close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11905

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07H 19/00
A 61K 31/7042
A 61K 31/66
КОНЪЮГАТ ФОСФОЛИПИДА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ
НУКЛЕОЗИДОМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
И СРЕДСТВО, ПОВЫШАЮЩЕЕ УСТОЙЧИВОСТЬ К ДЕЙСТВИЮ
ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ А2
(21) Номер заявки: a 20060558
(22) 2006.06.05
(43) 2008.02.28
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Литвинко Наталья Михайловна; Калиниченко Елена Николаевна; Жерносек Елена Владимировна; Кучуро Светлана Викторовна
(BY)
BY 11905 C1 2009.06.30
BY (11) 11905
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) Водовозова Е.Л. и др. // Биоорганическая
химия. - 1996. - Т. 22, № 6. - С. 451-457.
GB 2168350 A, 1986.
JP 4-210993 A, 1992.
EP 376518 B1, 1995.
KR 2004-0096695 A.
WO 93/16092 A1.
US 5756711 A, 1998.
US 4797479, 1989.
RU 2266294 C2, 2005.
WO 96/25421 A1.
RU 2239638 C2, 2004.
(57)
1. Конъюгат фосфолипида с модифицированным нуклеозидом, полученный взаимодействием природного фосфатидилэтаноламина с 2',3'-дидезоксицитидином или 9-[(2гидроксиэтокси)метил]гуанозином в водном растворе трет-бутилового спирта в присутствии дициклогексилкарбодиимида.
2. Фармацевтическая композиция для повышения устойчивости к действию панкреатической фосфолипазы А2, включающая конъюгат по п. 1.
3. Применение конъюгата по п. 1 в качестве средства, повышающего устойчивость к
действию панкреатической фосфолипазы А2.
Изобретение относится к области биоорганической и фармацевтической химии, в частности к новым биологически активным веществам, а именно к конъюгатам фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот, проявляющих противовирусную и/или противоопухолевую активность, их получению и фармацевтическим
композициям на их основе, и обладающим повышенной устойчивостью к панкреатической фосфолипазе А2.
В настоящее время интенсивно исследуется липосомальное наноструктурное инкапсулирование лекарственных средств для лечения ряда заболеваний [1]. Эффективность
BY 11905 C1 2009.06.30
транспортировки лекарственных средств в таких липидных контейнерах зависит от устойчивости липосом к воздействию различных факторов внутренней среды организма, таких
как липолитическая активность плазмы крови или клеточной поверхности, обмен или перенос липидов мембраны липосом на компоненты плазмы или клеточных мембран, воздействие липолитических ферментов лизосом в процессе эндоцитоза и др. [1]. При
прохождении липосом к органу-мишени через биологическое пространство возможно изменение устойчивости липидной капсулы к действию липолитических ферментов в результате взаимодействия различных белков с заряженной поверхностью фосфолипидов, в
частности для фосфолипазы А2(ФЛА2, КФ 3.1.1.4) [2].
Особый интерес представляют конъюгаты фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот, которые имеют фосфолипидный "якорь", необходимый
для образования липосомальных "контейнеров" при доставке нуклеотидов с противовирусными и противоопухолевыми свойствами к пораженным болезнью органам и последующего внедрения в клеточную мембрану.
Известны биологически активные конъюгаты фосфолипидов с модифицированными
компонентами нуклеиновых кислот [3-7].
Описаны способы получения конъюгатов фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот на основе фосфатидовой кислоты [4, 5, 7], диацилглицерина [5] или моно- и диалкилглицерина [5, 6].
Для фосфатидилнуклеозидов диалкильного типа [5] описан Н-фосфонатный 3-стадийный метод, состоящий в реакции 1,2-дигексадецил-sn-глицерина с треххлористым
фосфором, последующей конденсацией с 3'-азидо-3'-дезокситимидином и 2',3'дидезоксиинозином в присутствии пивалоил хлорида с образованием фосфитдиэфиров,
которые окисляются действием йода в пиридине до конечных продуктов.
Известен также способ получения нуклеозидсодержащих производных фосфатидилхолина, модифицированных по холиновому фрагменту [4], который осуществляется в две
стадии. На первой стадии проводится ферментолиз яичного фосфатидилхолина фосфолипазой D. На второй стадии полученная фосфатидовая кислота конденсируется с 3'-азидо3'-дезокситимидином в присутствии n-толуолсульфохлорида с образованием фосфатидатов 3'-азидо-3'-дезокситимидина диацильного типа (прототип).
Однако известные соединения не охарактеризованы на устойчивость к деградации под
действием панкреатической фосфолипазы А2, что не позволяет создать на их основе устойчивые к действию низкомолекулярных секреторных фосфолипаз А2 фармацевтические
композиции.
Задачей настоящего изобретения являются новые конъюгаты природных фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот, способ их получения и
фармацевтические композиции на их основе, которые могут проявлять противовирусную
и/или противоопухолевую активность и обладают повышенной устойчивостью к панкреатической фосфолипазе А2.
Поставленная задача решается заявляемыми соединениями общей формулы I,
O
O
R2
C
H2C
O
O
O
O
CH
H2C
R1
C
O
O
P
O-
(CH2)2
HN
P
O-
I
2
OR
BY 11905 C1 2009.06.30
где R
NH2
O
N
N
N
NH
N
O
N
NH2
O
O
b
a
а - 2',3'-дидезоксицитидил,
b - 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]-гуанозил (ацикловир).
R1, R2 - алкильный остаток жирной кислоты.
Указанные соединения представляют собой объединенные в единой молекуле модифицированный компонент нуклеиновой кислоты с противовирусным и противоопухолевым действием и липидную составляющую, что обусловливает их пониженную
чувствительность по отношению к активности низкомолекулярных секреторных фосфолипаз А2.
Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая конъюгат фосфолипида с модифицированным нуклеозидом, проявляющим противовирусное и/или противоопухолевое действие, в качестве средства,
обладающего пониженной чувствительностью к активности панкреатической фосфолипазы А2. Заявляемая композиция представляет собой новую липосомальную форму противовирусного и противоопухолевого средства нуклеиновой природы, устойчивую к
действию секреторной фосфолипазы А2 поджелудочной железы.
Следующим объектом настоящего изобретения является получение заявляемых соединений, заключающееся в нагревании соединения формулы II, содержащего первичную
аминогруппу,
O
O
R2
C
H2C
O
O
C
CH
H2C
R1
O
O
P
O
(CH2)2
H2N
O-
II
с нуклеозидом, выбранным из 2',3'-дидезоксицитидина, ацикловира, в водном растворе
трет-бутилового спирта в присутствии дициклогексилкарбодиимида.
В предпочтительном варианте осуществления заявляемого способа процесс ведут в
интервале температур 30-100 °С при pH 6,5-9 с использованием трет-бутилового спирта,
содержащего 10-50 % воды.
Способ иллюстрируется нижеприведенной схемой.
3
BY 11905 C1 2009.06.30
O
O
R2
C
H2C
O
O
R1
O
O
CH
H2C
C
O
O
P
(CH2)2 H2N
-O
+
P
OR
DCC
t-BuOH
H2 O
O-
-
O
III a,b
II
O
O
R2
H2C
C
O
O
R1
O
O
CH
H2C
C
O
P
(CH2)2
O
HN P
OR
O-
OI a,b
O
NH2
N
N
N
O
O
NH
N
N
O
NH2
b
a
а - 2',3'-дидезоксицитидил,
b - 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]-гуанозил (ацикловир).
R1, R2 - алкильный остаток жирной кислоты.
Выходы целевых продуктов (la, lb) после хроматографического деления на силикагеле
составляют 60 %.
Заявляемый способ позволяет легко вводить разнообразные нуклеозидные заместители в полярную часть молекулы фосфолипида и тем самым упростить получение конъюгатов фосфолипидов с компонентами нуклеиновых кислот.
Приведенные ниже примеры получения заявляемых соединений подтверждают возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем.
Пример 1
Конденсация 5'-монофосфата 2',3'-дидезоксицитидина (IIIа) с фосфатидилэтаноламином (II)
К суспензии 31 мг (0,107 ммоль) 2',3'-дидезоксицитидин-5'-монофосфата (IIIа) в 7 мл
смеси трет-бутиловый спирт:вода (4:1, об) добавляют 65 мг (0,092 ммоль) фосфатидилэтаноламина (II), после чего к реакционной смеси прибавляют 50 мг (0,243 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC). Реакционную смесь перемешивают при нагревании до 6570 °С в течение 6 часов, после чего добавляют еще 20 мг (0,028 ммоль) фосфатидилэтаноламина и 10 мг (0,049) DCC и нагревают затем в течение 5 часов при той же температу4
BY 11905 C1 2009.06.30
ре при перемешивании на магнитной мешалке. По окончании реакции реакционную смесь
выпаривают, наносят на колонку с силикагелем и элюируют смесью хлороформ:метанол:вода при соотношении 100:10:0,5, 10:6:1 и 10:8:1. Фракции, содержащие продукт, выпаривают. Получено 23 мг (21,6 %).
Пример 2
Конденсация 9-(гидроксиэтилоксиметил)гуанин монофосфата (ацикловир монофосфата) (IIIb) с фосфатидилэтаноламином (II)
К суспензии 20 мг (0,066 ммоль) 9-(гидроксиэтилоксиметил)гуанин монофосфата
(IIIb) в 4 мл смеси третбутиловый спирт:вода (4:1) добавляют 50 мг (0,071 ммоль) фосфатидилэтаноламина (II), после чего к реакционной смеси добавляют 50 %-й раствор триэтиламина до pH 7 и 30 мг (0,145 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC). Реакционную смесь перемешивают при нагревании до 65-70 °С в течение 6 часов, после чего
добавиляют еще 20 мг (0,028 ммоль) фосфатидилэтаноламина и 10 мг (0,049) DCC и нагревают затем в течение 5 часов при той же температуре при перемешивании на магнитной мешалке. По окончании реакции реакционную смесь выпаривают, наносят на колонку
с силикагелем и элюируют смесью хлороформ:метанол:вода при соотношении 100:10:0,5,
10:6:1 и 10:8:1. Фракции, содержащие продукт, выпаривают. Получено 18 мг (24 %) 9(гидроксиэтилоксиметил)гуанин монофосфат фосфатидилэтаноламин -фосфорамидата Ib.
Структуры химерных соединений 1a, 1b, подтверждены (таблица) совокупностью физико-химических данных (УФ, ПМР, ЯМР Р31).
Таблица 1
Физико-химическая характеристика соединений la, lb
Шифр
1а
lb
Название
5'-О-[N-этил-2-(1,2-диацилsn-глицеро-3-фосфо)]фосфоамидат-2',3' дидезоксицитидин
5'-O-[N-этил-2-(1,2-диацилsn-глицеро-3-фосфо)]фосфоамидат-ацикловир
Характеристика
ТСХ, Rf = 0,5 (хлороформ:метанол:вода - 10:6:1),
УФ (хлороформ:метанол, 2:3), λ нм (ε, рис. 1,2):
pH 7,270max (7800); pH 3,283max (9500)
ТСХ, Rf = 0.5 (хлороформ:метанол:вода -10:6:1),
УФ (хлороформ:метанол, 2:3), λ нм (ε): pH
7249max (8800), pH 3275 sh
Биологическое действие заявляемых соединений подтверждено тестированием in vitro
с использованием панкреатической ФЛА2, результаты которого приведены в разделе "Исследование антифосфолипазной биологической активности".
Исследование биологической активности
При проведении реакции липолиза максимальная доступность субстрата для фермента
обеспечивается в случае использования фосфолипидов в мицеллярной фазе, сформированной детергентами, которые рассматриваются как неизменная матрица, поскольку не
гидролизуются фосфолипазами [9]. В связи с этим для определения устойчивости синтезированных химерных субстратов к атаке ФЛА2 используют мицеллярную фазу, сформированную конъюгатами и детергентами.
Смешанные мицеллы получают солюбилизацией раствором детергента пленки, образующейся после удаления растворителя из раствора фосфатидилэтаноламина, ФЭА (или
конъюгата) в хлороформе. Смешанные мицеллы готовят включением ФЭА (или конъюгата) в фазу поверхностно-активных веществ - дезоксихолата натрия (ДОХ, анионный детергент при оптимальном соотношении 1:2) и тритона-Х-100 (ТХ, неионный детергент
при оптимальном соотношении 1:8). Диметилсульфоксид (ДМСО) добавляют к 0,05 М
трис-HCl, pH 7,4 - 1:10 соответственно.
Соединения 1(a,b) вносят в виде раствора в хлороформе и упаривают. Реакционная
смесь содержала субстрат (0,51 мкмоль), 2 мМ CaCl2 и 0,05 М трис-HCl, pH 7,4. Реакцию
гидролиза смешанных мицелл фосфолипида или конъюгата 1(a,b) начинают добавлением
5
BY 11905 C1 2009.06.30
в среду при 37 °С раствора ФЛА2 поджелудочной железы (0,06 ед./мл) и останавливают
добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ, упаривали пробу при 40 °С. Продукты реакции анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в
системе растворителей хлороформ/метанол/вода 10:6:1. Пластины проявляют реагентом
на фосфолипиды [10], пятна фосфолипида, конъюгата и их лизопроизводных выскребают
и анализируют в них содержание фосфора по методу, описанному в работе [10]. За единицу активности фермента принимают количество ФЛА2 поджелудочной железы, катализирующее образование 1 мкмоль продукта / мин 37 °С.
На основе изменения скорости гидролиза ФЭА или конъюгатов 1(а) V, (мкмоль·мин-1·мг-1)
в мицеллярной фазе под действием ФЛА2 обнаружено, что на всем временном интервале
скорость гидролиза конъюгата 1a по сравнению с ФЭА была существенно ниже: за три
часа ФЛА2 яда змеи гидролизует 80 % ФЭА и 30 % 5'-O-[N-этил-2-(1,2-диацил-sn-глицеро3-фосфо)]-фосфоамидат-2',3'-дидезоксицитидина (1а), скорость гидролиза (мкмоль·мин-1·мг-1)
составила соответственно 0,11, и 0,04 (таблица 2).
Таблица 2
Гидролиз под действием ФЛА2 яда змеи фосфатидилэтаноламина и конъюгата 1(а)
Общий гидроСкорость гидролиза,
Субстрат
Относительная скорость
лиз, %
мкмоль·мин-1·мг-1
ФЭА
80
0,11
1
30
0,04
0,31
1a
На фиг. 1 представлена зависимость скорости гидролиза под действием ФЛА2 поджелудочной железы свиньи фосфатидилэтаноламина в мицеллярной фазе, сформированной
дезоксихолатом натрия (ось ординат, V, мкмоль·мин-1·мг-1), от времени (ось абсцисс, t,
мин). Скорость гидролиза (V) выражена в количестве образовавшегося продукта реакции
(мкмоль) в единицу времени (мин) на мг белка. Изменение во времени скорости гидролиза
(V, мкмоль·мин-1·мг-1) природного субстрата ФЭА (верхняя кривая) и модифицированного
фосфолипида 5'-O-[N-этил-2-(1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфо)]-фосфоамидат-ацикловира
(1b, нижняя кривая) в условиях насыщения фермента субстратом показывает, что относительная скорость реакции модифицированного субстрата в сравнении с природным ФЭА
для последовательных временных точек 2,5 и 10 мин в среднем составляет 0,33, 0,34 и
0,24 соответственно. Таким образом, модифицированный субстрат разрушается ферментом втрое с более низкой скоростью, чем природный фосфолипид. Общий объем реакционной смеси 1 мл. Учитывая то, что степень гидролиза модифицированного субстрата 1b
за исследованный промежуток времени до 24 час практически не меняется и составляет не
более 30 % от исходного, 5'-O-[N-этил-2-(1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфо)]-фосфоамидатацикловир используют для формирования липосом, как примера создания формы лекарственного средства нового поколения, которая сочетает одновременно компонент нуклеиновых кислот, обладающий противовирусными свойствами (ацикловир), с липидной
составляющей новой лекарственной формы.
Создание липосом из 5'-O-[N-этил-2-(1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфо)]фосфоамидат-ацикловира
Для получения липосом из конъюгата пуриновых нуклеозидов с фосфолипидами (2,6
мкмоль) хлороформ, в котором растворяют фосфолипиды, упаривают на роторном испарителе. Остатки растворителя удаляют в течение 30 мин с помощью вакуумного насоса. К
образовавшейся фосфолипидной пленке добавляют 0,05М трис-HCl буфер pH 7,4 до получения конечной концентрации субстрата 1,3 мМ. Полученную эмульсию обрабатывают
ультразвуком 5 раз по 0,5 мин с перерывом в 1 мин с помощью УЗДН-2Т (22 кHz, 20mA).
К полученным липосомам добавляют CaCl2 до концентрации 2 мМ.
6
BY 11905 C1 2009.06.30
На фиг. 2 представлены электронные микрофотографии липосом (обозначены темным
цветом), полученные с помощью электронного микроскопа "JEM-100CX" без контрастного вещества методом нанесения препарата на пленку-подложку форм-вара. Размеры липосом, представленных на фиг. 2, составляют 180-200 нм.
Исследование устойчивости липосом из 5'-O-[N-этил-2-(1,2-диацил-sn-глицеро-3фосфо)]-фосфоамидат-ацикловира к действию панкреатической ФЛА2
Устойчивость конъюгатов пуриновых нуклеозидов с фосфатидилэтаноламином к ферментативной деградации устанавливают их обработкой ФЛА2 поджелудочной железы в
течение от 5 мин до 3 часов, что моделирует воздействие липолитических ферментов при
прохождении таких химерных липосом через биологическое пространство.
Реакцию гидролиза липосом из 5'-О-[N-этил-2-(1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфо)]фосфоамидат-ацикловира под действием панкреатической ФЛА2 начинают внесением в
реакционную среду 12,75 мкг/мл фермента и проводят при 37 °С. Реакцию останавливают
добавлением раствора ЭДТА до конечной концентрации 5,4 мМ. Продукты реакции упаривают при 40 °С. Конъюгат и его лизо-форму разделяют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе хлороформ-метанол-вода 10:6:1. Фосфолипиды проявляют с
помощью реактива Васьковского [10].
Конъюгат ацикловир-5'-монофосфата с фосфатидилэтаноламином в виде липосом
практически не гидролизуется ФЛА2 поджелудочной железы в течение 30 мин. На фиг. 3
представлены результаты выявления устойчивости липосом, сформированных из конъюгата (светлые столбики), по сравнению с липосомами из природного фосфатидилэтаноламина (темные столбики), при атаке ФЛА2 поджелудочной железы в течение часа (левые
два столбика) и трех часов (правые два столбика). Устойчивость определяют как степень
гидролиза, выраженную в % (ось абсцисс), во времени (ось ординат, час): гидролиз конъюгата 1b за 60 мин происходит на 18 ± 4 %, в то время как деградация липосом из фосфатидилэтаноламина к этому времени достигает максимально возможной - 60 ± 8 %; за
3 часа ферментативный гидролиз конъюгата (pH 7,4, t = 37 °С) осуществляется на 30 %.
Источники информации:
1. Грегориадис Г. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина, 1983. - С. 3693.
2. Литвинко Н.М., Шумилина Т.А., Наубатова М.К., Ахрем А.А. Изучение устойчивости липосом как потенциальных переносчиков лекарственных веществ к действию фосфолипазы А2 // Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т. 29, вып 3. - С. 478-484.
3. Ryu E.K, Ross R.J., Matsushita Т. Т. et al. Phospholipid-Nucleoside Conjugates 3.1 Synthesis and Preliminary Biological Evaluation of l-β-D-Arabinofuranosylcytosine
5'Monophosphate-L-1,2-Dipalmitin
and
Selected
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine
5'Diphosphate-L-1,2-Diacylglycerol //J.Med.Chem. - 1982. - Vol. 25. - P. 1322-1329.
4. Водовозова Е.Л., Павлова Ю.Б., Полушкина М.А., Ржанинова А.А., Гараев М.М.,
Молотковский Юл.Г. Новые фосфолипиды - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека. Синтез и антивирусная активность //Биоорг. химия.- 1996. - Т.32, № 6. С. 451-457 (прототип).
5. Brachwitz H., Bergmann J., Thomas Y., Wollny Т., Langen P. Synthesis and Antiproliferative Potency of 9-β-D-Arabinofuranosyl-2-fluoroadenine Phospholipid Adducts // Bioorg.Med.Chem. - 1999. - N7. - P. 1195-1200.
6. Фещенко Л.Л, Барай В.Н., Кисель М.А., Зинченко А.И., Михайлопуло И.А. Субстратные свойства модифицированных нуклеозидов в реакции трансфосфатидилирования,
катализируемой фосфолипазой D Streptomyces netropsis/ //Материалы Межд. Конференции
7
BY 11905 C1 2009.06.30
"Микробиология и биотехнология XXI столетия" / HAH Беларуси, Ин-т микробиологии
НАНБ, концерн "Белбиофарм". - Минск, 2002. - С. 106-108.
7. Патент RU 2254133 С 2 2 254 133; А61К 31/513, 45/06, А 61 З 31/18 ShINAZI, R.F.,
KhAMMOND D., MELLORS D.V., LIOTTA D.K, № заявки 2001 123432/15. Заявл.
21.01.2000.
8. J.G. Moffat, H. G. Khorana. // J.Am. Chem.Soc. - 1961. - Vol. 83. - P. 649-659.
9. Литвинко Н.М. Активность фосфолипаз А2 и C при биохимическом моделировании,
2002, Технопринт, 350 с.
10. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.V., Vasendin L.N. // Chromatogr. 1975. Vol. 114, № 1. P.
129-141.
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
643 Кб
Теги
by11905, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа