный сосуд внесли последовательно 0,09 г
(0,7 ммоль) НОВТ и 0,19 г (0,9 ммоль) ДЦГК. После окончания реакции осадок ДЦГМ
отфильтровали, а к фильтрату добавили 10 мл безводного эфира. Полученное масло переосадили из метанола эфиром и сушили в эксикаторе над P2O5. Получили 0,43 г (выход
81 %) соединения III, [α]20D - 28,0° (С 1, МеОН); Т. пл. 100-104 °С; Rf 0,58 (А), 0,71 (В).
г) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-аргинил-аспаргинил-триптофил-аспарагиновой кислоты (IV).
К раствору 0,36 г (0,5 ммоль) соединения III в 6,2 мл метанола добавили 0,6 мл 2 н
NaOH и перемешивали полученный раствор в течение часа. После окончания гидролиза
реакционную смесь нейтрализовали до рН 2-3 3,3 н раствором НСl в уксусной кислоте,
3
BY 11361 C1 2008.12.30
растворитель упарили в вакууме досуха, а к образовавшемуся остатку добавили 2,0 мл ДМФ.
Нерастворившийся осадок натрия хлорида отфильтровали, к фильтрату прилили 6,0 мл безводного эфира. После переосаждения из метанола эфиром и сушки в эксикаторе над P2O5
получили 0,32 г (выход 89 %) соединения IV, [α]20D - 18,0° (С 1, МеОН); Rf 0,47 (Г), 0,27 (В).
д) Получение тетрапептида Arg-Asn-Trp-Asp⋅2HCl (V).
К 0,30 г (0,4 ммоль) соединения IV прибавили 2,1 мл 3,3 н раствора НСl в уксусной
кислоте. Реакционную смесь перемешивали около часа, затем растворитель упарили, а остаток дважды промыли эфиром, сушили в эксикаторе над NaOH. Получили 0,27 г (выход
96 %) соединения (V); Т. пл. 128-131 °С; [α]20D - 5 (С 1, Н2О); Rf 0,81 (Д), 0,20 (В).
Масс-спектр FAB: m/z 590,3 [М+Н]+, 612,3 [M+Na]+.
По данным ВЭЖХ содержание целевого пептида - 92 %.
Получение RNWDVYK-гептапептида (дигидрохлорида аргинил-аспарагинил-триптофил-аспарагил-валил-тирозил-лизина метилового эфира).
а) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-тирозил-(Nε-бензилоксикарбонил)лизина
метилового эфира (VI).
К раствору 0,79 г (2,4 ммоль) гидрохлорида метилового эфира Nε-бензилоксикарбонил-лизина 5 мл ДМФ прибавили 0,28 мл N-метилморфолина (2,5 ммоль). Реакционную
смесь перемешивали в течение 20 мин, затем прибавили 0,68 г (2,4 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-тирозина. После охлаждения до 0 °С в реакционный сосуд внесли последовательно 0,27 г (2,4 ммоль) НОВТ и 0,53 г (2,5 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь
перемешивали в течение 2 час при 0 °С и 5 час при комнатной температуре. После окончания реакции осадок ДЦГМ отфильтровали, промыли на фильтре 1 мл ДМФ. В фильтрат
добавили 30 мл этилацетата и полученный раствор промыли 9 %-ным раствором лимонной кислоты, 5 %-ным раствором NаНСО3, водой, сушили над Na2SO4. После отгонки
этилацетата образовавшийся маслообразный остаток переосадили из эфира гексаном и
сушили над Р2О5. Получили 1,07 г (80 %) Boc-Tyr-(Z)Lys-OMe, [α]20D - 7,0° (С 1, МеОН);
Т. пл. 63-67 °С; Rf 0,76 (Б), 0,77 (Д).
б) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-валил-тирозил-(Nε-бензилоксикарбонил)лизина метилового эфира (VII).
0,51 г (1,5 ммоль) дициклогексиламмонийной соли трет.бутилоксикарбонил-валина и
0,74 г (1,5 ммоль) тирозил-(Nε-бензилоксикарбонил)лизина метилового эфира гидрохлорида (получен обработкой соединения VI НСl в этилацетате) растворили в 5 мл ДМФ, затем раствор охладили до 0 °С и прибавили последовательно 0,22 г (1,6 ммоль) НОВТ и
0,32 г (1,55 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивали 1 час при охлаждении и
6 час при комнатной температуре. Очистку и выделение защищенного трипептида BocVal-Tyr-(Z)Lys-ОМе VII проводили по методике, описанной для соединения VI. Выход
Boc-Val-Tyr-(Z)Lys-ОМе 0,72 г (73 %), Т. пл. 79-82 °С; [α]20D - 25,0° (С 1, МеОН); Rf 0,78
(Д), 0,63 (А).
в) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-триптофил-аспарагиновой кислоты β-бензилового эфира (VIII).
Смесь 0,42 г (2,0 ммоль) аспарагиновой кислоты β-бензилового эфира и 0,084 г
(10 ммоль) NаНСО3 растворили в 2 мл 1 М NaOH (pH~9) при интенсивном перемешивании, затем прилили раствор 0,94 г (2,0 ммоль) Boc-Trp-OPfp в 3 мл ДМФА. Реакционную
смесь перемешивали около 40 мин, затем ее разбавили 7 мл 9 %-ной лимонной кислоты и 15 мл этилацетата. Полученные слои разделили и обработали. Водный слой промыли
два раза этилацетатом, этилацетатные слои объединили, промыли 9 %-ной лимонной кислотой, затем водой до нейтральной реакции и сушили над Na2SO4. После сушки этилацетат упарили, остаток переосадили из эфира гексаном, переосаждение повторили дважды.
После сушки получили 0,86 г (68 %) Boc-Trp-Asp(Bzl)-OH; [α]d20 + 1° (с = 0,5, метанол); Rf = 0,43 (A), 0,62 (Б).
г) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-триптофил-(β-бензил)аспарагил-валил-тирозил-(Nε-бензилоксикарбонил)лизина метилового эфира (IX).
4
BY 11361 C1 2008.12.30
0,51 г (1,0 ммоль) Val-Tyr-(Z)Lys-OMe*HCl (получен обработкой соединения VII НСl в
этилацетате) растворили в 5 мл ДМФ, прибавили 0,28 мл N-метилморфолина (2,5 ммоль),
все перемешивали в течение 20 мин, затем охладили до 0 °С и прибавили последовательно
0,56 г (1,1 ммоль) Boc-Trp-Asp(Bzl)-OH VIII, 0,16 г (1,2 ммоль) НОВТ и 0,23 г (1,1 ммоль)
ДЦГК. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 0 °С и 12 ч при комнатной
температуре. Очистку и выделение защищенного пентапептида IX проводили по методике, описанной для соединения VI. Выход Boc-Trp-Asp(Bzl)-Val-Tyr-(Z)Lys-OMe 0,60 г
(57 %). Т. пл. 143-145 °С; [α]20D - 31,0° (С 1, МеОН); Rf 0,71 (В), 0,33 (Б).
д) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-нитроаргинил-аспарагина (X).
В 2,5 мл воды растворили 0,30 г (2,0 ммоль) аспарагина, прибавили 0,41 мл (3,0 ммоль)
триэтиламина, раствор охладили до 5 °С и объединили при перемешивании магнитной
мешалкой с охлажденным до 5 °С раствором 0,75 г (1,5 ммоль) пентафторфенилового
эфира Nα-трет.бутилоксикарбонил-нитроаргинина. Раствор перемешивали 0,5 ч при охлаждении и 1 ч при комнатной температуре, затем добавили 4 н раствор НСl в этилацетате
до рН 5-6 и упарили растворители в вакууме. К остатку - смеси кристаллов и масла - добавили 5 мл этилацетата, нерастворившиеся кристаллы отделили фильтрованием, к этилацетатному фильтрату прибавили 15 мл эфира, выпавший кристаллический осадок дипептида
X для очистки переосадили из метанола эфиром и промыли хлороформом. После сушки в
вакууме над Р2О5 получили 0,40 г (61 %) Boc-Arg(NO2)-Asn-OH. Т. пл. 103-105 °С; [α]20D 21,0° (С 1, МеОН); Rf 0,55 (В), 0,63 (Б).
е) Получение Nα-трет.бутилоксикарбонил-нитроаргинил-аспарагинил-триптофил-(βбензил)аспарагил-валил-тирозил-(Nε-бензилоксикарбонил)лизина метилового эфира (XI).
0,290 г (0,30 ммоль) Trp-Asp(Bzl)-Val-Tyr-(Z)Lys-OMe*HCl (получен обработкой соединения VII НСl в смеси этилацетата и уксусной кислоты) растворили в 4 мл ДМФ, прибавили 0,045 мл N-метилморфолина (0,40 ммоль), все перемешивали в течение 20 мин,
затем охладили до 0 °С и прибавили последовательно 0,151 г (0,35 ммоль Boc-Arg(NO2)Asn-ОН, 0,054 г (0,40 ммоль) НОВТ и 0,072 г (0,35 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 0 °С и 12 ч при комнатной температуре. Осадок ДЦГМ отделили фильтрованием, к фильтрату прибавили 15 мл эфира, выпавший осадок повторно
переосадили из ДМФ эфиром, промыли на фильтре смесью метанол-этилацетат 1:1, этилацетатом. После сушки в вакууме над P2О5 получили 0,26 г (65 %) Boc-Arg(NO2)-Asn-TrpAsp(Bzl)-Val-Tyr-(Z)Lys-OMe.
ж) Получение аргинил-аспарагинил-триптофил-аспарагил-валил-тирозил-лизина метилового эфира дигидрохлорида (XII).
0,15 г (0,11 ммоль) защищенного гексапептида XI растворили в 4 мл уксусной кислоты, к раствору прибавили ∼0,03 г катализатора - палладиевой черни и при перемешивании
магнитной мешалкой через реакционную смесь пропускали ток водорода в течение 23 ч,
контролируя полноту отщепления водородолабильных защитных групп методом ТСХ.
После завершения гидрирования катализатор отделили фильтрованием, гексапептид перевели в осадок добавлением 12 мл эфира. Осадок растворили в 2 мл уксусной кислоты,
к раствору прибавили 2 мл 4 н НСl, все перемешивали в течение 50 мин, затем растворители упарили, кристаллический остаток промыли этилацетатом, смесью метанол-этилацетат
2:1. Очистку соединения проводили методом колоночной хроматографии на сефадексе
LH-20, используя в качестве элюента смесь уксусная кислота - этанол 1:1. Фракции, содержащие чистый пептид, объединяли и упаривали. После сушки получили 0,76 (64 %)
Arg-Asn-Trp-Asp-Val-Tyr-Lys-ОМе*2НСl. Т. пл. 161-164 °С; [α]20D - 17,0° (С 0,5, уксусная
кислота); Rf 0,25 (В), 0,33 (Д).
Масс-спектр FAB: m/z 995,1 [М+Н]+, 1017,1 [M+Na]+.
Оценивали биологическое действие пептидов. Проводили иммуноферментный анализ
и определяли способность пептидов связывать IgE-антитела. Исследовали влияние пептида на выброс ионов калия и миелопероксидазы из лейкоцитов под влиянием аллергена.
Для исследования использовали растворы пептидов в концентрации от 100 пг/мл до 1 мг/мл.
5
BY 11361 C1 2008.12.30
Оценка связывания RNWD-пептида с IgE
Для определения способности RNWD-пептида связывать IgE нами была произведена сорбция RNWD-пептида в карбонат-бикарбонатном буфере с рН 9,6 на полистироловую планшету в пошаговых концентрациях: 10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 40 мкг/мл, 80 мкг/мл,
160 мкг/мл, 320 мкг/мл, 640 мкг/мл, 1 мг/мл. В лунки микроплашета вносили по 0,1 мл
RNWD-пептида в карбонат-бикарбонатном буфере с рН 9,6 и инкубировали в течение 1824 час при комнатной температуре. После инкубации микропланшет отмывали промывающим раствором (рН 7,2) с твином-20, чтобы удалить несвязавшийся RNWD-пептид.
После этого в лунки микропланшета вносили по 200 мкл 0,1 % бычьего альбумина и инкубировали 3 часа при 37 °С для закрытия свободных зон полистирола и снижения неспецифического связывания. Затем микропланшет снова отмывали промывающим раствором
с твином-20.
Чтобы установить оптимальную сорбционную концентрацию RNWD-пептида, мы
вносили по 0,1 мл пробы 5 сывороток больных аллергией, разведенных 1:5 с известной
концентрацией IgE, в лунки с разной сорбционной концентрацией RNWD-пептида и инкубировали 1 час при 37 °С. После этого микропланшет 3 раза отмывали промывающим
раствором и вносили по 0,1 мл антител против IgE, меченных пероксидазой хрена, инкубировали 1 час при 37 °С. После 3-кратной отмывки в лунки микропланшета вносили по
0,15 мл раствора тет-раметилбензидина с H2O2. Через 15 мин инкубации при комнатной
температуре реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 4 %-ной серной кислоты и замеряли оптическую плотность на фотометре с длиной волны 450 нм.
Для того чтобы выяснить, является ли связывание RNWD-пептида с IgE полным или
частичным, мы протестировали методом иммуноферментного анализа в парных постановках 20 проб сывороток с известной концентрацией IgE на одной микропланшете, где в одном ряду был сорбирован RNWD-пептид в концентрации 160 мкг/мл, а в параллельном моноклональные антитела против IgE в рабочей концентрации (5 мкг/мл) для системы определения общего IgE. Пробы сывороток вносили в разведении 1:20.
По оптической плотности и сорбционной концентрации RNWD-пептида нами были
построены графики титрования и определена оптимальная сорбционная концентрация
RNWD-пептида в этой экспериментальной иммуноферментной системе (фиг.).
Концентрация RNWD-пептида
Фиг. Кривые титрования 5 проб сывороток в лунках с разной сорбционной концентрацией
RNWD-пептида.
Как видно на фиг. с сорбционной концентрации в 80 мкг/мл оптическая плотность
практически не увеличивалась, что говорит о пороге насыщения сорбционной способности данной полистироловой планшеты в отношении RNWD-пептида. Следовательно, следующее разведение - 160 мкг/мл - можно считать оптимальным в этой экспериментальной
иммуноферментной системе.
Результаты связывания IgE моноклональными антителами и RNWD-пептидом представлены в таблице, из которой видно, что RNWD-пептид в данном эксперименте связывал от 11,5 до 48,3 % от общего IgE. Уровень общего IgE и процента его связывания
RNWD-пептидом коррелировали по обратной связи (r = -0,745, р<0,05). Можно считать
доказанным факт связывания RNWD-пептидом IgE.
6
BY 11361 C1 2008.12.30
При удлинении IgE-связывающих пептидов от 4 до 7 аминокислот усиливалось связывание иммуноглобулина Е. Так, после добавления в лунки плоскодонного иммунологического планшета по 100 мкл раствора пептидов (100 мкг/мл) происходила сорбция этих
тетра-гептапептидов. После внесения в лунки планшет сывороток больных аллергией гептапептид связывал на 23,79 % больше IgE, чем тетрапептид.
Была исследована способность связывания синтетическими RNWDVYK-пептидами
IgE, в зависимости от концентрации IgE в стандартной сыворотке (от 0,47 до 60 нг/мл).
Обнаружена высокая корреляция между концентрацией IgE и оптической плотностью
раствора после внесения моноклональных антител, меченных пероксидазой хрена, и субстрата хромогенной смеси (r = 0,99).
Аналогичные исследования были проведены с сывороткой больных аллергией. В иммунологические планшеты с сорбированными синтетическими RNWDVYK-пептидами
добавляли сыворотки крови аллергиков с известной концентрацией IgE. Также была обнаружена высокая корреляция между концентрацией IgE в сыворотке крови больных и оптической плотностью раствора после внесения моноклональных антител, меченных
пероксидазой хрена, и субстрата хромогенной смеси (r = 0,94).
В проведенных экспериментах обнаружена высокая IgE связывающая активность синтетических RNWDVYK-пептидов. Показана возможность создания диагностических систем для количественного определения IgE.
В результате проведенных экспериментов установлено, что заявленные пептиды обладают биологическим действием и связываются с иммуноглобулинами Е класса. При удлинении IgE-связывающих пептидов от 4 до 7 аминокислот связывание иммуноглобулина Е
усиливалось.
Связывание IgE моноклональными анителами против IgE и RNWD-пептидом
из раствора сывороток больных с аллергией с известным содержанием IgE
Связавшийся IgE
Общий IgE в ОП в лунках с антиОП в лунках с
№ сыв.
с RNWD-пептидом
кЕ/л
IgE-антителами*
RNWD-пептидом*
от общего IgE, %
1
500
1,978
0,412
20,8
2
450
1,832
0,256
14,0
3
400
1,744
0,299
17,1
4
350
1,632
0,233
14,3
5
300
1,502
0,172
11,5
6
260
1,404
0,228
16,2
7
200
1,312
0,167
12,7
8
180
1,265
0,206
16,3
9
160
1,204
0,315
26,2
10
120
1,116
0,305
27,3
11
100
1,034
0,433
41,9
12
90
0,902
0,225
24,9
13
80
0,854
0,307
35,9
14
75
0,798
0,202
25,3
15
70
0,769
0,306
39,8
16
65
0,658
0,318
48,3
17
60
0,566
0,155
27,4
18
40
0,421
0,198
47,0
19
20
0,374
0,165
44,1
20
15
0,228
0,104
45,6
Примечания. ОП - оптическая плотность.
* - значениЯ ОП приведены после разности величины полученной в ИФ-реакции и
фоновой ОП пластика лунки (от 0,047 до 0,062).
7
BY 11361 C1 2008.12.30
У больных аллергической бронхиальной астмой с сенсибилизацией к грибковым аллергенам (n = 12) предварительная инкубация лейковзвеси с RNWD-тетрапептидом (1 нг/мл)
при 37 °С в течение 30 мин оказывала десенсибилизирующее действие на лейкоциты, в
то время как предварительная инкубация лейковзвеси с тетрапептидом в концентрации
100 пг/мл не оказывала такого влияния на лейкоциты.
Как видно из описания экспериментов, предлагаемые пептиды обеспечивают достижение технического результата - связывают IgE и обладают иммуномодулирующим эффектом.
Практическое применение предлагаемых пептидов в медицине позволит удешевить
иммунодиагностику и сделать доступным поликомпонентное аллергологическое обследование для всех слоев населения. Кроме этого, применение пептидов может быть полезно
для профилактики и лечения IgE-зависимых аллергопатологий.
В настоящий момент разработан процесс получения IgE-связывающих пептидов, проведены лабораторные исследования, которые подтверждают получение технического результата и биологического эффекта.
Источники информации:
1. Shields R.L., Whether W.R., Zioncheck K. et al: Inhibition of allergic reactions with antibodies to IgE. Int Arch Allergy Immunol 1995; 107:308-312.
2. Boulet L.-P., Chapman K.R., Cote J. et al: Inhibitory effects of an anti-IgE antibody E25
on allergen-induced early asthmatic response. Am J Respir Crit Care Med 1997; 155:1835-1840.
3. Casale Т.В., Bernstein I.L., Busse W.W. et al: Use of an anti-IgE humanized monoclonal
antibody in ragweed-induced allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol 1997; 100:110-121.
4. Fahy J.V., Fleming E., Wong H.H. et al: The effects of an anti-IgE monoclonal antibody
on the early-and late-phase response to allergen inhalation in asthmatic subjects. Am J Respir
Crit Care Med 1997; 155:1828-1834.
5. Новиков Д.К., Сергеев Ю.В., Новикова В.И. Аллергические реакции на лекарства. Витебск, 1998. - 203 с.
6. Milgrom H., Pick R.B. Jr, Su J.Q. et al: Treatment of allergic asthma with monoclonal
anti-IgE antibody. N Engl J Med 1999; 341(26):1966-1973.
7. Busse W., Corren J., Lanier B.Q. et al: Omalizumab, anti-IgE recombinant humanized
monoclonal antibody, for the treatment of severe allergic asthma. J Allergy Clin Immunol 2001;
108:184-190.
8. Soler M., Matz J., Townley R. et al: The anti-IgE antibody omalizumab reduces exacerbations and steroid requirement in allergic asthmatics. Eur Respir J 2001; 18:254-261.
9. Новиков П.Д., Новиков Д.К., Сергеев Ю.В. Диагностика лекарственной аллергии //
Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2001. - № 1. - С. 51-64.
10. United States Patent № 4369137.
11. Goldstein G., Scheid M.P., Boyse E.A., Schlesinger D.H., Van Wauwe J. A synthetic
pentapeptide with biological activity characteristic of the thymic hormone thymopoietin // Science. 1979 Jun 22; 204(4399):1309-10.
12. Goldberg E.H., Goldstein G., Boyse E.A., Scheid M.P. Effect of the TP5 analogue of
thymopoietin on the rejection of male skin by aged and thymectomized female mice // Immunogenetics. 1981;13(3):201-4.
13. U.S. Patent № 6267958.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
141 Кб
Теги
by11361, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа