close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11362

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11362
(13) C1
(19)
C 12N 15/10
СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
С ПРОИЗВОЛЬНЫМ ПРАЙМЕРОМ
(21) Номер заявки: a 20061135
(22) 2006.11.13
(43) 2008.06.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт генетики и
цитологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Гузенко Елена Витальевна;
Лемеш Валентина Александровна;
Хотылева Любовь Владимировна;
Богданова Марина Владимировна
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) ЛЕМЕШ В.А. и др. Вестник ВОГиС. 2005. - Т. 9. - № 4. - С. 490-494.
KHAN J.A. et al. Current Science. - 2004. V. 86. - № 11. - Р. 1530-1533.
RU 2004100112 А, 2005.
RU 2203951 C1, 2003.
BY 11362 C1 2008.12.30
(57)
Способ проведения полимеразной цепной реакции с произвольным праймером, включающий последовательное проведение циклов амплификации и реамплификации, отличающийся тем, что цикл реамплификации проводят в реакционной смеси объемом 25
мкл, содержащей в качестве геномной ДНК 1 мкл продукта амплификации, 2,5 мкл ПЦРбуфера, праймер в концентрации 0,2 мкМ, dATP, dCTP, dGTP и dTTP в концентрациях по
200 мкМ, MgCl2 в концентрации 2,5 мМ и 1,5 единицы Taq-полимеразы, при этом отжиг
праймера в цикле реамплификации проводят при температуре, равной температуре отжига
в цикле амплификации.
Фиг. 1
BY 11362 C1 2008.12.30
Изобретение относится к области молекулярной генетики растений, а именно к генетическому картированию. Генетические карты, помимо изучения структуры и организации генома, могут быть также использованы в таких направлениях, как идентификация и
мечение селекционно-ценных количественных и качественных признаков, клонирование
отдельных генов и сравнительное картирование геномов различных видов.
В частности, изобретение относится к главному методологическому подходу в подобного рода исследованиях - применению молекулярных маркеров.
Изобретение может использоваться для уточнения картины генетического полиморфизма в случаях неопределенности или неоднозначности интерпретации результатов, полученных после проведения полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами
(RAPD-PCR).
Аналогами данного способа исследования являются методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основе ПЦР лежит амплификация отдельных фрагментов
ДНК с помощью небольшого числа нуклеотидных последовательностей, называемых
праймерами. В зависимости от типа праймеров существует несколько методов использования PCR, а именно SRS (simple repetitive sequences), DAF (DNA amplification fingerprinting), RFLP (restriction fragment length polymorphism), AFLP (amplification fragment length
polymorphism), ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) [1].
Прототипом по отношению к заявляемому может считаться способ повышения чувствительности PCR методом "гнездной" ("nested") амплификации [2]. Суть его заключается
в последовательном использовании двух пар праймеров - внешней и внутренней. После
использования первой пары праймеров продукт амплификации переносят в другую пробирку с внутренней парой праймеров. Иногда вместо "гнездной" амплификации используют процесс реамплификации. В этом случае проводят дополнительный раунд амплификации, в котором используют прежнюю пару праймеров, а в качестве ДНК-мишени продукт первой реакции амплификации.
Такая схема постановки амплификации более трудоемка и требует особенно тщательного обустройства лабораторных помещений, позволяющих гарантированно избегать контаминации продуктами реакции после использования внешней пары праймеров.
Также известен способ повышения эффективности ISSR анализа [3, 4]. Он заключается в проведении повторной амплификации (реамплификации) при следующих условиях: в
качестве геномной ДНК используется продукт амплификации первого цикла, используется тот же ISSR-праймер, но увеличивается температура отжига с 55 °С в первом цикле амплификации до 60 °С при реамплификации. Температура 60 °С является максимальной в
диапазоне оптимальных температур отжига ISSR-праймеров.
В последнее время широко применяется амплификация ДНК с произвольными праймерами - RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) [5]. Используя этот метод, можно
достаточно быстро выявить вариабельность большого числа локусов по всему геному.
Возможность тестирования большого числа локусов одновременно позволяет сопоставлять значительные участки генома, что повышает точность сравнительного анализа и степень выявляемого с помощью RAPD-метода генетического полиморфизма.
Наряду с явными достоинствами (анонимность последовательностей, незначительные
количества ДНК, быстрота и экономичность технологии) этот метод обладает и недостатками, главный из которых состоит в строгом соблюдении оптимизированных условий реакции амплификации. Такие факторы, как концентрация матричной ДНК, концентрация
ионов Mg + + , нуклеотидный состав, длина праймера, оказывают влияние на ход реакции
амплификации и должны тщательно контролироваться для получения воспроизводимых
результатов [6, 7, 8]. Для стандартного RAPD-PCR анализа точно определенная оптимальная температура отжига определяет чувствительность амплификации. Ошибка в температуре отжига существенно сказывается на результате амплификации и выражается в
уменьшении выхода основного продукта и появлении неспецифического продукта [9].
Даже при соблюдении необходимых условий проведения полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами в некоторых экспериментах не только не удается обна2
BY 11362 C1 2008.12.30
ружить полиморфизм, но иногда при сканировании агарозного геля после проведения электрофоретического разделения фрагментов ДНК получают черный снимок, то есть продукты
амплификации не проявляются.
В связи с этим задача заявляемого способа состоит в повышении эффективности
RAPD-PCR анализа ДНК, в том числе и в тех случаях, когда введение процедуры дополнительной очистки ДНК органическими растворителями не улучшает качество амплификации. Заявляемый способ направлен на получение четких и воспроизводимых RAPDпрофилей, а также на изменение продуктивности полимеразной цепной реакции в сторону
увеличения количества фрагментов и/или увеличения количества полиморфных фрагментов в RAPD-спектрах.
Для решения поставленной задачи разработана методика проведения RAPD-PCR анализа с добавлением процедуры реамплификации. Сущность заявленного способа состоит
в том, что после проведения RAPD-PCR стандартным способом (реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 20 нг геномной ДНК, 0,2 мкМ праймера, 200 мкМ каждого dATP,
dCTP, dGTP и dTTP, 2,5 мМ MgCl2 и 1,5 единицы Taq-полимеразы в инкубационном буфере) проводится реамплификация.
Для реакции реамплификации используется PCR-реакционный продукт из первого
цикла (в качестве геномной ДНК). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 1 мкл
продукта реакции амплификации в качестве матричной ДНК (концентрация ДНК не существенна и не влияет на ход реакции), 2,5 мкл PCR-буфера, 0,2 мкМ праймера, 200 мкМ
каждого dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 2,5 мМ MgCl2 и 1,5 единицы Taq-полимеразы в инкубационном буфере. Реамплификация проводится в амплификаторе по стандартному протоколу [5]. Температура отжига RAPD-праймера не меняется.
При разработке данного способа мы использовали праймеры, с которыми не смогли
получить четких RAPD-профилей при проведении амплификации стандартным способом.
Подобная амплификация считается неудачной и многие праймеры могут быть отнесены к
неперспективным. Реамплификация позволяет изменить ситуацию. В результате проведенных нами исследований установлено, что после добавления процедуры реамплификации в стандартный RAPD-PCR анализ четко прослеживаются следующие реамплификационные эффекты:
1) увеличивается интенсивность полос, что проиллюстрировано на фиг. 1.
На фиг. 1а представлены RAPD-профили (1-14) ДНК-образцов льна после проведения
полимеразной цепной реакции стандартным способом (изображение очень слабое). На
фиг. 1б представлены RAPD-профили (1'-14') ДНК тех же образцов льна после проведения
полимеразной цепной реакции с последующей реамплификацией. М-маркер молекулярной массы (1 kb). Четко видны полосы.
2) появляются новые полосы и/или новые полиморфные полосы на гелевом образце
при сравнении второго цикла с первым, что отображено на фиг. 2, 3.
На фиг. 2 представлены RAPD-профили (1-5) ДНК-образцов льна после проведения
полимеразной цепной реакции стандартным способом, где продукт амплификации ДНК
первого (1) образца льна не проявляется. На этой же фигуре представлены RAPD-профили
(1'-5') ДНК тех же образцов льна после проведения полимеразной цепной реакции с последующей реамплификацией, где продукт реамплификации ДНК первого (1') образца
льна проявился. М-маркер молекулярной массы (1 kb).
На фиг. 3 представлены RAPD-профили (1-2) ДНК-образцов льна после проведения
полимеразной цепной реакции стандартным способом (продукты амплификации ДНКобразцов льна не проявились). На этой же фигуре представлены RAPD-профили (1'-2')
ДНК тех же образцов льна после проведения полимеразной цепной реакции с последующей реамплификацией. Продукты реамплификации ДНК-образцов льна проявились, а
также у образца 2' наблюдаются полиморфные полосы.
Предложенный нами способ проведения полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами имеет ряд преимуществ:
получение четких и воспроизводимых RAPD-профилей,
3
BY 11362 C1 2008.12.30
увеличение продуктивности RAPD-PCR (получение новых полос и/или новых полиморфных полос),
не требует подбора условий проведения стандартной RAPD-PCR,
позволяет проводить эффективный отбор высокоинформативных RAPD-праймеров.
Данный способ расширяет возможности RAPD-анализа в изучении генетической изменчивости и идентификации генотипов в случаях неопределенности или неоднозначности интерпретации результатов RAPD-анализа.
Источники информации:
1. Малышев С.В., Картель Н.А. Молекулярные маркеры в генетическом картировании
растений // Молекулярная биология. - 1997. - 31. - № 2. -С. 197-208.
2. Khan J.A., Srivastava P. and SinghVirology S.К.Efficacy of nested-PCR for the detection
of phytoplasma causing spike disease of sandal // Current Science. - 2004.86. - № 11. - P. 15301533.
3. Hengen P.N. Reamplification of PCR fragments // Trends Biochem.Sci. - 1995.20. - P. 124125.
4. Wiesner I.,Wiesnerova D. Insertion of a reamplification round into the ISSR-PCR protocol gives new flax fingerprinting patterns // Cellular&Molecular biology letters. 2003.8. P. 743748.
5. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Research. - 1990. 18. - № 24. - P. 7213-7218.
6. Penner G.A. RAPD analysis in plant genomes // Methods of genome analysis in plant. 1996. 9. - P. 252-268.
7. Devos K.M., Gale M.D. The use of random amplified polymorphic DNA markers in
wheat // Theor Appl. Genet. - 1992. 84. - P. 567-572.
8. Karp A., Edwards K.J., Bruford M., Funk S., Vosman В., Morgante M., Seberg O.,
Kremer A., Boursot P., Arctander P., Tautz D., Hewitt G.M. Molecular technologiesm for biodiversity evaluation: Opportunities and challenges // Nature Biotechnology. - 1997. - 15. - P. 625628.
9. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях // Научно-методическое руководство / Под ред. Ю.М.Сиволапа. - Киев: Аграрная наука, 1998. - 156 с.
Фиг. 2
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
830 Кб
Теги
by11362, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа