close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11524

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.02.28
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/50
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ВИРУСНОМ
ГЕПАТИТЕ В, С ИЛИ МИКСТ-ГЕПАТИТЕ B+С
(21) Номер заявки: a 20060612
(22) 2006.06.19
(43) 2008.02.28
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Научно-исследовательский
институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь (BY)
(72) Авторы: Титов Леонид Петрович;
Тарасюк Владимир Васильевич;
Черношей Дмитрий Александрович;
Жмуровская Людмила Степановна
(BY)
BY 11524 C1 2009.02.28
BY (11) 11524
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Научно-исследовательский
институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения
Республики Беларусь (BY)
(56) ЧЕРНОШЕЙ Д.А. и др. Современные
проблемы инфекционной патологии
человека. Материалы II научно-практической конференции. - Мн.: ФилСерв
плюс, 2001. - С. 341-345.
BY 2743 C1, 1999.
BY 4762, C1, 2002.
(57)
Способ диагностики функциональной активности клеточного звена иммунной системы при вирусном гепатите В, С или микст-гепатите В + С, включающий определение
количества иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих маркер адгезии CD11b и маркеры активации CD25 и HLA-DR, путем их иммунофенотипирования, отличающийся
тем, что дополнительно рассчитывают индексы активации CD11b/CD25, CD11b/HLA-DR
и CD25/HLA-DR соответственно по отношению количества клеток, экспрессирующих
CD11b, к количеству клеток, экспрессирующих CD25, по отношению количества клеток,
экспрессирующих CD11b, к количеству клеток, экспрессирующих HLA-DR, и по отношению количества клеток, экспрессирующих CD25, к количеству клеток, экспрессирующих
HLA-DR, и, если индекс активации CD11b/CD25 равен 1,04 ± 0,3, индекс активации
CD11b/HLA-DR равен 0,94 ± 0,18 и индекс активации CD25/HLA-DR равен 1,05 ± 0,08,
судят о нормальной функциональной активности клеточного звена иммунной системы, а
если индексы активации CD11b/CD25 и CD11b/HLA-DR имеют более высокие значения, а
индекс активации CD25/HLA-DR - более низкое, судят о нарушении функциональной активности клеточного звена иммунной системы.
Изобретение относится к области медицины, в частности к способам исследования
иммунной системы, и может быть использовано для определения функциональной активности клеточного звена иммунной системы у больных вирусными гепатитами В (ВГВ), С
(ВГС) и микст-гепатитом В + С (МГВС).
Известен способ оценки функциональной активности Т-клеточного звена иммунной
системы в реакции бласттрансформации лимфоцитов с митогенами путем забора крови из
BY 11524 C1 2009.02.28
периферической вены, выделения лимфоцитов, инкубации их в культуральной среде с добавлением митогенов (ФГА, Кон-А и др.) в СО2-инкубаторе (37 °С и 5,0 % СО2) и последующей оценкой пролиферативной активности лимфоцитов морфологическим способом
или сцинтиляционным методом (применение радиоактивного раствора Н3-тимидина) [1].
Однако известный способ трудоемкий, требует работы в стерильных условиях и с
радиоактивными изотопами, характеризуется низкой точностью и воспроизводимостью,
длителен в исполнении, что делает его непригодным в клинической практике.
Известен способ исследования Т-звена иммунитета путем постановки внутрикожных
тестов с антигенами и/или митогенами in vivo, отражающих общую функциональную активность иммунокомпетентных клеток [2].
Недостатками известного способа являются его трудоемкость, инвазивность, недостаточная информативность вследствие неполной дифференциации типа реагирования
иммунной системы на используемые митогены и невысокая точность (субъективность
полученных результатов).
В качестве прототипа выбран способ диагностики функциональной активности клеточного звена иммунной системы, заключающийся в исследовании периферической крови и
определении поверхностных рецепторов активации (CD25 (рецептора к ИЛ-2), HLA-DR и др.)
и адгезии (CD11b) на клетках иммунной системы путем их иммунофенотипирования [3].
Недостатком известного способа является то, что полученные отдельные морфологические (количественные) характеристики с трудом поддаются функциональной интерпретации и недостаточно информативны.
Задачей настоящего изобретения является создание более эффективного способа, а
именно повышение точности и информативности известного способа определения функциональной активности клеточного звена иммунной системы при ВГВ, ВГС и МГВС.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе диагностики функциональной активности клеточного звена иммунной системы при ВГВ, ВГС и МГВС, включающем определение количества иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих маркер
адгезии CD11b и маркеры активации CD25 и HLA-DR, путем иммунофенотипирования,
согласно изобретению, рассчитывают индексы активации CD11b/CD25, CD11b/HLA-DR и
CD25/HLA-DR, равные соответственно отношению количества клеток, экспрессирующих
CD11b, к количеству клеток, экспрессирующих CD25, отношению количества клеток,
экспрессирующих CD11b, к количеству клеток, экспрессирующих HLA-DR, и отношению
количества клеток, экспрессирующих CD25, к количеству клеток, экспрессирующих
HLA-DR, и если индекс активации CD11b/CD25 равен 1,04 ± 0,3, индекс активации
CD11b/HLA-DR равен 0,94 ± 0,18 и индекс активации CD25/HLA-DR равен 1,05 ± 0,08,
судят о нормальной функциональной активности клеточного звена иммунной системы, а
если индексы активации CD11b/CD25 и CD11b/HLA-DR имеют более высокие значения, а
индекс активации CD25/HLA-DR - более низкое, судят о нарушении функциональной активации клеточного звена иммунной системы.
Способ осуществляют следующим образом. Забирают кровь из периферической вены
(5-6 мл) в пробирки с гепарином (20 ЕД/мл), выделяют мононуклеары периферической
крови (МПК) методом градиентного центрифугирования или иммунофенотипирование
проводят в цельной крови. Экспрессия CD11b, CD25, HLA-DR антигенов на МПК определяется в реакции иммунофлюоресценции с помощью соответствующих моноклональных
антител согласно инструкции производителя. К 100 мкл МПК (1,0×106/мл) или цельной крови добавляют 5-20 мкл соответствующего раствора моноклональных антител и инкубируют в
течение 15-30 мин. Затем в случае с выделенными МПК проводят двойную отмывку
фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и ресуспензируют в 300-500 мкл 1 % раствора параформальдегида для фиксации. В случае с цельной кровью после взаимодействия с моноклональными антителами добавляют лизирующий раствор по 2 мл и инкубируют в
темноте в течение 10 мин с последующей двойной отмывкой ФСБ и ресуспензированием
2
BY 11524 C1 2009.02.28
в 300-500 мкл 1 % раствора параформальдегида. Учет реакции производится на проточном
цитофлюориметре или микроскопическим методом с последующим определением относительного или абсолютного количества клеток, экспрессирующих изучаемые поверхностные
антигены. Затем рассчитывают следующие индексы активации: 1) отношение относительного или абсолютного количества клеток, экспрессирующих маркер адгезии (CD11b), к
относительному или абсолютному количеству клеток, экспрессирующих маркеры ранней
(CD25) и поздней активации (HLA-DR), - CD11b/CD25, CD11b/HLA-DR, характеризующие
степень функциональной активации клеточного звена иммунной системы; 2) отношение
относительного или абсолютного количества клеток, экспрессирующих маркер ранней
активации (CD25), к относительному или абсолютному количеству клеток, экспрессирующих маркер поздней активации (HLA-DR), - CD25/HLA-DR, характеризующий процессы ранней и поздней активации в качестве маркера состояния функционального
резерва иммунокомпетентных клеток. Так, при значении соотношений CD11b/CD25 1,04 ± 0,3; CD11b/HLA-DR - 0,94 ± 0,18 и CD25/HLA-DR - 1,05 ± 0,08 судят о нормальной
функциональной активности клеточного звена иммунной системы (таблица). При повышении CD11b/CD25, CD11b/HLA-DR и уменьшении CD25/HLA-DR - о нарушении функциональной активности клеточного звена иммунной системы, обусловленном наличием
избыточной функциональной активности клеток иммунной системы и формированием состояния анергии за счет истощения функционального резерва иммунокомпетентных клеток.
Индексы активации при ВГВ, ВГС и МГВС
Индекс
Контроль, Острый Хронический
Острый
Хронический
n = 25 ВГВ, n = 38 ВГВ, n = 18 ВГС, n = 38 ВГС, n = 42
МГВС,
n = 24
CD11b/CD25
1,04±0,3 3,57*±0,80 3,42*±0,75 1,89**±0,33 2,36*±0,36 2,03*±0,22
CD11b/HLA-DR 0,94±0,18 1,26±0,13 2,32*±0,54 1,61*±0,22 1,48*±0,11 1,43**±0,20
CD25/HLA-DR 1,05±0,08 0,56±0,1* 0,68±0,08* 1,00±0,12 0,81±0,06* 0,82±0,09
Примечания: * Р < 0,05; ** Р < 0,1.
Предложенный способ позволяет получить функциональные характеристики состояния клеточного звена иммунитета, свидетельствующие о функциональной готовности Т- и
В-лимфоцитов к иммунному ответу или предрасположенности к состоянию анергии иммунокомпетентных клеток в последующем.
У больных ВГС и МГВС индексы CD11b/CD25 и CD11b/HLA-DR были увеличены по
сравнению с таковыми в контрольной группе, что связано со значительным снижением
функциональной активности клеточного звена иммунной системы. Снижение индекса
CD25/HLA-DR, особенно у больных хроническим ВГС (Р < 0,05), свидетельствует о снижении количества клеток, экспрессирующих ранние маркеры активации, и указывает на
истощение функционального резерва иммунного ответа, что играет важную роль в формировании вирусспецифической анергии иммунной системы и неэффективности противовирусного ответа при вирусных гепатитах.
Способ подтверждается примерами.
1. Больной Т., 41 год, история болезни № 1462, дата госпитализации 20.04.2000.
Хронический ВГС установлен в 1998 г., когда впервые были выявлены anti-HCV +.
Поступил в инфекционную больницу для обследования и уточнения активности инфекционного процесса.
Жалоб на момент осмотра не предъявлял.
Результаты лабораторного обследования.
БАК: билирубин общ. - 24,4 (пр. - нет) мкмоль/л, АлАТ - 1,8 ммоль/ч/л, ТП - 9,2 ед.
OAK: 26.04.2000 L - 4,6×109/л; л - 39 %, п - 8 %, с - 45 %, м - 6 %, э - 2 %, СОЭ - 8 мм/ч.;
08.05.2000 L - 4,9х109/л; л - 30 %.
3
BY 11524 C1 2009.02.28
Установлен хронический ВГС (anti-HCV +), клинико-биохимически минимальной степени активности.
Фенотипическая характеристика иммунокомпетентных клеток проведена дважды с
интервалом в 2 недели: 26.04.2000 г. - CD3 - 76,89 % (1,38×109/л), CD4 - 43,08 % (0,77×109/л),
CD8 - 46,88 % (0,84×109/л), CD11b - 26,92 % (0,48×109/л), CD16 - 34,38 % (0,62×109/л),
CD20 - 6,7 % (0,12×109/л), CD25 - 9,91 % (0,18×109/л), CD95 - 52,42 % (0,94×109/л), HLA-DR 20,0 % (0,36×109/л); 08.05.2000 - CD3 - 80,17 % (1,18×109/л), CD4 - 40,22 % (0,59×109/л),
CD8 - 26,54 % (0,39×109/л), CD11b - 14,0 % (0,21×109/л), CD16 - 10,07 % (0,15×109/л),
CD20 - 6,67 % (0,10×109/л), CD25 - 7,24 % (0,11×109/л), CD95 - 48,0 % (0,71×109/л),
HLA-DR - 13,43 % (0,20×109/л).
Индексы активации свидетельствуют о нарушении активации клеточного звена иммунной системы за счет значительного снижения содержания СВ25 +-клеток: при поступлении CD11b/CD25 - 2,72, CD11b/HLA-DR - 1,35 и CD25/HLA-DR + - 0,50; на 12-е сутки CD11b/CD25 - 1,93, CD11b/HLA-DR - 1,04 и CD25/HLA-DR - 0,54, что указывает на нарушение механизмов активации и наличие истощения функционального резерва иммунокомпетентных клеток, способствующих формированию состояния анергии иммунной системы.
2. Больной М., 25 лет, история болезни № 493, дата госпитализации 06.02.2000.
Поступил в инфекционную больницу на 14-й день болезни с жалобами на боль в животе, тошноту, рвоту, желтуху на коже и видимых слизистых, холурию, ахолию.
Установлен диагноз: микст-гепатит: острый ВГВ (HBsAg +, anti-HBcor Ig M +), желтушная среднетяжелая форма на фоне хронического ВГС (anti-HCV +).
Результаты лабораторного обследования.
При поступлении БАК: билирубин общий - 180,4 (пр. 96,4) мкмоль/л, АлАТ 42,0 ммоль/ч/л, ТП - 8,4 ед. OAK: L - 8,5×109 /л; л - 24 %, п - 9 %, с - 51 %, м - нет, э 5 %, СОЭ - 2 мм/ч.
Фенотипические параметры иммунокомпетентных клеток: CD3 - 61,02 % (1,24×109/л),
CD4 - 11,77 % (0,24×109/л), CD8 - 36,88 % (0,75×109/л), CD11b - 13,82 % (0,28×109/л),
CD16 - 31,85 % (0,65×109/л), CD20 - 9,23 % (0,19×109/л), CD25 - 4,55 % (0,09×109/л),
CD95 - 33,63 % (0,69×109/л), HLA-DR - 10,22 % (0,21×109/л).
Расчет индексов активации выявил нарушение активации иммунокомпетентных клеток
за счет снижения экспрессии, в основном, маркера ранней активации CD25: CD11b/CD25 3,04, CD11b/HLA-DR - 1,35 и CD25/HLA-DR - 0,45, что свидетельствует о формировании
состояния анергии.
После проведенного лечения (дезинтоксикационная терапия + гепатопротекторы) в
удовлетворительном состоянии больной выписан.
При выписке БАК: билирубин общ. - 31,9 (пр. - нет) мкмоль/л, АлАТ - 2,5 ммоль/ч/л,
ТП - 2,2 ед. OAK: L - 7,8×109/л; л - 51 %, п - 4 %, с - 34 %, м - 5 %, э - 3 %, СОЭ - 4 мм/ч.
Фенотипические параметры иммунокомпетентных клеток: CD3 - 58,14 % (2,31×109/л),
CD4 - 36,04 % (1,43×109/л), CD8 - 32,09 % (1,28×109/л), CD11B - 24,07 % (0,96×109/л),
CD16 - 30,03 % (1,20×109/л), CD20 - 15,56 % (0,62×109/л), CD25 - 7,41 % (0,29×109/л),
CD95 - 59,33 % (2,36×109/л), HLA-DR - 15,86 % (0,63×109/л).
Значения индексов активации практически не изменились (CD11b/CD25 - 3,25,
CD11b/HLA-DR - 1,52 и CD25/HLA-DR - 0,47), что свидетельствует о состоянии анергии,
обусловленном нарушением процессов активации иммунокомпетентных клеток за счет
функционального истощения клеточного звена иммунной системы на фоне, вероятно, активизации хронического ВГС после улучшения клинико-биохимических показателей острого ВГВ. Подтверждением этого являлось последующее диспансерное наблюдение за
больным через 6 месяцев, которое выявило обострение хронического ВГС (HBsAg-, HBcor
IgG +, ДНК HBV-, anti-HCV +, РНК HCV +).
4
BY 11524 C1 2009.02.28
Таким образом, предлагаемый способ диагностики функциональной активности Тсистемы иммунитета при ВГВ, ВГС и МГВС имеет значение для оценки функциональной
активности клеточного звена иммунной системы и прогноза исхода заболевания, эффективности проводимой терапии. Рассчитываемые соотношения обладают более высокой
информативностью в сравнении с обычными параметрами иммунной системы. Способ не
требует больших материальных и временных затрат по сравнению с известным способом,
прост в исполнении.
Источники информации:
1. Клиническая иммунология и аллергология: Учебное пособие / Под ред. А.В.Караулова. - М.: Медицинское информационное агентство, 2002. -С. 368.
2. Клиническая иммунология и аллергология: Учебное пособие / Под ред. А.В.Караулова. - М.: Медицинское информационное агентство, 2002. -С. 369.
3. Потапнев М., Буглова С., Смольникова В. Проточная цитометрия как метод диагностики патологических состояний человека // Инфекция и иммунитет: Материалы Респ. науч.прак. конф. посв. 75-летию Бел НИИ ЭМ / МЗ Республики Беларусь, Бел НИИ ЭМ, Науч.техн. совет ГНТП "Инфекционные заболевания". Бел. науч. общ. эпид., микр. и параз.,
Бел. науч. общ. иммун., МГМИ, 1999. - С. 566.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
102 Кб
Теги
by11524, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа