close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11832

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 11832
(13) C1
(19)
(46) 2009.04.30
(12)
(51) МПК (2006)
C 07J 41/00
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
КОНЪЮГАТ 28-ГОМОКАСТАСТЕРОНА С БЫЧЬИМ
СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОГЕНА
(21) Номер заявки: a 20080249
(22) 2008.03.05
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Хрипач Владимир Александрович; Литвиновская Раиса
Павловна; Райман Михаил Эдуардович; Драч Светлана Васильевна;
Жабинский Владимир Николаевич;
Свиридов Олег Васильевич; Прядко
Андрей Георгиевич; Новик Татьяна
Валентиновна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) YOKOTA T. et al. J. Plant Growth Regul. 1990. - V. 9. - P. 151-159.
SCHLAGNHAUFER C.D. et al. Supplement to: Plant Physiology. - 1988. V. 86. - № 4. - P. 113.
BY 9770 C1, 2007.
ХРИПАЧ В.А. и др. Биоорганическая
химия. - 2007. - Т. 33. - № 3. - С. 371378.
Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высшая школа, 1991. С. 176-183.
(57)
Конъюгат 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы
BY 11832 C1 2009.04.30
OH
HO
HO
,
HO
NOCH2CONH-БСА
где БСА - бычий сывороточный альбумин,
в качестве иммуногена.
Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы I,
BY 11832 C1 2009.04.30
OH
OH
HO
,
HO
NOCH2CONH-БСА
где БСА - бычий сывороточный альбумин,
который может быть использован в качестве белка-носителя для получения антител, специфичных к 28-гомобрассиностероидам.
Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1, 2]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в
растениях менее 10-5 %. В очень малых концентрациях они проявляют свое биологическое
действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных
культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и
адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [3-8]. Эти свойства
брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов.
Одним из наиболее активных брассиностероидов является 28-гомобрассинолид, на основе которого разработан препарат ЭПИН-плюс [9]. В связи с этим актуальной является
разработка методов анализа 28-гомобрассинолида, а также его химического и биохимического предшественника 28-гомокастастерона (далее 28-гомобрассиностероиды). В качестве такого метода нами предложен метод иммуноферментного определения 28гомобрассиностероидов, который, прежде всего, требует наличия соответствующего иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для
получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации
в виде конъюгатов с белками, которые (конъюгаты), в свою очередь, могут быть получены
через соответствующие гаптены.
Известен конъюгат брассинолида с БСА формулы (II):
OH
OH
HO
,
O
(II)
O
O
O
O
БСА
в котором связь брассиностероида с белком осуществляется через 3-гидроксигруппу [10].
К недостаткам данного конъюгата следует отнести, прежде всего связывание (маскировку)
3-гидроксигруппы, которая относится к группам, ответственным за биологическую активность брассиностероидов, что может сказаться отрицательно на специфичности вырабатываемых животными антител. Кроме того, наличие в молекуле лабильной
сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает
этот конъюгат нестабильным [11].
2
BY 11832 C1 2009.04.30
Наиболее близкими к заявляемому является конъюгаты с БСА кастастерона формулы
(III) и 24-эпикастастерона формулы (IV):
OH
OH
HO
HO
HO
HO
,
.
HO
HO
NOCH2CONH-БСА
NOCH2CONH-БСА
III
IV
Гаптен (III) предложен авторами для радиоиммуноанализа брассиностероидов [12].
Конъюгат получен на основе 24S-метилбрассиностероида - кастастерона, однако он не позволил получить антитела, специфичные даже к этой группе брассиностероидов - показатели перекрестных реакций с изученными авторами брассиностероидами составляли от
20 % до 50 %.
На основе гаптена (IV) синтезирован конъюгат с БСА, который был использован авторами [13, 14] для получения антител, специфичных к 24R-метилбрассиностероидам.
Целью изобретения является конъюгат 28-гомокастастерона и бычьего сывороточного
альбумина, позволяющий получить высокоспецифичные антитела к 28-гомобрассиностероидам.
Поставленная цель достигается заявляемым соединением (I), которое получают взаимодействием N-оксисукцинимидного эфира {[(22R,23R,24S)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси24-этил-5α-холест-6-илиденамино]окси}уксусной кислоты (гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в водно-диоксановом растворе, очисткой образовавшегося конъюгата
путем диализа и лиофилизацией конъюгата.
Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Растворяют 0,031 г (0,056 ммоль) оксима (1) и 0,008 г (0,07 ммоль) N-оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана. Охлаждают до 5 °С и при перемешивании добавляют раствор 0,012 мг дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного диоксана.
Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 °С и 20 ч при комнатной температуре.
Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Осадок растворяют в этилацетате, дополнительно образовавшийся осадок дициклогексилкарбомочевины отфильтровывают, фильтрат упаривают. Получают 0,035 мг (94 %)
6-оксисукцинимидного эфира {[(22R,23R,24S)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-этил-5αхолест-6-илиденамино]окси}уксусной кислоты. Маслообразное вещество. ИК спектр
(пленка), (см-1): 1730 (С = О), 1770 (С = О), 3400 (ОН). Спектр ЯМР 1Н δ, м.д. (CD3OD):
0,67 с (3Н, 18-Ме), 0,75 с (3Н, 19-Ме), 0,90 д (3Н, J 6,6 Гц, 26 Me), 0,94 д (3Н, J 6,7 Гц, 29Ме), 0,95 д (3Н, J 6 Гц, 21-Me), 0,97 д (3Н, J6,6 Гц, 27-Ме), 2,68 дд (1Н, J1 2,5 Гц, J2
12,5 Гц, С5- Нα), 2,73 м (4Н), 3,58 д (1Н, J 8,4 Гц, С22- Н), 3,72 м (2Н, С2- и С23- Н), 3,95 м
(1Н, С3-Нβ), 4,52 м (2Н, -О-СН2-СООН).
К раствору 52 мг (0,75 мкмоль) БСА в смеси 9 мл воды и 1 мл насыщенного раствора
NaHCO3 (pH = 8,3) добавляют раствор 35 мг (55 мкмоль) 6-оксисукцинимидного эфира
{[(22R,23R,24S)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-этил-5α-холест-6-илиденамино]окси}уксусной кислоты в 10 мл диоксана. Раствор перемешивают 20 ч при комнатной температуре.
Реакционную смесь подвергают диализу при 20 °С против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем 20 ч - против 1 %-ной суспензии активированного угля в воде, лиофилизуют и замораживают при температуре -20 °С. Содержание гаптена в конъюгате,
определенное спектрофотометрически, составляет 23 моль гаптена на 1 моль белка.
3
BY 11832 C1 2009.04.30
Полученный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 28гомобрассиностероидам (28-гомобрассинолид и 28-гомокастастерон), что подтверждается
примером конкретного выполнения.
Пример 2.
Группу из шести кроликов иммунизируют конъюгатом 28-гомокастастерон-БСА с
плотностью посадки 23 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят
подкожно в 15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл
фосфатно-буферного 0,1М раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляют 2 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор
проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие связывающей способности в отношении кастастерона и определяют их титры и значения констант ассоциации (Ка). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки,
обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании
конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ.
Таблица 1
Характеристики антисыворотки, полученной при иммунизации животных
конъюгатом 28-гомокастастерона с БСА.
Антисыворотка
Титр
Ка×109М-1
A1
4,5
50000
Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало,
что ее разбавление в 50 000 (A1) раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения как 28-гомокастастерона, так и 28-гомобрассинолида, проявивших, как и ожидалось,
сравнимые параметры связывания с антителами.
Специфичность. Перекрестная реакция антител, полученных к 28-гомокастастерону, с
другими брассиностероидами и стероидами различных классов приведена в табл. 2.
Таблица 2
Кросс-реактивность антисыворотки A1 с различными стероидами
Кросс-реактивность антисыворотки к 28-гомокастастерону со стероидами
различного строения
Связывание по
№
отношению к 28Структурная формула
Название
п/п
гомокастастерону,
%
OH
1
HO
HO
HO
28-гомобрассинолид
100
6-дезоксо-28-гомокастастерон
5,7
O
O
OH
2
HO
HO
HO
4
BY 11832 C1 2009.04.30
№
п/п
Структурная формула
Название
Продолжение таблицы 2
Связывание по
отношению к 28гомокастастерону,
%
OH
HO
3
(22R,23R)-22,23-дигидроксистигмаст-2-ен-6-он
11
(22R,23R)-22,23-дигидрокси3α,5-циклостигмаст-6-он
4
O
OH
HO
4
O
O
5
Br
(22R,23R)-3β-бром-22,23эпоксистигмаст-6-он
<0,01
(22R,23R)-22,23эпоксистигмаст-2-ен-6-он
<0,01
кастастерон
13,8
брассинолид
9
O
O
6
O
OH
7
HO
HO
HO
O
OH
HO
HO
8
HO
O
O
OH
9
HO
HO
6-дезоксокастастерон
HO
5
2,2
BY 11832 C1 2009.04.30
№
п/п
Структурная формула
Название
Продолжение таблицы 2
Связывание по
отношению к 28гомокастастерону,
%
OH
HO
10
24-эпикастастерон
HO
2,5
HO
O
OH
11
HO
HO
24-эпибрассинолид
HO
O
O
OH
12
6-дезоксобрассинолид
HO
HO
0,27
HO
OH
HO
13
(22S,23S)-28-гомокастастерон
HO
1
HO
O
OH
HO
14
(22S,23S)-22,23-дигидрокси3α,5-циклостигмаст-6-он
<0,01
(22S,23S)-24-эпибрассинолид
0,6
(22S,23S)-24-эпикастастерон
0,15
O
OH
HO
15
HO
HO
O
O
OH
16
HO
HO
HO
O
6
BY 11832 C1 2009.04.30
№
п/п
Структурная формула
Название
17
Продолжение таблицы 2
Связывание по
отношению к 28гомокастастерону,
%
3α,5-циклостигмаст-6-он
<0,01
Кампастерин (смесь изомеров)
<0,01
холестерин
<0,01
прегненолон
<0,01
O
18
HO
19
HO
O
20
HO
OH
HO
21
HO
HO
{[(22R,23R,24S)-2α,3α,22,23тетрагидрокси-24-этил-5αхолест-6илиденамино]окси}уксусная
кислота (гаптен)
67
NOCH2COOH
Заявляемый конъюгат получается с высоким выходом, обладает стабильностью, высокой степенью посадки гаптена на белок, обеспечивает необходимую иммуногенность и
позволяет получать антитела, специфичные к 28-гомобрассинолиду и 28-гомокастастерону.
Источники информации:
1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Мн.: Навука i
тэхнiка, 1993. - 288 с.
2. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., de Groot Ae. Brassinosteroids - A New Class of Plant
Hormones. San Diego: Acad. Press, 1999. - 456 p.
3. Патент РБ 2806, 2000.
4. Патент РБ 3488, 2000.
5. Патент РБ 3400, 2000.
6. Патент РБ 5168, 2003.
7. Патент РБ 5212, 2003.
7
BY 11832 C1 2009.04.30
8. Патент РБ 5698, 2003.
9. ТУ РБ 100185129.048 - 2002. Брассиностероиды и препаративные композиции на их
основе. - Введ. 2003-02-05. Каталог "Технические условия". - Мн.: Из-во Госстандарт РБ,
2007. Т.2. - С. 549.
10. Schlagnhaufer C.D., Arteca R.N. and Phillips A.T. Monoclonal antibodies against brassinosteriod a new plant growth regulating compound // Plant Physiol. (Suppl.). - 1988. - Vol. 86. P. 113.
11. Carter M.C., Meyerhoff M.E. Instability of succinyl ester linkages in O2'-monosuccinyl
cyclic AMP-protein conjugates at neutral pH // J. Immunol. Methods. - 1985. - Vol.81. - P. 245.
12. Yokota Т., Wanabe S., Ogino Y., Yamaguchi I., Takahashi N. Radioimmunoassay for
brassinosteroids and its use for comparative analysis of brassinosteroids in stems and seeds of
Phaseolus vulgaris // J Plant Growth Regul. - 1990. - Vol. 9. - P.151.
13. Хрипач В.А., Свиридов О.В., Прядко А.Г., Литвиновская Р.П., Драч С.В., Матвеенцев В.Д., Новик Т.В., Михайлопуло К.И., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Аверькова М.А., Драченова О.А., Чащина Н.М. Иммуноферментный анализ (24R)-брассиностероидов // Биоорганическая химия. - 2007. - Т.33. - № 3. - С. 371-378.
14. Патент РБ 9770, МПК С 07J 41/00, 2007.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
146 Кб
Теги
патент, by11832
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа