close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11915

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 11915
(13) C1
(19)
(46) 2009.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
C 12N 1/20
C 12N 9/18
ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOMYCES NETROPSIS,
ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ФОСФОЛИПАЗУ D
(54)
(21) Номер заявки: a 20071025
(22) 2007.08.15
(43) 2009.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Биричевская Лариса Леонидовна; Ерошевская Людмила Анатольевна; Зинченко Анатолий Иванович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) RU 2003125183 А, 2005.
БАРАЙ В.Н. и др. Микробиология и
биотехнология ХХI столетия. Материалы международной конференции.
Мн., 2002. - С. 169-170.
ФЕЩЕНКО Л.Л. и др. Молекулярные
механизмы генетических процессов и
биотехнология. Международный симпозиум. - Москва-Минск, 2001. - С. 424425.
BY 11915 C1 2009.06.30
(57)
Штамм бактерий Streptomyces netropsis БИМ В-428Д - продуцент фосфолипазы D.
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый штамм Streptomyces netropsis БМ-35, который может быть использован как продуцент
фосфолипазы D (ФЛД). Этот фермент способен переносить фосфатидильный остаток с
молекулы лецитина (синоним - фосфатидилхолин) на первичную OH-группу некоторых
соединений и, в связи с этим, применяется для получения фосфатидилсерина [1], фосфатидильных производных нуклеозидов [2, 3] и др. фармакологически активных соединений
общей формулы:
CH2OR1
CHOR2 O
CH2O
P
OR3 ,
Oгде R и R - остатки природных жирных кислот; R - остаток серина или нуклеозида.
Известен штамм Streptomyces septatus TH-2, клетки которого секретируют в культуральную среду ФЛД с активностью 3,6 ед./мл при культивировании в течение 72 ч [4].
1
2
BY 11915 C1 2009.06.30
Недостатком указанного штамма является относительно низкая продуктивность в отношении ФЛД и низкая скорость синтеза этого фермента.
Известен штамм Streptoverticillium hachijoense ATCC 19769, синтезирующий внеклеточную ФЛД в количестве до 5 ед./мл культуральной жидкости (КЖ) при культивировании в течение 72 ч [5].
Недостатком указанного штамма является сравнительно невысокая активность ФЛД и
низкая скорость синтеза этого фермента.
Известен штамм Streptomyces netropsis БИМ В-235, синтезирующий внеклеточную
ФЛД в количестве до 13 ед./мл КЖ при культивировании в течение 14-15 ч [6]. Недостатком указанного штамма является сравнительно невысокая активность ФЛД.
Из известных штаммов-продуцентов ФЛД наиболее близким по активности (эффективности) к предлагаемому является штамм Streptomyces cinnamoneum ATCC RTA-6205.
Продуцирующая способность штамма-прототипа в отношении ФЛД составляет 1015 ед./мл КЖ при культивировании в течение 15-20 ч [7] (прототип).
Недостатками штамма-прототипа являются сравнительно невысокая активность ФЛД
и относительно высокая длительность культивирования.
Цель изобретения - получение нового штамма бактерий Streptomyces netropsis БМ-35 с
повышенной активностью ФЛД при менее длительном процессе культивирования.
Штамм Streptomyces netropsis БМ-35 получен из музейного штамма Streptomyces netropsis БИМ В-235, согласно метода, описанного в работе [4], а именно путем отбора наиболее активных вариантов при многократном рассеве исходной культуры на плотной
агаризованной минеральной среде с соевым лецитином в качестве единственного источника углерода. Среда для селекции (рН 7,0) имела следующий состав, (г/л):
Лецитин - 10,0;
KNO3 - 2,0;
K2HPO4 - 1,0;
NaCl - 0,5;
MgSO4x7H2O - 0,5;
FeSO4x7H2O - 0,01.
Штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ
"Институт микробиологии HAH Беларуси" под коллекционным номером БИМ В-428Д и
характеризуется следующими свойствами.
Морфологические признаки.
Вегетативные гифы диаметром 0,8-1,2 мкм образуют хорошо развитый истинный,
нефрагментированный, разветвленный мицелий. Воздушный мицелий хорошо выражен,
имеет характерную мутовчатую ("вертициллятную") организацию.
На агаризованной овсяной среде (30 °С, 7 суток культивирования) колонии круглой
правильной формы, диаметром 2-5 мм, выпуклые. Окраска колоний (обусловлена цветом
воздушного мицелия и споровых масс) сначала белая, с возрастом переходит в бежевую с
розоватым (бледно-лиловым) оттенком. Поверхность колоний вначале гладкая, позднее
образуется хорошо выраженный дымчатый воздушный мицелий, края колоний относительно ровные, структура бархатистая. Реверзум колоний желтовато-коричневый, обусловлен цветом субстратного мицелия, врастающего в агар.
Цепочки артроспор образуются на мутовчатых спороносцах (вертициллах) воздушного мицелия. Споры неподвижные, гладкие, округлые.
Характерно образование коричневого пигмента, диффундирующего в среду.
Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства.
Имеет широкий диапазон температуры роста ~10-45 °С. Оптимум роста - 26-32 °С при
рН 6,5-8,0.
Аэроб. Хемоорганотроф. По Граму окрашивается положительно.
Гидролизует крахмал и желатину, не гидролизует казеин.
2
BY 11915 C1 2009.06.30
В процессе роста образует кислоту из трегалозы и рибозы. Утилизирует D-глюкозу,
глицерин, инозит. Слабо утилизирует фруктозу и сахарозу, не усваивает L-арабинозу,
раффинозу, целлюлозу, L-рамнозу, D-ксилозу, маннит и сорбит. Усваивает L-пролин, но
не L-метионин.
Деградирует цитрат, L-тирозин и ксантин, не деградирует эскулин.
H2S не образует. Продуцирует меланиновые пигменты.
Гемолитическими свойствами не обладает. Не токсичен для теплокровных животных.
Содержание Г + Ц в составе ДНК 71,5 мол. % (определено оптическим методом).
Штамм сохраняет жизнеспособность не менее полугода при хранении в холодильнике
(4-6 °С) на скошенной агаризованной овсяной среде. Для длительного хранения особенно
подходит метод криоконсервации в парах жидкого азота, а также лиофилизация (криопротектор - 10 %-ное обезжиренное молоко).
При выращивании на полноценных средах, богатых органическим азотом, клетки
Streptomyces netropsis БМ-35 способны продуцировать внеклеточную ФЛД в количестве
24 ед. акт./мл КЖ.
Для культивирования Streptomyces netropsis БМ-35 с целью получения ФЛД, применяют питательную среду (рН 7,2), приготовленную на водопроводной воде, следующего
состава (%):
глюкоза - 1,0;
дрожжевой экстракт - 2,0.
Культивирование стрептомицета проводят на орбитальной биологической качалке при
частоте оборотов платформы 170-190 об/мин и температуре 28-30 °С в течение 14-15 часов в 250 мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл питательной среды.
По окончании культивирования КЖ фильтруют через бязь.
Активность ФЛД в фильтрате КЖ определяют в реакции синтеза фосфатидилэтанола
из фосфатидилхолина (соевый лецитин Epicuron-200 фирмы Lucas Meyer, Германия) и
этанола. К реакционной смеси, состоящей из 200 мкл хлороформа с растворенным в нем
фосфатидилхолином в количестве 5 мкмоль и 195 мкл 100 мМ Na-ацетатного буфера с
50 мМ CaCl2, содержащего 200 мкмоль этанола, прибавляют 5 мкл фильтрата КЖ и инкубируют при 37 °С в течение 10 мин. Реакцию останавливают, добавляя к реакционной
смеси 100 мкл 1 M HCl. Для лучшей экстракции фосфолипидов и расслоения фаз вносят
400 мкл смеси хлороформ-метанол (2:1). После центрифугирования (5 мин, 3000 g) органическую фазу отделяют и хроматографируют на тонкослойной пластинке "Silufol-UV254"
фирмы "Serva" (Германия) в системе растворителей хлороформ-метанол-25 %-ный водный аммиак (7:4:1). Фосфолипиды обнаруживают, используя специфический реагент [8],
либо 10 % раствор H2SO4 в метаноле с последующим нагреванием пластинки до 200 °С.
Целевой продукт идентифицируют сравнением с положением образца-свидетеля. Количество образовавшегося фосфатидилэтанола определяют по фосфору методом Васьковского
[8].
За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое обеспечивает образование фосфатидилэтанола в количестве 1 мкмоль за 1 мин в указанных выше
условиях реакции.
Активность штамма Streptomyces netropsis БМ-35 в сравнении с другими штаммами
микроорганизмов представлена в табл. 1.
3
BY 11915 C1 2009.06.30
Таблица 1
Сравнение активности предлагаемого и известных штаммов микроорганизмов
Штамм
Активность ФЛД
Длительность
Источник информации
ед./мл
отн. % культивирования,
ч
КЖ
Streptomyces netropsis БМ-35
24
100
14-15
Предлагаемое
решение
Streptomyces cinnamoneum
10-15
42-63
15-20
[7]
ATCC RTA-6205 (прототип)
Streptomyces netropsis
13
54
14-15
[6]
БИМ В-235 (аналог 3)
Streptoverticillium hachijoense
5
21
72
[5]
ATCC 19769 (аналог 2)
Streptomyces septatus
3,6
15
72
[4]
TH-2 (аналог 1)
Streptomyces halstedii К-5
3,5
15
72
[4]
Streptomyces sp. ATCC 55717
3
13
23
[9]
Streptoverticillium cinnamoneum
2,4
10
72
[10]
IFO 12852
Streptomyces sp. PM-43
1,2
5
48
[11]
Streptomyces sp. PMF
1,1
5
48
[11]
Streptomyces chromofuscus
0,5
2
45
[12]
A-0848
Из данных табл. 1 следует, что эффективность штамма Streptomyces netropsis БМ-35
значительно выше любого из известных штаммов микроорганизмов. Дополнительным
преимуществом этого штамма является сокращенная (до 14-15 ч) продолжительность выращивания.
Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения ФЛД.
Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.
Пример 1. Культивирование Streptomyces netropsis БМ-35 в оптимальных условиях.
Культивирование Streptomyces netropsis БМ-35 проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на термостатируемой биологической качалке с частотой колебания платформы 170-190 об/мин при температуре 28 °С в течение 15 ч. Питательная среда для
выращивания приготовляется на водопроводной воде и имеет следующий состав, г/л:
глюкоза - 10, дрожжевой экстракт - 20 (рН 7,2). Стерилизацию среды осуществляют горячим паром под давлением в режиме 0,5 ати, 15 минут. Объем питательной среды составляет 40 % от объема колбы (100 мл).
По окончании выращивания культуральную жидкость фильтруют через ткань (бязь),
мицелий отжимают. Фильтрат КЖ используют в качестве источника ФЛД. Активность
ФЛД, определенная как описано выше, составляет 24 ед./мл. Фермент в составе фильтрата
КЖ может храниться при 4-6 °С (в холодильнике) без существенной (менее 10 %) потери
активности в течение 6 месяцев.
Пример 2. Динамика накопления ФЛД в КЖ при культивировании Streptomyces netropsis БМ-35.
Культивирование Streptomyces netropsis БМ-35 проводят в условиях примера 1 за исключением того, что активность ФЛД определяют на разных стадиях процесса выращивания микроорганизма.
4
BY 11915 C1 2009.06.30
В табл. 2 представлена зависимость фосфолипазной активности от продолжительности выращивания заявляемого штамма Streptomyces netropsis БМ-35. Из таблицы видно,
что предлагаемый в качестве продуцента ФЛД штамм обеспечивает накопление максимальной активности через 14-15 ч культивирования.
Таблица 2
Динамика накопления в среде ФЛД при культивировании
Streptomyces netropsis БМ-35
Время культивирования, ч
Активность ФЛД
ед./мл КЖ
отн. %
5
7,4
31
10
16,3
68
13
22,8
95
14
23,8
99
15
24,0
100
18
23,9
100
19
23,5
98
20
23,1
96
24
22,0
92
Пример 3. Получение препарата ФЛД.
Культивирование штамма Streptomyces netropsis БМ-35 проводят в условиях примера 1. Затем 100 мл фильтрата КЖ охлаждают и к нему приливают тонкой струйкой при
перемешивании охлажденный до -18 °С ацетон до 63 % конечного объема. После формирования осадка при 4 °С в течение 30 мин, его осаждают центрифугированием при 5000 g
(5 мин), высушивают под вакуумом и растирают в фарфоровой ступке. Получают 0,2 г
тонкодисперсного порошка с активностью 12 ед./мг препарата.
ФЛД в составе сухого препарата может храниться при 4-6 °С (бытовой холодильник)
без существенной потери активности не менее 1 года.
Таким образом, получен штамм, обладающий по сравнению с известным штаммомпродуцентом ФЛД значительно более высокой продуктивностью (24 ед. акт./мл КЖ против 10-15 ед. акт./мл КЖ) и меньшей продолжительностью культивирования (14-15 ч вместо 15-20 ч).
Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов-продуцентов ФЛД.
Источники информации:
1. Патент США 6878532, 2005.
2. Shuto S., Itoh H., Sakai A., Nakagami K., Imamura S., Matsuda A. Nucleosides and nucleotides-CXXXVII. Antitumor phospholipids with 5-fluorouridine as a cytotoxic polar-head:
synthesis of 5'-phosphatidyl-5-fluorouridines by phospholipase D-catalyzed transphosphatidylation // Bioorgan. Med. Chem. - 1995. - V. 3. - № 3. - P. 235-243.
3. Ulbrich-Hofmann R., Lerchner A., Oblozinsky M., Bezakova L. Phospholipase D and its
application in biocatalysis // Biotechnol. Lett. 2005. V. 27, № 8. P. 535-543.
4. Hagishita Т., Nishikawa M., Hatanaka T. Isolation of phospholipase D producing microorganisms with high transphosphatidylation activity // Biotech. Lett. - 2000. - V. 22. - № 20. P. 1587-1590.
5. Патент РФ 2289625, 2005.
6. Биричевская Л.Л., Зинченко А.И. Влияние состава питательной среды и условий
культивирования на продуцирование фосфолипазы D культурой Streptomyces netropsis
5
BY 11915 C1 2009.06.30
БИМ В-235. Научное пространство Европы-2007. Материалы III Междунар. науч. конф. Днепропетровск, 16-30 апреля 2007. В 6 т. - Днепропетровск: Наука и образование, 2007. T. 5. - С. 6-15.
7. Патент США 7049107, 2006.
8. Vaskovsky V.E, Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid
analysis // J. Chromatogr. - 1975. - V. 114. - P. 129-141.
9. Патент США 5700668, 1997.
10. Ogino C., Negi Y., Matsumiya T., Nakaoka K., Kondo A., Kuroda S., Tokuyama S.,
Kikkawa U., Yamane T., Fukuda H. Purification, characterisation, and sequence determination
of phospholipase D secreted by Streptoverticillium cinnamoneum // J. Biochem. - 1999. - V. 125. № 2. - P. 263-269.
11. Carrea G., D'Arrigo P., Piergianni V., Roncaglio S., Secundo F., Servi S. Purification
and properties of two phospholipases D from Streptomyces sp. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 1255. - № 3. - P. 273-279.
12. Imamura S., Horiuchi Y. Purification of Streptomyces chromofuscus phospholipase D by
hydrophobic affinity chromatography on palmitoyl cellulose // J. Biochem. - 1979. - V. 85. P. 75-93.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
103 Кб
Теги
by11915, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа