close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11933

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 11933
(13) C1
(19)
(46) 2009.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
C 07C 15/00
A 61P 31/00
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СРЕДСТВО ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ВИЧ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
(21) Номер заявки: a 20070915
(22) 2007.07.18
(43) 2008.02.28
(71) Заявители: Белорусский государственный университет; Учреждение
Белорусского государственного университета "Научно-исследовательский институт физико-химических
проблем"; Государственное учреждение "Научно-исследовательский
институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь (BY)
(72) Авторы: Гасич Елена Леонидовна;
Еремин Владимир Федорович; Ксендзова Галина Анатольевна; Полозов
Генрих Иванович; Сорокин Виктор
Леонидович; Шадыро Олег Иосифович (BY)
(73) Патентообладатели: Белорусский государственный университет; Учреждение
Белорусского государственного университета "Научно-исследовательский
институт физико-химических проблем";
Государственное учреждение "Научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения Республики
Беларусь (BY)
(56) BY 7678 C1, 2006.
BY 5327 C1, 2003.
BY 7675 C1, 2006.
BY 4767 C1, 2002.
BY 11933 C1 2009.06.30
(57)
Применение N-(3,5-ди-трет-бутил-2-гидроксифенил)-4-метилбензолсульфонамида формулы
OH
NH SO2
CH3
для подавления ВИЧ в культуре клеток.
Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и касается средств, обладающих активностью против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), этиологического
агента ВИЧ-инфекции и ее последней стадии СПИДа (синдром приобретенного иммунного дефицита).
В настоящее время основной стратегией лечения ВИЧ-инфекции (СПИДа) является
комбинированное применение этиотропных лекарственных средств, подавляющих репликацию вируса иммунодефицита человека [1]. Однако высокая стоимость этиотропной терапии (до 10 тыс. USD в год) делает ее труднодоступной.
BY 11933 C1 2009.06.30
Известно использование N-(3,5-ди-трет-бутил-2-гидроксифенил)-4-метилбензолсульфонамида в качестве промежуточного продукта для получения катализатора при полимеризации олефинов [2].
Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих активностью против ВИЧ-инфекции (СПИДа).
Поставленная задача достигается применением ранее известного соединения N-(3,5-дитрет-бутил-2-гидроксифенил)-4-метилбензолсульфонамида
OH
NH SO2
CH3
для подавления ВИЧ в культуре клеток.
Авторами обнаружены неочевидные свойства, позволяющие применить его для подавления ВИЧ-инфекции в культуре клеток.
Сущность изобретения иллюстрируется примерами.
Пример 1
Определение максимально переносимой концентрации (МПК) заявляемого вещества в
культуре клеток CEMSS.
Клетки выращивали в среде роста RPMI 1640 (без фенолового красного), содержащей
10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 0,02 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл тилозина. Заявляемое вещество в концентрации 10 мг/мл растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и
затем добавляли чистую среду RPMI 1640 (конечная концентрация ДMCO - 10 %). В лунки 96-луночных планшетов разливали по 100 мкл готовой среды роста RPMI 1640 и добавляли заявляемое вещество в исходной концентрации 10 мг/мл. После этого проводили
титрование заявляемого вещества 4-кратным шагом (1/4; 1/16; 1/64; 1/256 и т.д.). После
раститровки заявляемого вещества во все лунки были добавлены клетки CEMSS в концентрации 300 тыс. кл/мл. В нечетные ряды планшета добавляется вирус в рабочем разведении
(определение протективных свойств вещества), в четных рядах вируса нет (определение
токсического действия вещества). Все исследования проводили в дубликатах (по 2 лунки
для определения каждого параметра). 6 лунок остаются с клетками - контроль клеток, а в
другие 6 лунок добавляется вирус в рабочем разведении - контроль вируса. Планшеты помещают к термостат при 37 °С с 5 % СО2 на 5 суток. По истечении указанного времени во
все лунки планшета добавляется МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (Sigma, USA) в концентрации 7,5 мг/мл, планшеты оставляют на 4 часа в термостате при 37 °С. По истечении указанного времени во все лунки добавляли растворитель
(ДМСО), выдерживали 10 минут, покачивая планшет, после чего проводили учет с помощью спектрофотометра-ридера при длине волны 540-690 нм.
Оптимальная концентрация МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (Sigma, USA) составила 7,5 мг/мл.
Ингибирующая концентрация (IС50) рассчитывалась по формуле
(ОПп + в) − (ОПкв)
× 100
(ОПкк) − (ОПкв)
где ОПп + в - оптическая плотность в лунке с препаратом и вирусом;
ОПкв - оптическая плотность в лунке с контролем вируса (без препарата);
ОПкк - оптическая плотность в лунке с чистыми клетками без вируса и без препарата.
Результаты исследований представлены в таблице.
2
BY 11933 C1 2009.06.30
Определение анти-ВИЧ активности заявляемого соединения
Концентрация препарата,
% инфицированных
% защиты
мкг/мл
клеток
1
1/64
234,0
88,0
12
2
1/256
59,0
69,4
27
3
1/1024
14,6
61,0
32
4
1/4096
3,7
55,5
41
Разведение 1/32 можно рассматривать как максимально токсическую концентрацию.
IC50 препарата составила 3,7 мкг/мл, а химиотерапевтический индекс (ХТИ) равнялся 128.
Пример 2
Определение специфической активности вещества (оценка инфицированных клеток).
Клетки CЕMSS выращивали в среде роста RPMI 1640 (без фенолового красного), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 0,02 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл тилозина. Вещество в концентрации 10 мг/мл растворяли в ДМСО и затем добавляли
чистую среду RPMI 1640 (конечная концентрация ДМСО - 10 %). В лунки 96-луночных
планшетов разливали по 100 мкл готовой среды роста RPMI 1640 и добавляли вещество в
исходной концентрации 10 мг/мл. После этого проводили титрование исследуемого вещества 4-кратным шагом (1/4; 1/16; 1/64; 1/256 и т.д.). После раститровки вещества во все
лунки были добавлены клетки CEMSS в концентрации 300 тыс. кл/мл. В нечетные ряды
планшета добавляется вирус в рабочем разведении, в четных рядах вируса нет. Все параметры определялись в трех лунках. 6 лунок остаются с клетками - контроль клеток, а в
другие 6 лунок добавляется вирус в рабочем разведении - контроль вируса. Планшеты помещают в термостат при 37 °С с 5 % СО2 на 5 суток. По истечении указанного времени
культуральную жидкость из лунок забирали, переносили в пластиковые пробирки объемом 0,5 мл и клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 7 минут.
По истечении указанного времени супернатант культуральной жидкости удаляли, а оставшиеся клетки суспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с pH 7,2-7,4. Процедуру отмывки в ФСБ повторяли дважды при 1000 об/мин 7 минут. После последней
отмывки клетки суспендировали в 100 мкл ФСБ и наносили в объеме 70 мкл в лунки
предметных стекол. Клетки высушивали на воздухе, после чего фиксировали в охлажденном при - 20 °С ацетоне. Затем к зафиксированным на предметном стекле клеткам добавляли иммунную сыворотку, содержащую антитела к ВИЧ в рабочем разведении, и смесь
инкубировали во влажной камере при 37 °С в течение 30 минут.
По истечении указанного времени клетки отмывали трижды в ФСБ, после чего в каждую
лунку с клетками добавляли антивидовые антитела (против иммуноглобулинов человека,
НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва, Россия), меченые флюоресциинизотиоцианатом
(ФИТЦ), и инкубировали во влажной камере при 37 °С в течение 30 минут. По истечении
указанного времени клетки трижды отмывали ФСБ от несвязавшегося ФИТЦ, подсушивали и исследовали с помощью люминесцентного микроскопа в водной иммерсии. Оценку
инфицированных клеток проводили на 100 исследованных. В инфицированных клетках
наблюдали изумрудно-зеленое свечение оболочки.
Результаты исследований также представлены в таблице.
Из представленных в примерах и таблице данных видно, что заявляемое вещество подавляет ВИЧ в культуре клеток.
№ п /п
Разведение
3
BY 11933 C1 2009.06.30
Источники информации:
1. Schutz M., Wendrow S. Guick reference guideto antiretrovirals//Madscape Wed Site. - Junuary 3, 2002. - P. 3.
2. Патент США 6063790, МПК А 61Р 31/18; 2000 Diarylsulfone non-nucleoside reverse
transcriptase inhibitors of human immunodeficiency virus.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
83 Кб
Теги
by11933, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа