close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11916

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11916
(13) C1
(19)
C 12N 1/21
C 21N 9/12
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ
НУКЛЕОЗИДФОСФОТРАНСФЕРАЗУ ERWINIA HERBICOLA
(21) Номер заявки: a 20071196
(22) 2007.10.01
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Квач Сергей Вячеславович;
Ерошевская Людмила Анатольевна;
Зинченко Анатолий Иванович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное научное учреждение "Институт
микробиологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) КВАЧ С.В. и др. Доклады Национальной академии наук Беларуси, 2006,
т.50, № 2, с. 59-63.
КВАЧ С.В. Биосинтез, свойства и
применение нуклеозидфосфотрансферазы Erwinia herbicola БИМ В-345 для
получения нуклеозид-5'-монофосфатов. Автореферат диссертации. Минск,
2006, с. 2, 14-16.
КВАЧ С.В. и др. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы Международной конференции.
Минск, 2004, с. 70-72.
MIHARA Y. et al. J.Biosci.Bioeng.,
2001, v.92, No1, p. 50-54.
BY 11916 C1 2009.06.30
(57)
Штамм бактерий Escherichia coli БИМ В-435 Д - продуцент нуклеозидфосфотрансферазы Erwinia herbicola.
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к генной инженерии, и решает задачу получения нового высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента нуклеозидфосфо-трансферазы (НФТ). Этот фермент
способен трансформировать нуклеозиды в соответствующие нуклеозид-5'-монофосфаты
[1, 2] и в связи с чем может быть использован для получения фармсубстанций кардиологических (АМФ), противовирусных (ара-АМФ) и противоопухолевых (2-фтор-ара-АМФ)
лекарственных препаратов.
Известен штамм бактерий Erwinia herbicola 47/3, полученный при помощи методов
микробиологической селекции и продуцирующий НФТ в количестве 9,8 ед./мг клеток [3].
Недостатком указанного штамма является низкая продуктивность в отношении НФТ.
Известен также штамм Escherichia coli NPT5. Продуцирующая способность штамма в
отношении НФТ составляет 1072 ед./мг клеток [4].
Недостатком этого штамма является сравнительно невысокая активность НФТ.
Из известных штаммов-продуцентов НФТ наиболее близким по активности к предлагаемому является штамм Escherichia coli JM 109[pPRP 100] (прототип). Штамм-прототип
получен трансформацией Escherichia coli JM 109 рекомбинантной плазмидой pUC19, в ко-
BY 11916 C1 2009.06.30
торую встроен ген НФТ, изолированный с помощью ПЦР из хромосомной ДНК патогенной бактерии Providencia stuartii [5].
Недостатком штамма-прототипа является сравнительно невысокая активность НФТ,
составляющая 1750 ед./мг клеток.
Настоящее изобретение решает задачу получения штамма Escherichia coli НФТ 15 более продуктивного бактериального штамма-продуцента НФТ.
Источником структурного гена npt, кодирующего аминокислотную последовательность НФТ, служила хромосомная ДНК бактерии Erwinia herbicola 47/3. Эту ДНК подвергли частичной рестрикции с помощью эндонуклеазы Sau3AI. Полученные фрагменты
ДНК фракционировали при помощи агарозного гель-электрофореза и адсорбционной
хроматографии на колонке с силикагелем и лигировали в предварительно BamHIлинеаризованную и дефосфорилированную плазмиду pBluescript KS. Смесью полученных
плазмид трансформировали компетентные клетки Escherichia coli DH5α, полученные
стандартным кальциевым методом [6] с последующим высевом на плотную питательную
среду. При скрининге 60 тысяч трансформантов отобран рекомбинантный штамм Escherichia coli НФТ 15, проявивший максимальную продуктивность в отношении НФТ.
Среда TMPG для селекции (рН 7,2) имела следующий состав [7]:
Триптозный агар ("Difco", США) - 3,0 %;
Фенолфталеиндифосфат ("Serva", Германия) - 0,1 %;
Метиловый зеленый ("Serva", Германия) - 0,005 %.
Бактерии, обладающие высоким уровнем НФТ-активности, детектировались визуально по ярко-зеленой окраске колоний. Отобранные клоны выращивали глубинным способом на LB-среде, имеющей состав, %: триптон ("Sigma" США) -1,0; дрожжевой экстракт
("Sigma" США) - 0,5; NaCl - 1,0), с ампициллином (50 мкг/мл) при 37 °С в течение 24 ч и
анализировали на НФТ-активность.
Штамм-продуцент Escherichia coli НФТ15 отличается от штамма-реципиента Escherichia coli DH5α наличием нескольких копий рекомбинантной плазмиды pBluescript
SK, в которую лигирован ген npt, ответственный за синтез НФТ. В качестве генетического
маркера эта плазмида содержит ген β-лактамазы, придающей клеткам, трансформированным плазмидой, устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.
Клетки Escherichia coli НФТ 15 проявляют способность к суперпродукции НФТ, которая накапливается в клетках в количестве более 10 % от суммарного белка бактерий.
Штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ
"Институт микробиологии НАН Беларуси" под коллекционным номером БИМ В-435Д и
характеризуется следующими свойствами.
Генотип.
F-, endA1, hsdR17 (rk- mk+ ), glnV44, thi-1, recA1, gyrA, relA1, ∆(lacIZYAargF)U169,
deoR, (ϕ80dlac∆(lacZ)M15) [Sambrook, 1989]. Клетки содержат плазмиду pBluescript SK со
встроенными генами НФТ и β-лактамазы, детерминирующей устойчивость клеток к пенициллиновым антибиотикам.
При анализе плазмиды, выделенной из клеток штамма Escherichia coli НФТ 15 с помощью рестрикционных эндонуклеаз, были получены следующие данные:
а) вставка, содержащая в себе ген, кодирующий НФТ, имеет размер ~4 000 пар оснований;
б) вставка содержит в себе сайты рестрикции HindIII (на расстоянии ~820 пар оснований от 5'-конца вставки), SalI (на расстоянии ~850 пар оснований от 5'- конца вставки) и
двух сайтов DraI (расположение не определено).
Морфологические признаки.
Клетки - прямые палочки размером (1,1-1,5)×(2,0-6,0) мкм; подвижные, перитрихальное жгутикование; грамотрицательные.
2
BY 11916 C1 2009.06.30
На МПА и агаризованной среде Адамса (30 °С, 3 сут.) колонии гладкие, слабо выпуклые, легко сливающиеся. Цвет колоний желтый. Поверхность блестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые.
Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства.
Растет на простых питательных средах, содержащих ампициллин в количестве 60125 мкг/мл.
Диапазон температуры роста бактерий - 8-40 °С с оптимумом - 25-30 °С. рН-оптимум
роста находится в зоне 7,2-7,4. Факультативный анаэроб.
Клетки Escherichia coli НФТ15 могут использовать ацетат, а цитрат не используют в
качестве единственного источника углерода. Глюкоза и другие углеводы сбраживаются с
образованием пирувата, который затем превращается в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Индолположительны, не образуют H2S на железо-сахарной среде, не сбраживают лактозу и малонат, не гидролизуют желатин.
На бульоне Хоттингера к 24 ч (30 °С) рост бактерий выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается
при встряхивании (S-форма).
Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Содержание Г + Ц в составе ДНК 56,3±0,5 мол. % (определено оптическим методом).
Клетки Escherichia coli НФТ15 сохраняют жизнеспособность не менее полугода при
хранении в холодильнике (4-6 °С) на полноценной агаризованной среде (мясо-пептонный
бульон, среда Хоттингера), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), под слоем вазелинового масла, а также в лиофилизированном (криопротектор - 10 %-ное обезжиренное молоко)
состоянии.
Клетки Escherichia coli НФТ15 после разрушения обладают способностью синтезировать пуриновые и пиримидиновые нуклеозид-5'-монофосфаты из соответствующих нуклеозидов и n-нитрофенилфосфата. НФТ-активность клеток, измеренная в реакции синтеза
АМФ из аденозина составляет 2200 ед./мг клеток.
Содержание НФТ в клетках штамма Escherichia coli НФТ15 составляет до 10 % от
суммарного содержания белка и фермент после разрушения клеток, например, ультразвуком может быть использован без дополнительной очистки или очищен до гомогенного
состояния стандартными методами.
Для культивирования Escherichia coli НФТ 15 с целью получения НФТ применяют питательную среду LB (рН 7,0), приготовленную на водопроводной воде, следующего состава (%):
триптон ("Sigma" США) - 1,0;
дрожжевой экстракт ("Sigma" США) - 0,5;
NaCl - 1,0.
Культивирование бактерий проводят на орбитальной биологической качалке при частоте оборотов платформы 170-190 об/мин и температуре 37 °С в течение 14-15 час в колбе
Эрленмейера на 250 мл, содержащей 50 мл питательной среды. За ростом биомассы бактерий следят турбодиметрически (600 нм), используя соответствующую калибровочную
кривую. По окончании культивирования клетки осаждают центрифугированием при
7000 g в течение 10 мин, дважды отмывают от питательной среды 0,15 М раствором NaCl
и разрушают ультразвуком. Для этого суспензию (100 мл) клеток (3,6 % по сухой биомассе) в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7,0), содержащем 0,15 % NaCl, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов UDM-10 (фирма "Techpan" Польша) при
мощности 0,5 кВт в течение 3-5 мин. Остатки разрушенных клеток осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 15000 g.
Активность НФТ в ультразвуковом лизате клеток определяли по скорости синтеза
АМФ из аденозина при использовании в качестве донора фосфата n-НФФ. Стандартная
реакционная смесь (1 мл) содержала (мМ): аденозин - 30, n-НФФ -60, Na-ацетатный буфер
3
BY 11916 C1 2009.06.30
(рН 4,5) - 0,1 и 0,1 мл ультразвукового лизата клеток. Смесь инкубировали при 45 °С при
перемешивании на магнитной мешалке. Ход реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии сначала в системе: хлороформ - 96 % этанол (4:1), затем в системе: изо-пропанол - вода - 25 %-ный аммиак (7:2:2).
За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое обеспечивает образование АМФ в количестве 1 нмоль за 1 мин в указанных выше условиях реакции.
Активность штамма Escherichia coli НФТ 15 в сравнении с другими штаммами микроорганизмов представлена в таблице.
Сравнение активности предлагаемого и известных штаммов микроорганизмов
Активность НФТ
Источник инфорШтамм
мации
ед./мг клеток
отн. %
Escherichia coli НФТ 15
Предлагаемое
2200
100
решение
Erwinia herbicola 47/3
9,8
0,4
[3]
Escherichia coli NPT5
1072
48,7
[4]
Escherichia coli JM109[pPRP 100]
1750
79,5
[5]
Из данных таблицы следует, что эффективность штамма Escherichia coli НФТ15 значительно выше любого из известных штаммов-продуцентов НФТ.
Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения НФТ.
Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.
Пример 1
Культивирование Escherichia coli НФТ15 в оптимальных условиях.
Культивирование Escherichia coli НФТ15 проводят в колбе Эрленмейера объемом
250 мл на термостатируемой биологической качалке с частотой колебания платформы
170-190 об/мин при температуре 37 °С в течение 15 ч. Питательная среда (50 мл) для выращивания приготовляется на водопроводной воде и имеет следующий состав (%): триптон - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl - 1,0 (рН 7,0). Стерилизацию среды
осуществляют горячим паром под давлением в режиме 0,5 ати, 15 минут.
По окончании выращивания клетки осаждают центрифугированием при 7000 g в течение 10 мин, дважды отмывают от питательной среды 0,15 М раствором NaCl и разрушают
ультразвуком. Для этого клетки суспендируют в 50 мл 50 мМ Трис-НС1-буфера (рН 7,0),
содержащего 0,15 % NaCl, и обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов UDM-10 фирмы Techpan (Польша) при мощности 0,5 кВт в течение 3-5 мин. Остатки разрушенных клеток осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 15000 g.
Полученный супернатант используют в качестве источника НФТ. Активность НФТ, определенная, как описано выше, составляет 2200 ед./мг клеток.
Пример 2
Получение сухого препарата НФТ.
Влажные клетки (10 г) Escherichia coli НФТ15, полученные в условиях примера 1, суспендируют в 20 мл Трис-НС1-буфера (рН 7,0), содержащем 0,15 % NaCl, и разрушают
ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов UDM-10 фирмы Techpan (Польша) при
мощности 0,5 кВт в течение 3-5 мин. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 10000 g и
получают супернатант с содержанием фермента до 10 % от суммарного белка клетки. К
охлажденному супернатанту приливают тонкой струйкой при перемешивании охлажденный до -18 °С ацетон до 60 % от конечного объема. После формирования осадка при 4 °С
в течение 30 мин, его осаждают центрифугированием при 5000 g (5 мин), высушивают под
4
BY 11916 C1 2009.06.30
вакуумом и растирают в фарфоровой ступке. Получают 0,2 г тонко дисперсного порошка
с активностью 15000 ед./мг препарата.
НФТ в составе сухого препарата может храниться при 4-6 °С (бытовой холодильник)
без существенной потери активности не менее 1 года.
Пример 3
Использование НФТ, продуцируемой штаммом Escherichia coli НФТ 15, для синтеза
противовирусного нуклеотида - аденинарабинозид-5'-монофосфата.
НФТ в количестве 26000 ед., полученную, как в примере 1, вносят в реакционную
смесь (конечный объем 0,2 л), содержащую (мМ): аденинарабинозид - 10, n-нитрофенилфосфат - 30, Na-ацетатный буфер (рН 4,75) - 100, а также 1 % полиэтиленгликоль-6000,
инкубируют при 45 °С в течение 4 ч. В этих условиях выход реакции достигает 5055 мол. % в расчете на исходный аденинарабинозид.
Целевой продукт выделяют из реакционной смеси путем ионообменной хроматографии на колонке со смолой Dowex 1X2 в Cl--форме (25×140 мм). Непрореагировавший аденинарабинозид элюируют водой, а аденинарабинозид-5'-монофосфат-20 мМ HCl. Элюаты
продуктов выпаривают досуха на роторном испарителе при 30 °С. Осадки промывают охлажденным ацетоном и высушивают под вакуумом. Получают 0,33 г хроматографически
чистого аденинарабинозид-5'-монофосфата (в расчете на кислоту) и 0,26 г возвращенного
из реакции аденинарабинозида. Таким образом, выход аденинарабинозид-5'-монофосфата
в расчете на затраченный аденинарабинозид составляет 94 мол. %.
Структура целевого продукта подтверждена сравнением его хроматографической подвижности, а также УФ-спектра с соответствующими характеристиками заведомо известного образца. В частности, при хроматографировании на тонкослойных пластинках
"Silufol UV-254" фирмы Serva (Германия) в системе растворителей изо-пропанол-водааммиак (7:2:2) подвижность целевого продукта совпадала с Rf заведомо известного образца аденинарабинозид-5'-монофосфата. УФ-спектр (рН 7), λ нм (ε): 259 макс (14800); (рН
13), λ нм (ε): 260 макс (15600).
Таким образом, получен штамм, обладающий по сравнению с известным штаммомпродуцентом НФТ значительно более высокой продуктивностью (2200 ед. акт./мг клеток
против 1072 ед. акт./мг клеток).
Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов-продуцентов НФТ.
Источники информации:
1. Barai V.N., Kvach S.V., Zinchenko A.I., Mikhailopulo I.A. An improved method for the
enzymatic transformation of nucleosides into 5'-monophosphates // Biotechnol. Lett. - 2004. Vol. 26, № 24. - P. 1847-1850.
2. Birichevskaya L.L., Kvach S.V., Sivets G.G., Kalinichenko E.N., Zinchenko A.I., Mikhailopulo LA. A comparison of enzymatic phosphorylation and phosphatidylation of β-L- and βD-nucleosides // Biotechnol. Lett. - 2007. - Vol. 29, № 4. - P. 585-591.
3. Квач С.В., Барай В.Н., Зинченко А.И. Влияние некоторых факторов на продуцирование нуклеозидфосфотрансферазы Erwinia herbicola 47/3 // Матер. международ. конф.
"Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии",
Минск, 26-28 мая 2004. - С. 74-76.
4. Квач С.В., Шахбазов А.В., Ярмолинский Д.Г., Картель Н.А., Зинченко А.И. Получение рекомбинантной нуклеозидфосфотрансферазы Erwinia herbicola и ее применение для
синтеза аденинарабинозид-5'-монофосфата // Доклады НАН Беларуси. - 2006. - Т. 50, № 2.
- С. 59-63.
5. Mihara Y., Utagawa Т., Yamada H., Asano Y. Acid phosphatase/phosphotransferases
from enteric bacteria // J. Biosci. Bioeng. - 2001. - Vol. 92, № 1. - P. 50-54.
5
BY 11916 C1 2009.06.30
6. Sambrook J., Frittsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual.- 2-nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989-2222 p.
7. Riccio M.L., Rossolini G.M., Lombardi G., Chiesurin A., Satta G. Expression cloning of
different bacterial phosphatase-encoding genes by histochemical screening of genomic libraries
onto an indicator medium containing phenolphthalein diphosphate and methyl green // J. Appl.
Microbiol. - 1997. - Vol. 82, № 2. P. - 177-185.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
104 Кб
Теги
by11916, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа