close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11553

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.02.28
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 15/79
C 12N 15/82
C 12N 9/42
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pBI-chiA ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ
В РАСТЕНИИ ХИТИНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
ТРАНСГЕННОГО РАСТЕНИЯ
(21) Номер заявки: a 20051277
(22) 2005.12.21
(43) 2007.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт генетики и
цитологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Шахбазов Антон Валерьевич (BY); Ярмолинский Дмитрий
Георгиевич (BY); Картель Николай
Александрович (BY); Чернин Леонид Семенович (IL)
BY 11553 C1 2009.02.28
BY (11) 11553
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) DE 4117026 A1, 1992.
SU 1730146 A1, 1992.
RU 2026348 C1, 1995.
WATANABE T. et al. Journal of Bacteriology. - 1997. - V. 179. - № 22. - P. 71117117.
ALEXANDER D. et al. Proc. Nal. Acad.
Sci. USA, 1993. - V. 90. - P. 7327-7331.
CHERNIN L.S. et al. Applied and Environmental Microbiology. - 1997. - V. 63. № 3. - Р. 834-839.
(57)
1. Рекомбинантная плазмида pBI-chiA для экспрессии в растении хитиназы Chia_Spl с
молекулярной массой 61 кДа из бактерии Serratia plymuthica штамма IC1270, состоящая из
находящегося под контролем nos-промотора гена неомицинфосфотрансферазы II (NPTII),
обуславливающего устойчивость растения к аминогликозидным антибиотикам, полилинкера, гена бактериальной устойчивости к канамицину, бактериального участка начала репликации (ori) из плазмиды pBIN19 и последовательностей RB и LB и содержащая в
составе Т-ДНК окаймленную последовательностями 35S промотора и терминатора вируса
мозаики цветной капусты ДНК гена chiA длиной 1854 п.н., кодирующего эндохитиназу.
Фиг. 1
BY 11553 C1 2009.02.28
2. Способ получения трансгенного растения, экспрессирующего ген chiA, заключающийся в том, что кокультивируют экспланты растения с рекомбинантным штаммом
Agrobacterium tumefaciens GV3101/pBI-chiA, обеспечивающим интеграцию гена chiA в
геном растения.
Изобретение относится к области генетической инженерии, конкретно к созданию
генно-инженерной конструкции (рекомбинантной плазмиды pBI-chiA), способной экспрессировать ген chiA бактериального происхождения в растениях, а также к способу
получения трансгенных растений, экспрессирующих бактериальную хитиназу и обладающих повышенной устойчивостью к грибным фитопатогенам.
Проблема грибных инфекций особенно актуальна для культивируемых сортов вследствие их невысокого генетического разнообразия. Несмотря на отсутствие иммунной системы у растений, в ходе эволюции им удалось выработать множество защитных
механизмов, в том числе синтез низкомолекулярных соединений, протеинов и пептидов,
обладающих антигрибной активностью. Аналогично противогрибные соединения синтезируются бактериями, насекомыми, моллюсками, млекопитающими и самими грибами
для вытеснения конкурирующих видов. Противогрибные протеины задействованы в комплексе конститутивной либо индуцируемой резистентности, что позволяет растениям и
животным достаточно эффективно противодействовать грибной инфекции. Совокупность
подобных пептидов и белков принято называть PR (pathogenesis-related) - протеинами.
Классификация PR-протеинов включает 13 семейств [1], каждое из которых обладает индивидуальным набором антипатогенных свойств; хитиназы относятся к протеинам семейства PR-3. Защитный эффект хитиназ основан на их способности расщеплять хитин неветвящийся полимер β-1,4-связанных сахаров N-ацетилглюкозаминов, являющийся
одним из основных компонентов клеточной стенки грибных патогенов, что вызывает нарушение ее структуры и осмотический стресс, приводящий к гибели возбудителя. Необходимо отметить, что применение в генно-инженерных разработках генов PR-протеинов,
полученных из растений, зачастую приводит к весьма незначительному и узкоспецифичному повышению резистентности [2]. Мощной альтернативой явилось использование
компонентов бактериальных антимикробных механизмов. В частности, хитиназы бактериального происхождения, в противоположность растительным, обладают сильным и устойчивым антимикробным эффектом в отношении широкого круга патогенов - родов
Rhizoctonia, Alternaria, Fusarium, Botrytis и др. [1, 3-5]. Помимо грибных патогенов, хитин
содержат насекомые - как в составе экзоскелета, так и в периотрофной мембране; в отношении их также показан протективный эффект трансгенов хитиназы в частности против
тли Aulacorthum solani, Lacanobia oleracea, Oryzaephilis mercator и др. [3].
Известны наиболее близкие к заявленным генно-инженерные конструкции, экспрессирующие различные варианты генов, кодирующих хитиназы различного происхождения,
и способ получения трансгенных растений, включающий трансформацию генома указанными конструкциями. Однако получаемые в этом случае трансгенные растения часто демонстрируют весьма невысокий уровень устойчивости к узкому спектру патогенов [2, 5].
Изобретение решает задачу создания генно-инженерной конструкции (рекомбинантной плазмиды pBI-chiA), содержащей ген chiA из почвенной бактерии Serratia plymuthica,
кодирующий хитиназу Chia_Spl ([4], GenBank данных номер U59304), а также разработку
способа получения трансгенных растений, экспрессирующих ген бактериальной хитиназы, с повышенной устойчивостью к грибным фитопатогенам.
Поставленная задача решается за счет того, что 1) рекомбинантная плазмидная ДНК
pBI-chiA содержит в составе Т-ДНК окаймленную последовательностями 35S промотора
и терминатора вируса мозаики цветной капусты ДНК-последовательность гена chiA дли2
BY 11553 C1 2009.02.28
ной 1854 п.о., кодирующую белок-предшественник хитиназы из почвенной бактерии Serratia plymuthica молекулярной массой 61 кДа с лидерным N-концевым пептидом (3 кДа), и
состоит из: находящегося под контролем nos-промотора гена неомицинфосфотрансферазы
II (ген NPTII), обуславливающего устойчивость растений к аминогликозидным антибиотикам; полилинкера; гена бактериальной устойчивости к канамицину; бактериального
участка начала репликации (ori) из плазмиды pBIN19; последовательностей RB и LB; а
также за счет того, что 2) в способе получения трансгенных растений путем кокультивации их эксплантов с суспензией агробактериального штамма GV3101, содержащего вышеуказанную плазмиду pBI-chiA совместно с хелперной плазмидой pSoup, обеспечивается стабильное геномное встраивание и экспрессия хитиназы Chia_Spl.
Известно, что почвенная бактерия Serratia plymuthica (штамм IС 1270) обладает широким спектром антигрибной активности. Данный штамм, ранее отнесенный к виду Enterobacter agglomerans [4], но позднее реидентифицированный как Serratia plymuthica [6] на
основе данных частичного секвенирования гена 16S rRNA (GenBank номер AY551332),
продуцирует и секретирует ряд хитинолитических ферментов, включающий две N-ацетилβ-D-глюкозаминидазы и эндохитиназу Chia_Spl [4].
Для осуществления заявленного изобретения из почвенной бактерии Serratia plymuthica выделяют геномную ДНК, которую далее используют для создания ДНК-клонотеки.
При помощи ПЦР (полимеразная цепная реакция) со специфичными праймерами отбирают клоны, несущие последовательность гена chiA из штамма S. plymuthica IС 1270. Фрагмент, представляющий собой полноразмерную ДНК-последовательность гена chiA и
содержащий собственный инициирующий кодон, клонируют в векторе pDH51 под контролем 35S промотора. Из полученного промежуточного вектора с помощью эндонуклеаз
рестрикции вырезают кассету, содержащую 35S промотор, ген хитиназы Chia_Spl и терминатор. Данную кассету встраивают в вектор рВI121. Отбирают генно-инженерную конструкцию, содержащую кассету в ориентации "голова к хвосту" (pBI-chiA) по отношению
к гену NPTII под контролем nos-промотора, который присутствует в векторе рВI121 изначально. Для трансформации растений табака и картофеля методом агробактериальной
трансформации плазмиду pBI-chiA вводят в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101,
содержащий хелперную плазмиду pSoup, методом кальциевой трансфекции с последующим отбором на канамицин-содержащей среде и ПЦР-анализом клонов на наличие плазмиды pBI-chiA. Трансформацию растений табака и картофеля проводят посредством
кокультивации листовых и стеблевых эксплантов с суспензией агробактерий. Отбор
трансформантов проводят на селективных средах, содержащих канамицин. Наличие
встроенных генов определяют методами ПЦР и гибридизации по Саузерну. Степень ингибирования фитопатогенов определяют стандартными методиками.
Карта полученной таким образом генно-инженерной конструкции, плазмиды pBIchiA, содержащей ДНК-последовательность длиной 1854 п.о., включая структурную часть
гена chiA (1686 п.о.), выделенного из бактерии S. plymuthica, и использованной в дальнейшем для трансформации растений, показана на фиг. 1.
Использование плазмиды pBI-chiA, описанной в данном изобретении, позволяет достаточно простым путем вводить ген chiA из штамма Serratia plymuthica в геном растений
для создания линий и сортов растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам относительно исходной нетрансформированной формы.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1. Клонирование полноразмерной ДНК-последовательности гена chiA из почвенной бактерии Serratia plymuthica.
Геномную ДНК выделяют из штамма Serratia plymuthica с использованием насыщенного раствора NaI. Лизат центрифугируется и осадок ресуспендируется в буфере TNE
(50 мМ Tris-HCl, 50 мМ NaCl, 5 мМ EDTA-Na2), после чего добавляется 50 мг лизоцима и
1 мл 10 % лаурилсаркозина. Далее проводится экстракция фенол-хлороформом и осажде3
BY 11553 C1 2009.02.28
ние изопропанолом. Осадок промывается 70 % этанолом и растворяется в ТЕ-буфере. Для
амплификации используются следующие праймеры: 5'-TATCCTCTCGGAATAA-3' и 5'GAATTCACTCAAACAACTCT-3'. ПЦР проводится в объеме 25 мкл, реакционная смесь
содержит 1,5 мМ MgCl2, 200 мМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов (dATP, dCTP,
dGTP и dTTP), 10 pmol каждого из праймеров, 1U Taq полимеразы и 10 нг геномной ДНК
из штамма Serratia plymuthica IС 1270. Реакция проводится на термоциклере по следующей программе: 25 циклов 94 °С 1 мин, 54 °С 1 мин и 72 °С 1,5 мин, с финальной фазой
элонгации 72 °С 4 мин. ПЦР-продукт разделяется на 0,8 % агарозе в ТАЕ-буфере. Ампликон размером 2165 п.н. выделяют из геля посредством электроэлюции. Электрофоретическую зону, содержащую нужный фрагмент, вырезают из геля, помещают в диализный
мешок и подвергают электроэлюции в однократном трис-боратном буфере при напряжении 80V в течение 1 ч. Элюат экстрагируют смесью фенол-хлороформ (1:1) и очищают на
микроколонке с сефадексом G-50 в ТЕ-буфере, осаждают этиловым спиртом и проверяют
гель-электрофорезом в агарозе. Лигирование проводят при стандартных условиях: 12 ч
при +15 °С при пятикратном избытке вставки по отношению к векторному фрагменту [7].
Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е. coli JM109. Трасформацию проводят с применением СаСl2 [7]. Из устойчивых к ампициллину рекомбинантных клонов
выделяют плазмидную ДНК по методу Бирнбойма и Долли [8]. Трансформированные
клетки Е. coli JM109 выращивают в жидкой среде YT с ампициллином (100 мкг/мл), содержащей 5 г NaCl (о.с.ч.), 8 г триптона ("Difco", США), 5 г дрожжевого экстракта
("Difco", США), в течение 16 ч при 37 °С. Клетки (10 мл культуры) осаждают центрифугированием 3000 об./мин 20 мин, ресуспендируют в 200 мкл буфера следующего состава:
25 мМ трис-гидрохлорида рН 8,0, 50 мМ глюкозы, 20 мМ ЭДТА, 2 мг/мл лизоцима
("Sigma", США), затем добавляют 200 мкл раствора 0,2 N NaOH с 1 % SDS, инкубируют
до полного просветления суспензии в ледяной бане. Добавляют 150 мкл 3 М ацетата натрия рН 4,8, перемешивают и удаляют осадок центрифугированием (20 мин, 3000 об./мин).
ДНК из супернатанта осаждают двумя объемами этилового спирта, осадок растворяют в
0,3 М ацетате натрия (рН 6,0) и осаждают двумя объемами этилового спирта. Осадок, собранный центрифугированием, растворяют в ТЕ-буфере. Далее из ампликона в плазмиду
pGEM-T переклонируется участок в 1854 п.н., содержащий ORF размером 1686 п.н., которая кодирует протеин Chia_Spl молекулярной массой 60,880 Da, состоящий из 562 аминокислот. Соответствие клонированной последовательности ДНК гена chiA подтверждают
посредством секвенирования [7].
Пример 2. Создание плазмиды pBI-chiA для доставки и экспрессии гена chiA в растениях.
Для создания кассеты экспрессии гена chiA в растениях используется удобная для молекулярно-генетических манипуляций плазмида pDH51. Она является производной плазмиды pUC18 и содержит в своем составе промотор и терминатор вируса мозаики цветной
капусты [9]. Между промотором и терминатором находятся сайты узнавания некоторых
широко используемых рестриктаз (SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI). Удобным является
также и то, что экспрессирующую кассету можно вырезать из вектора с помощью сразу
нескольких рестриктаз (EcoRI, NcoI, SstI, HindIII). Вектор является многокопийным и несет ген устойчивости к ампициллину.
Полученная конструкция pDHchiA является удобной при создании векторов, предназначенных для переноса гена chiA в геном растений, т.к. в ее последовательности удобно
расположены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, что позволяет легко вырезать
кассету с геном chiA для переклонирования в других плазмидах.
Для создания вектора pDHchiA ДНК плазмиды pDH51 гидролизуют эндонуклеазой
рестриции SmaI при 30 °С в буфере, содержащем 33 мМ трис-ацетат (рН 7,9 при 37 °С),
10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина.
Затем после тепловой инактивации рестриктазы ДНК вектора дефосфорилируют инкуба4
BY 11553 C1 2009.02.28
цией с 1 единицей щелочной фосфатазы при 37 °С. Продукты реакций разделяют в 1 %
агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Фрагмент геля, содержащий
линеаризованный вектор, вырезают с помощью скальпеля, затем из него с использованием
процедуры замораживания-оттаивания выделяют ДНК. После очистки путем экстракции
смесью фенол-хлороформ ДНК вектора лигируют с Bsp120I/Ecl136II-фрагментом рекомбинантной плазмиды pGEM-T-chiA. Реакцию лигирования проводят в течении 20 ч при
16 °С с помощью ДНК лигазы фага Т4. Лигированную ДНК используют для трансформации штамма DH5α (генотип thi-1; hsdR17; gyrA96; recA1; endA1; glnV44; relA1;
phi80dlacZdelM15; phoA8; lambda-) по стандартной методике с использованием хлорида
кальция (пример 1). Трансформированные клетки отбирают на агаризованной среде LB,
содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Для проверки наличия плазмиды отдельные колонии отсевают в пробирку с 4 мл LB с ампициллином. Плазмидную ДНК выделяют, как
было описано выше. Полученные препараты анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции. Отбирают плазмиду, содержащую вставку последовательности, которая кодирует
хитиназу Chia_Spl. Проверяют правильность ориентации вставки с помощью рестрикции.
При конструировании вектора для переноса последовательности гена хитиназы
Chia_Spl в растения была использована плазмида рВI121, которая представляет собой
удобный и хорошо изученный вектор для трансформации растений, зарекомендовавший
себя при переносе трансгена в широкий спектр культур [10]. Она содержит под контролем
nos-промотора ген неомицинфосфотрансферазы II (ген NPTII), обуславливающий устойчивость растений к аминогликозидным антибиотикам; удобный для клонирования полилинкер, маркерный ген GUS, ген бактериальной устойчивости к канамицину;
бактериальный участок начала репликации (ori) из плазмиды pBIN19, что позволяет поддерживать плазмиду не только в Escherichia coli, но и в Agrobacterium tumefaciens. Ген
NPTII и полилинкер фланкированы участками RB и LB, необходимыми для встраивания
области Т-ДНК в геном растений.
Плазмиды pBI121 и pDHchiA гидролизуют энодонуклеазами рестрикции HindIII и SacI
при 37 °С в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 мМ хлорид магния, 100 мМ
хлорид калия, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. После тепловой инактивации
рестриктазы ДНК вектора рВI121 дефосфорилируют с помощью 1 единицы щелочной
фосфатазы в той же реакционной смеси. Очистку фрагментов в агарозном геле, лигирование и трансформацию проводят так же, как было описано выше. Отбор трансформантов
проводят на агаризованной среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина. После выделения плазмидной ДНК по методу щелочного лизиса ее анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции. Отбирают клоны, содержащие плазмиду со вставкой в ориентации "голова
к хвосту" (pBI-chiA) по отношению к гену NPTII под контролем nos-промотора. Схема
полученной конструкции представлена на фиг. 1.
Пример 3. Создание агробактериального штамма на базе GV3101 для трансформации
растений с использованием вектора pBI-chiA.
Модифицированные агробактериальные штаммы для трансформации растений создаются с использованием бинарной плазмидной системы, включающей в себя хелперную
плазмиду с удаленной Т-ДНК, обеспечивающую Vir-функции при трансформации, и
трансфер-вектор, несущий в составе Т-ДНК трансген в кассете экспрессии и селективный
ген в кассетах растительной экспрессии. Т-ДНК окаймлена фланкирующими последовательностями RB и LB, что обеспечивает ее перенос в клетку растения и интеграцию в геном с помощью ферментов, кодируемых хелперной плазмидой.
Агробактериальный штамм для трансформации растений геном хитиназы Chia_Spl
создается на основе широко распространенного эффективного штамма GV3101 [11] с
использованием хелперной плазмиды pSoup. Трансформация данного штамма последовательно хелперной плазмидой и трансфер-вектором проводится следующим образом.
Культуру агробактерии наращивают 20 ч в 5 мл среды YEB (1 г/л дрожжевого экстракта,
5
BY 11553 C1 2009.02.28
1 г/л триптона, 5 г/л сахарозы, 0,5 г/л MgSO4·7H2O) при 28 °С. Затем обновляют культуру в 50 мл YEB (разбавление 1:50) в течение 5-6 ч. Далее центрифугируют 5 мин при
4000 об./мин, ресуспендируют клетки в 10 мл 0,15 М NaCl и инкубируют 15 мин на льду.
Затем клетки центрифугируют 5 мин при 4000 об./мин и ресуспендируют в 1 мл 20 мМ
СаСl2. Суспензию разливают в стерильные эппендорфы по 200 мкл, добавляют 0,1-1 мкг
плазмидной ДНК, инкубируют на льду 30 мин и замораживают при -60 °С. При оттаивании добавляют 0,8 мл YEB и инкубируют 2 ч при 28 °С, после чего высевают на чашки
Петри с агаризованной YEB, содержащей селективный антибиотик (соответственно тетрациклин в концентрации 12,5 мг/л для хелперной плазмиды pSoup и канамицин в концентрации 50 мг/л для трансфер-вектора pBI-chiA, а также рифампицин в концентрации
20 мг/л для селекции агробактерий). Для подтверждения наличия плазмид в штамме из
полученных клонов выделяют плазмидную ДНК по вышеописанной методике и проводят
рестрикционный и ПЦР-анализ.
Пример 4. Создание трансгенных растений табака и картофеля, несущих и экспрессирующих ген chiA.
Для трансформации используют асептическую культуру линии табака Nicotiana tabacum cv. petit Havana SR1, а также асептическую пробирочную культуру картофеля Solanum tuberosum белорусского раннего сорта "Дельфин". Табак культивируют при
24/18 °С, 16/8-часовом фотопериоде, освещенности порядка 2000-3000 лк. Картофель
культивируют при 21/18 °С, 16/8-часовом фотопериоде, освещенности порядка 3000 лк.
Для трансформации используют листья 6-8-недельных растений, выросших в стерильных
условиях.
Трансформацию проводят следующим образом. Высевают агробактерию со свежей
чашки или культуры в 20 мл LB с антибиотиками на 1-2 сут. Готовят жидкую среду CIM,
т.е. MS, содержащую MS-витамины и 30 г/л сахарозы, рН = 5,6, после автоклавирования
добавляют ВАР в концентрации 0,2 мг/л и НУК в концентрации 1 мг/л для табака либо
зеатин в концентрации 0,5 мг/л, ИУК в концентрации 3 мг/л для картофеля. Агробактерии
центрифугируют 15 мин при 4000 об./мин, ресуспендируют в 20 мл CIM. Ресуспендированные агробактерии разводят в 20 раз средой CIM. В ламинаре стерильно нарезают листья пробирочной культуры, в чашки доливают 10 мл суспензии агробактерии и на 2-3 сут.
помещают в темноту на 22 °С. Готовят агаризованную среду a-CIM (MS, содержащую
MS-витамины и 30 г/л сахарозы, рН = 5,6, 8 г/л агара), после автоклавирования добавляют
ВАР 0,2 мг/л и НУК 1 мг/л для табака либо зеатин 0,5 мг/л, ИУК 3 мг/л для картофеля,
селективный агент канамицин в концентрации 50 мг/л, тиментин в концентрации 200 мг/л
для элиминации агробактерии. Экспланты пересаживают на среду а-CIM через 2-3 сут.,
предварительно обсушив каждый эксплант на фильтровальной бумаге. Через 2 недели
проводят пересадку на среду SIM (MS, содержащую MS-витамины и 30 г/л сахарозы,
рН = 5,6, 8 г/л агара, после автоклавирования добавляют ВАР в концентрации 1 мг/л и
НУК в концентрации 0,1 мг/л для табака либо зеатин в концентрации 2 мг/л и GA3 в концентрации 5 мг/л для картофеля, канамицин в концентрации 50 мг/л, тиментин в концентрации 200 мг/л). Появляющиеся регенераты срезают и пересаживают на среду для
укоренения RIM (MS, содержащую MS-витамины и 30 г/л сахарозы, рН = 5,6, 8 г/л агара,
после автоклавирования добавляют ИУК в концентрации 0,05 мг/л, канамицин в концентрации 50-100 мг/л, тиментин в концентрации 200 мг/л). Регенеранты в дальнейшем анализируются на наличие в геноме трансгена хитиназы и его экспрессию.
Наличие у регенеранта гена хитиназы Chia_Spl подтверждают посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделение ДНК из растений, укоренившихся на селективной среде, проводят следующим образом. Растительные ткани, замороженные или свежие,
растирают в ступке с жидким азотом. Гомогенат заливают буфером S (100 mM tris HCl рН
8,5, 100 mM NaCl, 50 mM EDTA рН 8,0, 2 % SDS) в соотношении 1:2. После размора6
BY 11553 C1 2009.02.28
живания добавляют протеиназу К (10 мг/мл) прямо в ступку - 50-100 мкг на 1 мл смеси,
инкубируют при 65 °С 1,5-2 ч. После этого добавляют равный объем смеси фенолхлороформ (1:1), перемешивают и центрифугируют при 4500 об./мин в течение 20-30 мин.
Снимают верхнюю фазу и переносят в новую пробирку, добавляют равный объем хлороформа, встряхивают, центрифугируют 20-30 мин при 4500 об./мин. Верхний слой переносят в маленькие стаканчики на 50 мл, добавляют изопропанол в соотношении 0,6-0,9
объема образца. С помощью палочки накручивают ДНК до полного ее извлечения. Палочки с намотанной на них ДНК промывают 75 % спиртом и сушат около 40 мин. Высушенную ДНК растворяют в 300 мкл стерильного ТЕ-буфера (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, рН
8,0). После растворения ДНК обрабатывают РНКазой в течение 45-60 мин при 37 °С. Затем проводят стандартную очистку фенол-хлороформом. ДНК осаждают этанолом, промывают 80 % этанолом. После того как ДНК будет высушена, ее растворяют в ТЕ-буфере.
Концентрацию ДНК определяют с помощью агарозного мини-гель электрофореза и с помощью спектрометрии.
Для амплификации используются следующие праймеры: 5'-TCGATCAACAGGCAACCGCT-3'
и 5'-AAGTCTTCGCGGCCCTGACA-3'. ПЦР проводится в объеме 25 мкл, реакционная
смесь содержит 1,5 мМ MgCl2, 200 мМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов (dATP,
dCTP, dGTP и dTTP), 10 pmol каждого из праймеров, 1U Taq полимеразы и 100 нг геномной растительной ДНК либо плазмидной ДНК pBI-chiA в качестве положительного контроля. Реакция проводится на термоциклере по следующей программе: 4 мин при 95 °С,
30 циклов 94 °С 30 с, 57 °С 30 с и 72 °С 1 мин, с финальной фазой элонгации 72 °С 4 мин.
ПЦР-продукт разделяется на 0,8 % агарозе в ТАЕ-буфере, результат фиксируется фотографированием в ультрафиолете с помощью цифровой системы гель-документирования.
Экспрессию хитиназы Chia_Spl подтверждают посредством RT-PCR (полимеразной
цепной реакции с обратной транскрипцией). Выделение РНК из растений проводят гуанидинтиоцианатным методом [12]. 20 г растительной ткани замораживают в жидком азоте и
растирают до порошкообразного состояния, проводят экстракцию 40 мл лизирующего
буфера следующего состава: 50 мМ трис-гидрохлорид, рН 7,6, 25 мМ ЭДТА (этилендиаминотетрауксусная кислота), 0,07 мМ 2-меркаптоэтанол, 2 % N-лаурилсаркозил. Полученный лизат трижды экстрагируют смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт
(200:200:4) до исчезновения интерфазы. Фазы разделяют центрифугированием 5 мин при
5000 об./мин. Из водной фазы РНК осаждают 3 М ацетатом натрия (рН 6,05) в течение 16 ч
в ледяной бане. Полученный осадок собирают центрифугированием, растворяют в ТЕбуфере (0,05 мМ трис-гидрохлорид, рН 7,5, 0,01 мМ ЭДТА) и осаждают этанолом в присутствии 0,3 М хлористого натрия.
Качество полученного препарата РНК исследуют методом гель-электрофореза в агарозном геле в присутствии формальдегида. Пробы растворяют в 20 мкл денатурирующего
буфера следующего состава: 3 мкл 36 % формальдегида, 7 мкл формамида концентрированного и 8 мкл буфера для электрофореза (фосфоацетатный буфер). РНК прогревают в
течение 5 мин при 65 °С и вносят в лунки 0,8 % агарозного геля, приготовленного на электродном буфере, содержащем 1,1 М формальдегида. Гель окрашивают бромистым этидием (0,5 мкг/мл) и фотографируют в ультрафиолете с помощью цифровой системы гельдокументирования.
На выделенной РНК синтезируют одноцепочечную кДНК, которую далее анализируют посредством описанной выше процедуры ПЦР с праймерами к хитиназе на наличие
транскрипта бактериальной хитиназы, свидетельствующего о считывании трансгена с
геномной вставки. Образцы, показавшие экспрессию хитиназы Chia_Spl, анализируют на
хитинолитическую активность фермента и ингибирование роста фитопатогенов.
Пример 5. Анализ хитинолитической активности фермента хитиназы Chia_Spl, экспрессирующегося в трансгенных растениях.
7
BY 11553 C1 2009.02.28
Выделение белка из растений табака и картофеля проводилось следующим образом
[13]. Образец листьев (0,5-1 г) замораживали в жидком азоте, растирали в ступке, переносили в пробирку типа эппендорф и добавляли натрий-цитратный буфер (0,1 М, рH = 5,0)
из расчета 1 мл на 1 грамм листьев. Далее препарат размешивали на вортексе и осаждали
дебрис центрифугированием 10 мин при ускорении 12000 g.
Для тестирования активности хитиназы субстрат [pNP-(GlcNAc)]2 (р-нитрофенил-βD-N,N'-диацетилхитобиозу) растворяют в концентрации 300 мкг/мл в 0,05М калийфосфатном буфере (рН = 6,0), содержащем 0,02 % (w/v) NaN3 [14]. 100 мкл субстрата помещают в эппендорфе на лед, добавляют 10 мкл раствора хитиназы и инкубируют на водяной бане 50 °С 5-30 мин, отбирая очередную аликвоту для спектрофотометрии каждые
5 мин. Реакцию останавливают добавлением 5 мкл 1М NaOH, что также способствует
проявлению цвета р-нитрофенола, образующегося при расщеплении хитиназой субстрата.
Поглощение измеряется спектрофотометрически при 410 нм, выстраивается кривая с
5-минутным интервалом для трансгенных и контрольного (исходного) генотипов (фиг. 2).
Пример 6. Изучение ингибирования роста и развития фитопатогенов in vitro и in vivo
трансгенными растениями, несущими ген хитиназы Chia_Spl.
Анализ ингибирования роста и развития фитопатогенов in vitro проводится следующим образом [15]. В чашки Петри диаметром 40 мм заливается агаризованная среда (Agar
Tryptose). Споры патогена (Fusarium oxysporum, Alternaria solani, Botrytis cinerea) отбираются с чашки Петри, содержащей свежую культуру, в эппендорф с водой mQ, тщательно
ресуспендируются. В центр чашки высевается 3 мкл суспензии спор. Через 2 сут. после
высева колонии растения картофеля либо табака (трансгенные и контроль, возраст 1-1,5
месяца) гомогенизируются в ступке пестиком, экстракт отбирается в пробирки эппендорф.
Экстракт центрифугируется 5 мин при 4000-5000 об./мин в настольной центрифуге. Диски
фильтровальной бумаги (4-5 мм) пропитываются экстрактом растений и выкладываются
вокруг растущей колонии на расстоянии ~2 мм (6 дисков на чашку). Оценка латерального
ингибирования роста колоний патогенов и фотографирование проводятся с интервалом
в 1 сутки. На основании анализа зон роста патогенов выстраиваются суточные динамические кривые и рассчитывается ингибирующий эффект по отношению к контролю. На
основании обсчета зон роста определяются параметры прироста патогена в процентах
относительно первоначального размера колонии с целью внутреннего нормирования данных. Трансгенные растения, содержащие ген хитиназы Chia_Spl, характеризуются существенным (для ряда образцов более чем двукратным) ингибированием роста фитопатогенов in vitro, что иллюстрируется фиг. 3.
При тестировании устойчивости трансгенных растений картофеля in vivo к сельскохозяйственно важному патогену Alternaria solani у тепличных растений картофеля (трансгенных и контрольных) отбираются верхние трилистники длиной 6-7 см из среднего яруса
в повторностях не менее трех. Трилистники помещаются на увлажненную фильтровальную бумагу в закрытую камеру; на каждую из боковых долей и на обе половины главной
доли наносится капля (100 мкл) тщательно размешанной суспензии свежей культуры Alternaria solani, инкубация проводится при комнатной температуре с периодическим наблюдением. Итоговое фотографирование и учет результатов проводятся через 10 дней.
Трансгенные растения согласно классификации, принятой в селекционных испытаниях,
показали уровень "относительно высокой устойчивости" (поражение до 25 % листовой
доли), тогда как контрольные растения показали "низкую устойчивость" (поражение до
75 % листовой доли). Пример приведен на фиг. 4. Образцы трансгенного картофеля были
исследованы на устойчивость к альтернариозу методами, применяемыми в селекционном
процессе на базе БелНИИ картофелеводства, г. Самохваловичи. При заражении комплексом патогенов Alternaria solani и Alternaria alternata среди трансгенных образцов, несущих
ген хитиназы chiA, также выделены линии, показавшие "относительно высокую устойчивость", тогда как данные по исходному сорту "Дельфин" не превышали показателя "средняя устойчивость".
8
BY 11553 C1 2009.02.28
Источники информации:
1. Selitrennikoff C.P. // Appl. and Env. Microbiol. 2001. V. 67. Р. 2883-2894.
2. Alexander D. et al // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. V. 90. P. 7327-7331.
3. Lorito M. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1998. V. 95. P. 7860-7865.
4. Chernin L.S. et al. // Appl. and Env. Microbiol. 1997. V. 63. P. 834-839.
5. Honee G. // European Jornal of Plant Pathology. 1999. V. 105. P. 319-326.
6. Ovadis, M., Liu, X., Gavriel, S., Ismailov, Z., Chet, I. and Chernin, L. // J. Bacteriol.
2004. V. 186. P. 4986-4993.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984.
8. Birnboim H.C., Doly J. // Nucleic Acids Res. 1979. V. 24. P. 1513-1523.
9. Pietrzak M., Shillito R.D., Hohn Т., Potrykus I. // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P.
5857-5868.
10. Po-Yen Chen, Chen-Kuen Wang, Shaw-Ching Soong and Kin-Ying To // Molecular
Breeding 2003. V. 11 P. 287-293.
11. Koncz, C., J. Schell //. Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204 P. 383-396.
12. Chirgvin J., Przbla A., Mac Donald R., Rutter W. // Biochemistry. 1979. V. 18. P. 52945298.
13. T.Boller. // Planta. 1983. V. 157 P. 22-31.
14. Roberts, W.K., and C.P. Selitrennikoff // J.Gen.Microbiol. 1988. V. 134 P. 169-176.
15. Мее-Len Chye, Kai-Jun Zhao, Zhu-Mei He, Sathishkumar Ramalingam, King-Leung
Fung // Planta. 2005. V. 220 P. 717-730.
Фиг. 2
9
BY 11553 C1 2009.02.28
Фиг. 3
Фиг. 4
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
10
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
4
Размер файла
968 Кб
Теги
by11553, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа