close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11618

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.02.28
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11618
(13) C1
(19)
C 12N 15/33
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ
АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА С
(21) Номер заявки: a 20060655
(22) 2006.06.30
(43) 2008.02.28
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения
Республики Беларусь (BY)
(72) Авторы: Владыко Александр Станиславович; Фомина Елена Георгиевна;
Счесленок Елена Павловна; Школина Татьяна Владимировна; Семижон
Павел Анатольевич (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Научно-исследовательский
институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения
Республики Беларусь (BY)
(56) ПЕТРАКОВА Н.В. и др. // Вопросы
вирусологии. - 1997. - Т. 42. - № 5. С. 208-212.
RU 2052503 С1, 1996.
RU 2073718 C1, 1997.
BY 11618 C1 2009.02.28
(57)
Рекомбинантная плазмидная ДНК для получения антигена вируса гепатита С, содержащая не менее чем две копии аминокислотной последовательности KPQRKTKRNTNRRPQD,
кодирующей антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка вируса гепатита С, клонированные в полилинкер экспрессирующего вектора pJC4O по Hind III и Ара I сайтам
рестрикции.
Настоящее изобретение относится к технологии получения рекомбинантной ДНК и
может быть использовано для экспрессии полипептида, содержащего повторы антигенных
детерминант с целью усовершенствования имеющихся диагностических тест-систем. Более конкретно, настоящее изобретение относится к рекомбинантной плазмиде pJC40, которая в качестве вставки содержит тандемно повторяющуюся (не менее 2-х повторов)
нуклеотидную последовательность, кодирующую только антигензначимые участки нуклеокапсидного белка (core) вируса гепатита С (ВГС). Сконструированным вектором трансформируют бактериальные клетки, в частности клетки Escherichia coli, штамм BL21, для
обеспечения экспрессии рекомбинантного полипептида. Выбор нуклеокапсидного белка
для диагностики обусловлен тем, что использование структурных белков вириона целесообразно для ранней диагностики инфекции, так как показано, что антитела к белку Core
являются самыми ранними маркерами инфекции ВГС.
В настоящее время известно достаточно много рекомбинантных плазмидных ДНК, которые кодируют как полноразмерный нуклеокапсидный белок вируса гепатита С, так и
отдельные антигенные детерминанты: pTSC 6178-7, pCL471 кодируют полноразмерный
нуклеокапсидный белок, pFC 105-302 кодирует первые 150 аминокислотных остатков
(а.о), и ряд плазмид, которые содержат отдельные последовательности из состава HCcAg в
виде гибрида с β-галактозидазой: PEXHCI (содержит 19-31 а.о. HCcAg); pEXHCII (содер-
BY 11618 C1 2009.02.28
жит 1-25 а.о. HCcAg); pEXHCIII (содержит 1-80 а.о. HCcAg); pEXHCIV (содержит 1-160
а.о. HCcAg); pEXHCV (содержит 55-72 а.о. HCcAg); pEXHCVI (содержит 33-56 а.о.
HCcAg); pEXHCVII (содержит 58-84 а.о. HCcAg); полученные в институте им. Д.И. Ивановского РАМН [Петракова Н.В., Калинина Т.И., Худяков Ю.Е., Газина Е.В., Смирнов В.Д.
Получение и очистка рекомбинантного полипептида, содержащего антигенные детерминанты сердцевинного белка вируса гепатита С // Вопросы вирусологии. - 1997. - № 5. С. 208-212; Масалова О.В., Атанадзе С.Н., Калинина Т.И., Петракова Н.В., Смирнов В.Д.,
Fields H., Худяков Ю.Е., Кущ А.А. Иммунохимические свойства и специфичность моноклональных антител в отношении N- и С-концевых участков рекомбинантного белка нуклеокапсида вируса гепатита С // Вопросы вирусологии. - 1996. - № 2. - С. 150-153].
Наиболее близким по сущности и достигаемому результату к заявленной рекомбинантной плазмидной ДНК является плазмида pFC 105-302, которая кодирует первые 150
аминокислотных остатков сердцевинного белка (прототип) [Петракова Н.В., Калинина Т.И.,
Худяков Ю.Е., Газина Е.В., Смирнов В.Д. Получение и очистка рекомбинантного полипептида, содержащего антигенные детерминанты сердцевинного белка вируса гепатита С
// Вопросы вирусологии. - 1997. - № 5. - С. 208-212]. Недостатками известной плазмиды
является то, что данная плазмида наряду с антигензначимыми участками белка "core" содержит последовательности, которые не имеют антигенной значимости и могут неспецифически связываться с антителами, содержит неповторяющийся (один) антигензначимый
участок.
В основу заявленного изобретения положена задача получения рекомбинатной плазмиды в которой: а) в качестве вставки содержатся только антигензначимые участки нуклеокапсидного белка вируса гепатита С; б) антигенные детерминанты повторяются в
составе вектора не менее двух раз (способ мультипликации). Получаемые на основе рекомбинатной плазмиды полипептиды могут быть использованы в качестве высокочувствительного и специфичного антигена в иммуноферментной реакции для диагностики
вируса гепатита С.
Технический результат выражается в повышении чувствительности иммуноферментной
реакции за счет увеличения количества образующихся комплексов антиген-антитело и специфичности за счет элиминации последовательностей, не имеющих антигенной значимости.
Технический результат достигается тем, что рекомбинантная плазмидная ДНК для получения антигена вируса гепатита С, содержащая не менее чем 2 копии аминокислотной
последовательности KPQRKTKRNTNRRPQD, кодирующей антигенную детерминанту
нуклеокапсидного белка вируса гепатита С, клонированные в полилинкер экспрессирующего вектора pJC4O по Hind III и Apa I сайтам рестрикции.
Изобретение проиллюстрировано графическими материалами, на которых представлены: фиг. 1 - профиль гидрофобности аминокислотных остатков нуклеокапсидного белка
вируса гепатита С; фиг. 2 - данные сканирования базы данных вирусов животных и растений на наличие антигенных детерминант, идентичных нуклеокапсидному белку вируса
гепатита С; фиг. 3 - нуклеотидная последовательность праймеров, используемых для клонирования; фиг. 4 - циркулярная карта экспрессирующего вектора pJC40 и его нуклеотидная
последовательность с позиции 1 - 280; фиг. 5 - рестрикционный анализ рекомбинантных
плазмид (дорожки: 1 - маркер молекулярных масс DNA Ladder 50 bp; 2 - рекомбинантная
плазмида pJC40HCV1M, гидролизованная ферментами рестрикции Hind III, EcoR I; 3 - рекомбинантная плазмида pJC40HCV2M, после гидролиза Hind III и Xho I рестриктазами;
4 - рекомбинантная плазмида pJC40HCV4M, гидролизованная Hind III и Apa I ферментами
рестрикции); и следующие примеры приведенные ниже.
Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию проводили по известным методикам [Маниатис Т. и др. Методы генетической
инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 480; Клонирование ДНК. Методы / Под редакцией Д. Гловера, перевод с англ. - М.: Мир, 1988; Mullis K.B. // Science. 1988. - V. 239, 4839. - P. 487-491].
2
BY 11618 C1 2009.02.28
Поставленная в заявленном изобретении задача, с достижением упомянутого выше
технического результата, решалась следующим образом:
Определение антигензначимых участков
1. С помощью компьютерной wxGenebee программы были проанализированы профили гидрофобности аминокислот белка Core (фиг. 1). Белок Core содержит три гидрофильных участка (выделенные цветом аминокислотные остатки), которые экспонированы на
поверхности молекулы и вероятно являются участками связывания антител. Эти участки
сосредоточены в первых 120 аминокислотных остатках нуклеокапсидного белка.
2. Просканирована существующая в настоящее время база данных вирусов животных
и растений (GeneBank) для определения возможных перекрестов, выделенных по профилю
гидрофобности и гидрофильности антиген значимых участков (фиг. 2). Как показали данные поиска, только первый сайт является видоспецифичным, состоит из 16-ти аминокислотных остатков и кодирует следующие аминокислоты: KPQRKTKRNTNRRPQD. Второй
антиген значимый участок может давать перекресты в иммуноферментных реакциях с
Adenovirus type 41, Epstein-Barr virus, Herpesviras, Human papilloma virus и др, третий HIV type I, Herpes simplex virus type I, Human cytomegalovirus и др. Для системы тандемно
повторяющихся антигенных детерминант нами был выбран первый из трех сайтов, т.к. он
не дает перекрестов с другими вирусами.
Получение рекомбинантной плазмиды, кодирующей повторы антигенных детерминант нуклеокапсидного белка вируса гепатита С.
1. Синтезированы шесть пар праймеров для реакции полимеризации, каждый из которых
содержит 68 нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный сайт (16 а.о.), и
сайты для ферментов рестрикции (фиг. 3). В качестве обратного праймера выступала нуклеотидная последовательность, состоящая из 15 нуклеотидов. Каждая последующая пара
праймеров отличается от предыдущей только сайтами рестрикции, необходимыми для
клонирования в полилинкер (Hind III, EcoR I - первая пара праймеров; EcoR I, Xho I - вторая пара праймеров; Xho I, Pst I - третья пара праймеров; Pst I, Apa I - четвертая пара
праймеров). Праймеры были полимеризованы в реакции с фрагментом Кленова, обработаны ферментами рестрикции и клонированы последовательно в полилинкер экспрессирующего вектора. В качестве экспрессирующего вектора использовалась плазмида pJC40
(фиг. 4). Основными особенностями этого вектора являются: большое количество сайтов,
удобных для клонирования; стоп-кадон расположен близко к MCS (multiple-cloning site),
что предотвращает добавление аминокислот к С-концу продукта; маленький размер (2402
п. н.), что удобно для различных манипуляций с плазмидной ДНК; сильный ориджин репликации. Плазмида устойчива в штаммах E.coli DH5α, XL-Blue (Stratagene) и BL21 (DE3)
[Joachim Clos and Sven Brandau. pjC20 and pjC40 - Two High-Copy-Number Vectors for T7
RNA Polymerase-Dependent Expression of Recombinant Genes in Escherichia coli // Protein
expression and purification. - 1994. - № 5. - P. 133-137.]. В клетках Escherichia coli этот вектор
позволяет получать до 10 % рекомбинантного белка от тотального клеточного синтеза при
индукции изопропил-β-D-тиопираногалактозидом (IPTG). В дополнение, эта экспрессирующая система содержит последовательность из 10 остатков гистидина, что позволяет
очистить рекомбинантный белок с помощью металлхеллатной хроматографии, а также
полилинкер, содержащий сайты, удобные для клонирования.
Таким образом, получена рекомбинантная плазмида, которая в качестве вставки, содержит последовательность из четырех повторяющихся антигенных детерминант, на основе экспрессирующего вектора pJC40.
Пример 1. Получение плазмиды pJC40HCVcore1M (содержащей вставку одной антигенной детерминанты).
Реакция полимеризации.
В пробирку помещали первую пару праймеров 1НЕ hcv и 1R hcv (200 нг каждого),
нуклеотидная последовательность праймеров представлена на фиг. 3.
3
BY 11618 C1 2009.02.28
Отжиг праймеров проводили в течение 15 мин при 50 °С, затем в реакцию добавляли
dNTP mix в конечной концентрации 200 мкМ, буфер для фермента Кленова x1, фермент
Кленова 0,5 U, данную смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Полученный фрагмент анализировали в 2 % агарозном геле.
Рестрикция вектора и полимеризованных фрагментов.
Рестрикцию вектора и полимеризованных фрагментов ДНК проводили при 37 °С в течение 2 часов последовательно рестриктазами Hind III и BamH I, входящими в состав полилинкера экспрессирующего вектора, в конечном объеме 20 мкл. Реакционная смесь
содержала 0,2 мкг двухцепочечной полимеризованной ДНК, x1 буфер для рестриктаз, 1 U
каждого фермента рестрикции. Ферменты рестрикции инактивировали в течение 15 мин
при 65 °С.
Лигирование.
Лигирование рестрикционных фрагментов в вектор проводили в течение 18 часов при
4 °С, в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0,2 мкг ДНК, 1 U ДНК лигазы, x1 лигазный буфер. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli
штамм DH5α [Woodcock, D.M., et al., Nucleic Acids Res., 17, 3469-3478, 1989] и высевали
на чашки Петри с ампициллином (50 мкг/мл).
Подготовка компетентной культуры.
Отдельную колонию штамма DH5α вносили бактериологической петлей в 5 мл LB
бульона, помещали на шейкер в термостат и инкубировали в течение 2-3 часов до достижения культурой логарифмической фазы роста. Полученную культуру охлаждали до 4 °С
и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспензировали в 0,5 мл
охлажденного 0,1 М раствора CaCl2, оставляли на 2 часа при + 4 °С. Бактерии осаждали 10
мин при 3000 об/мин, осадок ресуспензировали в 0,1 мл охлажденного раствора CaCl2.
Трансформация компетентной культуры плазмидной ДНК.
В 100 мкл компетентной бактериальной культуры вносили 20 мкл лигазной смеси, выдерживали 30 мин при 4 °С, делали тепловой шок 30 сек при 42 °С, затем помещали на лед
на 3 мин, осаждали и высевали на чашки Петри с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл,
ставили в термостат на 37 °С на ночь. Клоны, полученные после трансформации, рассевали штрихом и выделяли из них плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Отбор корректной плазмиды производили по размеру и в дальнейшем анализировали с помощью
рестрикционного картирования (фиг. 5). Каждый последующий этап клонирования был
аналогичен описанному ранее за исключением используемой пары праймеров. На втором
этапе клонирования использовалась пара праймеров 2EXhcv, 2Rhcv; на третьем - 3XPhcv,
3Rhcv, на четвертом - 4PAhcv, 4Rhcv.
Фиг. 1
4
BY 11618 C1 2009.02.28
Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая фрагменты
нуклеокапсидного белка вируса гепатита C
5
BY 11618 C1 2009.02.28
6
BY 11618 C1 2009.02.28
Гепатит C, второй сайт (из трех)
7
BY 11618 C1 2009.02.28
8
BY 11618 C1 2009.02.28
Гепатит C, третий сайт (из трех)
9
BY 11618 C1 2009.02.28
10
BY 11618 C1 2009.02.28
Фиг. 2
Фиг. 3
11
BY 11618 C1 2009.02.28
Фиг. 4
Фиг. 5
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
12
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
7 915 Кб
Теги
by11618, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа