close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11370

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11370
(13) C1
(19)
G 01N 21/64
СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛЮМИРУБИНА
В СМЕСИ ФОТОПРОДУКТОВ Z,Z-БИЛИРУБИНА IXα
α,
СВЯЗАННОГО С СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ ЧЕЛОВЕКА
(21) Номер заявки: a 20061240
(22) 2006.12.08
(43) 2008.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт физики
имени Б.И.Степанова Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Плавский Виталий Юльянович; Мостовников Василий Андреевич; Мостовникова Галина Ростиславовна; Третьякова Антонина
Ивановна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) SANEYUKI Y. etc. Pediatr. Int., 2001,
v.43, p. 270-275.
US 3569721, 1971.
(57)
1. Способ определения абсолютной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов Z,Z-билирубина IXα, связанного с сывороточным альбумином человека, заключающийся в регистрации спектроскопических характеристик смеси, отличающийся тем, что
регистрируют спектры флуоресценции, возбуждаемой последовательно излучением с
1)
длиной волны λ (возб
= 540 ± 10 нм , индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 560-800 нм
BY 11370 C1 2008.12.30
800
общей интенсивностью I ∑ =
∑
∫ I λ dλ
люмирубина и фотопродукта смеси, характеризуемого
560
Фиг. 1
BY 11370 C1 2008.12.30
наиболее длинноволновой полосой флуоресценции среди фотопродуктов Z,Z-билирубина
2)
IXα, и λ (возб
= 620 ± 5 нм , индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 635-800 нм вы800
∫ I λ dλ , при этом абсолютную кон-
бранного фотопродукта общей интенсивностью I 2 =
2
635
центрацию люмирубина Сх в смеси определяют из выражения:
C x = ( C эт / I эт ) I ∑ − I (2n ) ,
где Сэт - концентрация эталонного раствора люмирубина;
(
800
эт
∫ I λ dλ
I эт =
)
- интенсивность флуоресценции в диапазоне 560-800 нм эталонного рас-
560
1)
твора люмирубина при длине волны возбуждения λ (возб
= 540 ± 10 нм ;
800
I (2n ) =
∫ Iλ
(2n )
dλ - интенсивность флуоресценции выбранного фотопродукта в спек-
635
1)
тральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции λ (возб
= 540 ± 10 нм , определяемая на основании измерения спектра флуоресценции при возбуждении
2)
λ (возб
= 620 ± 5 нм с последующим нормированием указанного спектра до величины,
обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком спектра
1)
флуоресценции смеси при ее возбуждении при λ (возб
= 540 ± 10 нм .
2. Способ определения относительной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов Z,Z-билирубина IXα, связанного с сывороточным альбумином человека, заключающийся в регистрации спектроскопических характеристик смеси, отличающийся тем,
что регистрируют спектры флуоресценции, возбуждаемой последовательно излучением с
1)
длиной волны λ (возб
= 540 ± 10 нм , индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 560-800
800
нм общей интенсивностью I ∑ =
∑
∫ I λ dλ
люмирубина и фотопродукта смеси, характери-
560
зуемого наиболее длинноволновой полосой флуоресценции среди фотопродуктов Z,Z2)
билирубина IXα, и λ (возб
= 620 ± 5 нм , индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 635800
800 нм выбранного фотопродукта общей интенсивностью I 2 =
∫ I λ dλ , при этом относи2
635
тельную концентрацию люмирубина Сотн в смеси определяют из выражения:
C отн = K I ∑ − I (2n ) ,
где К - коэффициент пропорциональности;
(
)
800
I (2n )
=
∫ Iλ
(2n )
dλ - интенсивность флуоресценции выбранного фотопродукта в спек-
635
1)
= 540 ± 10 нм ,
тральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции λ (возб
определяемая на основании измерения спектра флуоресценции при возбуждении
2)
λ (возб
= 620 ± 5 нм с последующим нормированием указанного спектра до величины,
обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком спектра
1)
флуоресценции смеси при ее возбуждении при λ (возб
= 540 ± 10 нм .
2
BY 11370 C1 2008.12.30
Изобретение относится к аналитической химии и фотохимии тетрапиррольных соединений, в частности к фотоизомеризации и фотоциклизации Z,Z-билирубина IXα, и может
быть использовано для контроля уровня люмирубина (циклобилирубина), определяющего
эффективность фототерапии гипербилирубинемии новорожденных детей, обусловленной
избыточным накоплением в организме младенца Z,Z-билиpyбина IXα.
Известен способ определения концентрации люмирубина (другое название данного
продукта - циклобилирубин) в смеси фотопродуктов билирубина, содержащей люмирубин, нативный Z,Z-билирубина IXα и его геометрические изомеры, включая Z,Eбилирубин IXα, Е,Z-билирубин IXα, E,E-билирубин IXα, а также биливердин и др. [1].
Способ заключается в разделении смеси на отдельные компоненты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращением фазы. В качестве элюента
используется смесь воды (7 %) и 0,1 М ди-n-октиламинацетата в метаноле. Скорость протока жидкости составляет 1 мл/мин. Относительная концентрация каждой компоненты,
включая люмирубин, определяется путем контроля оптической плотности в области максимума спектра поглощения фотоизомеров билирубина на длине волны 450 нм с последующим пересчетом с учетом коэффициента молярной экстинкции каждой компоненты.
Недостатками известного способа являются использование в качестве элюента токсичного растворителя (метанола), а также необходимость периодической замены хроматографических колонок, со временем забивающихся анализируемым веществом. Еще один
недостаток известного способа - длительность проведения анализа. Так, согласно [1] пик,
соответствующий прохождению основного вещества (Z,Z-билирубина IXα) при хроматографическом разделении смеси фотопродуктов билирубина методом ВЭЖХ, наблюдается
через 25 минут после старта.
Наиболее близким по сущности к заявляемому способу определения концентрации
люмирубина в смеси фотопродуктов Z,Z -билирубина IXα является способ, описание которого приведено в [2]. Способ основан на измерении спектров поглощения в области
350-700 нм как интактного, то есть необлученного раствора Z,Z-билирубина IXα, находящегося в комплексе с сывороточным альбумином человека, так и указанного раствора после его облучения. Присутствие альбумина в растворе обусловлено, во-первых, крайне
низкой растворимостью Z,Z-билиpyбинa IХα в водной среде, а во-вторых, тем фактом, что
в крови билирубин находится в составе комплекса с альбумином и комплексообразование
существенно влияет на закономерности фотоизомеризации и фотоциклизации Z,Zбилирубина IХα.
Необлученный водный раствор Z,Z-билиpyбин IХα в присутствии альбумина характеризуется длинноволновым спектром поглощения с максимумом в области 460 нм. Согласно [2], при поглощении света Z,Z-билирубином IXα, связанного с альбумином, в спектре
поглощения наблюдается снижение оптической плотности (А) в области 380-520 нм и
прирост А в спектральных диапазонах 300-380 нм и 520-700 нм. Причинами снижения оптической плотности в области максимума спектра поглощения Z,Z-билирубина IXα являются более низкие значения молярного коэффициента экстинкции образующихся
фотопродуктов (люмирубина, Z,E-билирубина IXα, Е,Z-билирубина IXα, Е,Е-билирубина
IXα, а также продуктов фотоокисления). Причем наиболее выраженные различия в коэффициентах поглощения наблюдаются между Z,Z-билиpyбинoм IXα и люмирубином. По
этой причине уменьшение оптической плотности на длине волны 460 нм (A460) при воздействии оптического излучения обусловлено, прежде всего, образованием люмирубина
(циклобилирубина) из Z,Z-билирубина IXα. Авторами [2] путем сопоставления концентрации люмирубина, измеренной методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, и измерений спектров поглощения показано, что процент снижения оптической
плотности на длине волны 460 нм (A460) при низких дозах воздействующего излучения
прямо пропорционален концентрации образующегося люмирубина (циклобилирубина).
3
BY 11370 C1 2008.12.30
Таким образом, способ определения относительной концентрации люмирубина в смеси
фотопродуктов билирубина, предложенный в [2], состоит в определении процента снижения оптической плотности на длине волны 460 нм (А460) облученного раствора Z,Zбилирубина IXα, связанного с сывороточным альбумином человека, в сравнении с оптической плотностью интактных, необлученных растворов.
Недостатком известного способа является тот факт, что с его помощью можно определить лишь относительный уровень люмирубина (циклобилирубина) в смеси фотопродуктов. При этом способ, описание которого приведено в [2], не позволяет произвести
оценку абсолютной концентрации люмирубина в молях или мг/мл в смеси фотопродуктов.
Еще один существенный недостаток известного способа состоит в том, что линейная зависимость между концентрацией люмирубина и процентом снижения оптической плотности на длине волны 460 нм (А460) облученного раствора Z,Z-билирубина IХα, связанного с
сывороточным альбумином человека, наблюдается до тех пор, пока снижение А460 не превышает 23 %. При дальнейшем облучении раствора оптическая плотность на длине волны
А460 нм продолжает снижаться, однако концентрация люмирубина (циклобилирубина),
как следует из данных хроматографических исследований [2], практически не меняется.
То есть способ, предложенный в [2], позволяет оценить относительную концентрацию
люмирубина лишь при низкой поглощенной дозе. При более высоких дозах воздействующего излучения в растворе становится значительным вклад продуктов фотоокисления
билирубина, не поглощающих на длине волны 460 нм, но являющихся причиной дальнейшего снижения А460, не связанного с образованием люмирубина. Вклад продуктов фотоокисления становится особенно выраженным при облучении кислородсодержащих
растворов Z,Z-билирубина IХα, что резко увеличивает погрешность определения относительной концентрации люмирубина известным методом. То есть известный способ дает
различные результаты в определении уровня люмирубина для образцов, облученных в кислородсодержащих и обескислороженных условиях, хотя, как следует из данных хроматографических анализов, концентрация образующегося люмирубина не зависит от
концентрации кислорода в облучаемой смеси.
Задачей предполагаемого изобретения является разработка способа контроля как абсолютной концентрации люмирубина, так и его относительной концентрации (то есть концентрации в одном растворе по отношению к концентрации в другом растворе) в смеси,
содержащей наряду с люмирубином и Z,Z-билиpyбинoм IХα, связанным с сывороточным
альбумином человека, другие фотопродукты Z,Z-билирубина IXα, включая Z,E-билирубин
IXα, Е,Z-билирубин IXα, Е,Е-билирубин IXα, а также продукты фотоокисления Z,Zбилирубина IXα без разделения смеси на отдельные компоненты.
Поставленная задача решается следующим образом. В способе определения абсолютной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов Z,Z-билирубина IXα, связанного
с сывороточным альбумином человека, заключающемся в регистрации спектроскопических характеристик смеси, регистрируют спектры флуоресценции, возбуждаемой
1)
= 540 ± 10 нм, индуцирующей флуопоследовательно излучением с длиной волны λ(возб
ресценцию в диапазоне 560-800 нм общей интенсивностью I ∑ =
800
∑
∫ I λ dλ
люмирубина и
560
фотопродукта смеси, характеризуемого наиболее длинноволновой полосой флуоресцен2)
= 620 ± 5 нм, индуцирующей
ции среди фотопродуктов Z,Z-билирубина IXα, и λ(возб
флуоресценцию в диапазоне 635-800 нм выбранного фотопродукта общей интенсивностью I 2 =
800
( 2)
∫ Iλ
dλ , при этом абсолютную концентрацию люмирубина Сx в смеси опреде-
635
ляют из выражения:
4
BY 11370 C1 2008.12.30
(
)
C x = (C эт / I эт ) I ∑ − I (2n ) ,
где Сэт - концентрация эталонного раствора люмирубина;
800
( эт )
∫ Iλ
dλ - интенсивность флуоресценции в диапазоне 560-800 нм эталонного раство-
560
1)
= 540 ± 10 нм;
ра люмирубина при длине волны возбуждения λ(возб
I (2n ) =
800
(2n )
∫ Iλ
dλ - интенсивность флуоресценции выбранного фотопродукта в спек-
635
1)
= 540 ± 10 нм,
тральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции λ(возб
определяемая на основании измерения спектра флуоресценции при возбуждении
2)
λ(возб
= 620 ± 5 нм с последующим нормированием указанного спектра до величины,
обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком спектра
1)
= 540 ± 10 нм.
флуоресценции смеси при ее возбуждении при λ(возб
Для определения относительной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов
Z,Z- билирубина IXα, связанного с сывороточным альбумином человека, заключающемся
в регистрации спектроскопических характеристик смеси, регистрируют спектры флуорес1)
= 540 ± 10 нм,
ценции, возбуждаемой последовательно излучением с длиной волны λ(возб
индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 560-800 нм общей интенсивностью
I∑ =
800
∑
∫ I λ dλ
люмирубина и фотопродукта смеси, характеризуемого наиболее длинно-
560
волновой полосой флуоресценции среди фотопродуктов Z,Z-билирубина IXα, и
2)
λ(возб
= 620 ± 5 нм, индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 635-800 нм выбранного
фотопродукта общей интенсивностью I 2 =
800
( 2)
∫ Iλ
dλ , при этом относительную концентра-
635
цию люмирубина Сотн в смеси определяют из выражения:
C отн = K I ∑ − I (2n ) ,
где K - коэффициент пропорциональности;
(
I (2n ) =
800
(2n )
∫ Iλ
)
dλ - интенсивность флуоресценции выбранного фотопродукта в спек-
635
1)
= 540 ± 10 нм, оптральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции λ(возб
ределяемая на основании измерения спектра флуоресценции при возбуждении
2)
λ(возб
= 620 ± 5 нм с последующим нормированием указанного спектра до величины,
обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком спектра
1)
= 540 ± 10 нм.
флуоресценции смеси при ее возбуждении при λ(возб
Сущность способа определения концентрации люмирубина (циклобилирубина) поясняется чертежами, где на фиг. 1 показаны структурные формулы Z,Z-билирубина IXα
и люмирубина; на фиг. 2 - спектры поглощения Z,Z-билирубина IXα, связанного с сывороточным альбумином человека, до облучения и при облучении кислородсодержащих
растворов излучением гелий-кадмиевого и аргонового лазеров; на фиг. 3 - спектры поглощения Z,Z-билирубина IXα, связанного с сывороточным альбумином человека до облучения и при облучении обескислороженных растворов излучением гелий-кадмиевого и
5
BY 11370 C1 2008.12.30
аргонового лазеров; на фиг. 4 - спектры флуоресценции Z,Z-билирубина IXα, связанного
с сывороточным альбумином человека, до облучения и спектры флуоресценции смеси
фотопродуктов, образовавшихся в результате облучения кислородсодержащих растворов
излучением гелий-кадмиевого и аргонового лазеров; на фиг. 5 - спектры возбуждения
флуоресценции и флуоресценции фотопродуктов, образующихся в результате облучения
Z,Z-билирубина IXα, связанного с сывороточным альбумином человека, излучением аргонового лазера; на фиг. 6 - спектры флуоресценции смеси двух фотопродуктов, включая
люмирубин, а также спектр флуоресценции люмирубина.
Как следует из фиг. 1, молекулы люмирубина, как и молекулы Z,Z-билирубина IXα
состоят из двух хромофоров (хромофора I и хромофора II), каждый из которых характеризуется собственным спектром поглощения и флуоресценции. При этом хромофоры II являются структурно идентичными для указанных соединений. Структура хромофора I для
молекулы Z,Z-билиpyбина IXα молекулы люмирубина отличается, что является предпосылкой для разработки способа определения концентрации люмирубина в растворе, основанном на регистрации флуоресценции хромофора I.
Воздействие света на Z,Z-билиpyбин IXα, связанный с альбумином, приводит к изменению спектров поглощения билирубина. Спектр поглощения раствора Z,Z-билирубина
IXα (концентрация 2 мкМ), связанного с альбумином (концентрация 1 мкМ), до облучения показан на фиг. 2, кривая 1. Максимум спектра поглощения Z,Z-билирубина IXα в
составе комплекса расположен при 460 нм. В результате воздействия на кислородсодержащие растворы в течение t = 30 мин излучением аргонового лазера с длиной волны
λ = 514,5 нм и плотностью мощности Р = 10 мВт/см2 наблюдается снижение оптической
плотности в максимуме спектра поглощения Z,Z-билирубина IХα, что отражает кривая 2
на фиг. 3. Воздействие с той же интенсивностью излучением гелий-кадмиевого лазера с
λ = 441,6 нм также сопровождается снижением оптической плотности в максимуме спектра поглощения, что отражает кривая 3 на фиг. 2.
На фиг. 3 показано изменение спектров поглощения растворов Z,Z-билирубина IХα
(концентрация 2 мкМ), связанного с альбумином (концентрация 1 мкМ) при их облучении
излучением тех же лазеров в обескислороженных условиях. При этом кривая 1 относится
к необлученному раствору, кривая 2 - к раствору, облученному в течение t = 30 мин излучением аргонового лазера с длиной волны λ = 514,5 нм и плотностью мощности Р =
10 мВт/см2, кривая 3 - к раствору, облученному в течение t = 30 мин излучением гелийкадмиевого лазера с длиной волны λ = 441,6 нм и плотностью мощности Р = 10 мВт/см2.
Как следует из сопоставления данных, представленных на фиг. 2 и фиг. 3, при облучении
кислородсодержащих растворов наблюдается более выраженное "подсаживание" спектра
поглощения, чем для обескислороженных растворов. Указанное влияние кислорода объясняется тем, что в аэробных условиях под действием излучения в билирубине, кроме
процессов фотоизомеризации, протекают фотохимические реакции самосенсибилизированного окисления с образованием ряда бесцветных фотопродуктов. Увеличение их
концентрации, а также концентрации фотоизомеров, характеризующихся коротковолновым расположением полосы поглощения, и является одной из причин прироста оптической плотности в ультрафиолетовой части спектра по мере увеличения дозы облучения.
Следует отметить, что поскольку одна из полос поглощения люмирубина, обусловленная наличием в его структуре хромофора II, расположена в области 455 нм, то, возбуждая флуоресценцию при указанной длине волны, можно было бы по интенсивности
спектра флуоресценции люмирубина в смеси фотопродуктов определять концентрацию
люмирубина, поскольку концентрация люмирубина прямо пропорциональна интенсивности его флуоресценции. На фиг. 4 представлены спектры флуоресценции при длине волны
возбуждения λвозб = 455 нм Z,Z-билирубина IXα, связанного с сывороточным альбумином
человека, до облучения (кривая 1) и спектры флуоресценции смеси фотопродуктов, образо-
6
BY 11370 C1 2008.12.30
вавшихся в результате облучения указанных кислородсодержащих растворов излучением
гелий-кадмиевого (кривая 2) или аргонового (кривая 3) лазеров. Как следует из рисунка,
при возбуждении флуоресценции в области поглощения хромофора II спектры флуоресценции необлученного и облученных растворов отличаются очень незначительно. По этой
причине указанная область спектра не может использоваться для селективного возбуждения люмирубина.
Представленные на фиг. 5 спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции
фотопродуктов, образующихся в результате облучения Z,Z-билирубина IХα, связанного
с сывороточным альбумином человека, излучением аргонового лазера, показывают, что
для возбуждения флуоресценции люмирубина может использоваться излучение с длиной
волны, соответствующей возбуждению хромофора I. Так, кривые 1 и 2 на фиг. 5 представляют собой спектры флуоресценции, возбуждаемой, соответственно, при длине волны
1)
1)
2)
= 540 ± 10 нм
= 540 ± 10 нм. Как следует из фигуры, при λ(возб
λ(возб
= 620 ± 5 нм и λ(возб
спектр флуоресценции фотопродуктов характеризуется двумя максимумами, расположенными при λ = 650 и 706 нм (кривая 2). При смещении возбуждения в более длинноволно2)
= 620 ± 5 нм в спектре флуоресценции регистрируется одна полоса с
вую область λ(возб
максимумом при λ = 706 нм (кривая 1). В спектре возбуждения флуоресценции при
λрег = 680 нм (кривая 4) максимумы расположены в области 337 нм, 455 нм и 592 нм, а при
λрег = 740 нм (кривая 3) - 377 нм и 620 нм. Причем фотопродукт, характеризующийся максимумами поглощения при 337 нм, 455 нм и 592 нм, а люминесценцией при λмакс = 650 нм,
представляет собой люмирубин. За поглощение света в области λмакс = 455 нм ответственен хромофор II люмирубина, а в области λмакс = 592 нм и λмакс = 337 нм поглощение обусловлено хромофором I, содержащим два пиррольных фрагмента и семичленное кольцо.
Указанный хромофор относится к небензоидным ароматическим соединениям (производным азаазулена).
Фотопродукт, характеризующийся поглощением в области λмакс = 377 нм и λмакс = 620 нм
и люминесценцией при λмакс = 706 нм, образуется из люмирубина в результате отрыва
водорода от метиленовой группы, соединяющей оба хромофора. Примечательно, что в
длинноволновой части спектра поглощает еще один фотопродукт билирубина - биливердин. Его спектр поглощения в комплексе с альбумином характеризуется максимумами
в области λмакс = 380 нм и λмакс = 670 нм, однако в облученной смеси он обнаруживается
в следовых количествах и практически не флуоресцирует.
Таким образом, люмирубин, ответственный за снижение уровня билирубина в организме новорожденных детей при проведении фототерапии гипербилирубинемии, наряду с
поглощением в области 450-460 нм имеет поглощение в ультрафиолетовом диапазоне
λмакс = 337 нм, а также в области λмакс = 592 нм. Максимум флуоресценции люмирубина
расположен при λмакс = 650 нм (λвозб = 540 нм). Исследования показали, что в растворе,
содержащем наряду с люмирубином ZZ-билирубин, а также его цис-тран-фотоизомеры,
отсутствует длина волны, позволяющая произвести селективное возбуждение флуоресценции люмирубина. Как следует из фиг. 5, кривая 1 и кривая 2, регистрируемый спектр
флуоресценции содержит также примесное свечение фотопродуктов. По этой причине
использование люминесценции для оценки относительной концентрации люмирубина
в смеси фотопродуктов (без их хроматографического разделения) требует разложения
суммарного спектра на индивидуальные компоненты. В этом случае анализ может быть
произведен с применением, например, широко известного метода Аленцева-Фока либо
методом компьютерного моделирования. Указанная процедура значительно упрощается,
поскольку спектр флуоресценции фотопродукта F2 при λвозб = 620 нм не искажен свечением других компонент и его доля в суммарном спектре флуоресценции может быть оценена
по интенсивности испускания на ее длинноволновом склоне.
7
BY 11370 C1 2008.12.30
Суть разработанного нами способа определения спектра флуоресценции люмирубина,
(интенсивность которой пропорциональна концентрации люмирубина) в смеси фотопродуктов билирубина поясняет фиг. 6. При этом кривая 1 на фиг. 6 представляет собой
спектр флуоресценции одного из фотопродуктов (F2) в облучаемой смеси при его возбуж2)
= 620 ± 5 нм. Общая интенсивность I2 флуоресценции в диапазоне 635-800 нм
дении λ(возб
пропорциональна площади под указанной кривой, то есть I 2 =
800
( 2)
∫ Iλ
dλ . Общая интенсив-
635
ность флуоресценции люмирубина непосредственно не может быть измерена, так как отсутствует длина волны, обеспечивающая его селективное возбуждение. При возбуждении,
1)
= 540 ± 10 нм, наблюдается суммарная флуоресценция двух фотопродуктов смепри λ(возб
си (F1 и F2), один из которых (F1) является люмирубином. Суммарная интенсивность I ∑
флуоресценции в диапазоне 560-800 нм пропорциональна площади под указанной кривой,
то есть I ∑ =
800
∑
∫ I λ dλ .
560
Для определения вклада люмирубина в суммарный спектр флуоресценции примем во
1)
= 540 ± 10 нм,
внимание, что в диапазоне λ > 750 нм спектр флуоресценции как при λ(возб
2)
= 620 ± 5 нм сформированы одним и тем же веществом (F2) и должны совпатак и λ(возб
дать.
Кривая 1' на фиг. 6 представляет собой спектр флуоресценции фотопродукта F2 в спек1)
= 540 ± 10 нм.
тральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции λ(возб
Указанный спектр получен на основании измерения спектра флуоресценции при возбуж2)
= 620 ± 5 нм с последующим нормированием указанного спектра до величидении λ(возб
ны, обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком
1)
= 540 ± 10 нм.
спектра флуоресценции смеси при ее возбуждении при λ(возб
Таким образом, согласно данным, представленным на фиг. 6, известна суммарная
интенсивность флуоресценции I ∑ =
800
∑
∫ I λ dλ
(кривая 2) двух фотопродуктов смеси (F1 и
560
F2), один из которых (F1) является люмирубином, и интенсивность флуоресценции
I (2n )
=
800
(2n )
∫ Iλ
dλ (кривая 1') одного из фотопродуктов (F2) при тех же условиях возбуждения.
635
Отсюда следует, что интенсивность (Iлр) флуоресценции люмирубина (фотопродукта
F1) является разностью этих величин: I лр = I ∑ − I (2n ) . На фиг. 6 спектру флуоресценции
люмирубина соответствует кривая 3. При этом общая интенсивность флуоресценции люмирубина Iлр в диапазоне 560-800 нм пропорциональна площади под указанной кривой.
Определение абсолютной концентрации люмирубина производится по формуле:
C x = ( C эт / I эт ) I ∑ − I (2n ) .
где Cx - определяемая концентрация люмирубина; Cэт - концентрация эталонного раствора
(
)
(
люмирубина известной концентрации; I эт =
800
)
( эт )
∫ Iλ
dλ – интенсивность флуоресценции
560
в диапазоне 560-800 нм эталонного раствора люмирубина при длине волны возбуждения
1)
λ(возб
= 540 ± 10 нм.
8
BY 11370 C1 2008.12.30
Определение относительной концентрации (Сотн) люмирубина в смеси производится
по формуле:
C отн = K I ∑ − I (2n ) ,
где K - коэффициент пропорциональности, характеризующий измерительную флуоресцентную установку.
Примечательно, что для определения относительной концентрации люмирубина, например с целью изучения его образования при различных условиях облучения растворов
билирубин-альбумин, не требуется использования эталонных растворов.
Как показали проведенные измерения с использованием предложенного способа, концентрация люмирубина, образующегося при облучении Z,Z-билирубина IХα в составе его
комплекса с альбумином, не зависит от концентрации кислорода в облучаемой смеси.
Действительно, при воздействии излучения на комплексы билирубина с альбумином в
присутствие кислорода дополнительно (по сравнению с обескислороженными условиями)
образуются продукты фотоокисления билирубина, которые практически не флуоресцируют и не могут исказить результаты определения концентрации люмирубина, основанные
на флуоресцентном методе. Полученный результат (независимость выхода люмирубина
от концентрации кислорода в облучаемой смеси) соответствует данным, основанным на
использовании хроматографических методов определения люмирубина. Для сравнения
отметим, что при использовании способа, суть которого изложена в прототипе [2], выход
люмирубина выше в кислородсодержащих условиях, что не соответствует данным других
методов.
В отличие от прототипа заявляемый способ применим также для определения концентрации люмирубина как в условиях низких, так и высоких доз воздействующего излучения. Необходимое условие, которое должно соблюдаться при проведении флуоресцентных исследований, состоит в том, что на длине волны возбуждения и регистрации
флуоресценции оптическая плотность раствора не должна превышать А = 0,10-0,15, что
обеспечит наличие линейной зависимости между концентрацией люмирубина и интенсивностью его флуоресценции. В случае, если оптическая плотность раствора превышает
указанное значение, для записи спектров могут использоваться кюветы с меньшей базой
или разбавленные растворы.
Таким образом, разработанный способ позволяет определить как относительную, так
и абсолютную концентрацию люмирубина (циклобилирубина) в смеси фотопродуктов
билирубина, содержащей люмирубин, нативный Z,Z-билирубин IXα и его геометрические
изомеры, включая Z,E-билирубин IXα, Е,Z-билирубин IXα, E,E-билирубин IXα, а также
биливердин и продукты фотоокисления Z,Z-билирубина IXα без разделения компонент по
фракциям.
(
)
Источники информации:
1. G. Agati, F. Fusi, R. Pratesi, A.F. McDonagh. Wavelength-dependent quantum yield for
Z→E isomerization of bilirubin complexed with human serum albumin. Photochem. Photobiol. 1992. - Vol. 55, № 2. - P. 185-190.
2. S. Yasuda, S. Itoh, T. Imai, K. Isobe, S. Onishi. Cyclobilirubin formation by in vitro
photoirradiation with neonatal phototherapy light. Pediatr. Int. 2001 Vol. 43, № 3, P. 270-275.
9
BY 11370 C1 2008.12.30
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
10
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
158 Кб
Теги
by11370, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа