close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY11953

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11953
(13) C1
(19)
G 01N 33/50
C 12Q 1/00
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
γ- ИЛИ β-СУБЪЕДИНИЦЫ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ
(21) Номер заявки: a 20061234
(22) 2006.12.07
(43) 2008.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт физиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Никандров Виталий Николаевич; Пыжова Нелли Семеновна
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) НИКАНДРОВ В.Н. и др. Труды Всероссийской конференции. Проблемы
медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия. - М. - 2002. С. 163-164.
SU 1246008 А1, 1986.
UA 37647 С2, 2004.
BY 1047 C1, 1996.
BY 11953 C1 2009.06.30
(57)
Способ определения протеолитической активности γ- или β-субъединицы фактора
роста нервов, отличающийся тем, что исследуемую субъединицу фактора роста нервов
добавляют к протамин-сульфату в концентрации 1-2 %, инкубируют при температуре
37 °С в течение 2-24 часов и проводят определение протеолитической активности по доле
расщепленного белка.
Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к оценке ферментативной
активности субъединиц фактора роста нервов. Известен способ определения протеолитической активности субъединиц фактора роста нервов для общебиологических исследований, а также для прикладных целей: для оценки их качества, создания (или изыскания)
прежде всего специфических эффекторов: ингибиторов и активаторов, миметиков фактора
роста нервов, заключающийся в том, что очищенные образцы γ- и β-субъединиц фактора
роста нервов добавляют к содержащей плазминоген фибриновой пластине, инкубируют ее
в термостате при 37 °С в течение 2-24 ч и учитывают протеолитическую активность по
степени расщепления белка субстрата, в данном случае измеряют площадь зон лизиса
фибрина, обусловленного действием на субстрат активного протеолитического фермента плазмина, образовавшегося под действием γ- и β-субъединиц фактора роста нервов из содержащегося в фибрине плазминогена [1].
Указанный способ является прототипом в отношении заявляемому.
Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является добавление исследуемых образцов γ- и β-субъединиц фактора роста нервов к белковому субстрату, инкубация при температуре 37 °С и определение меры расщепления белкового субстрата. Однако
недостатком прототипа является непрямое, опосредованное через активацию плазминоге-
BY 11953 C1 2009.06.30
на определение протеолитической активности. Именно плазмин, а не γ- и β-субъединицы
фактора роста нервов расщепляют фибрин. Из источников научно-технической литературы известно, что γ- и β-субъединицы фактора роста нервов, а также олигомерная форма
фактора роста нервов не способны расщеплять белковые субстраты, которые обычно используют для определения протеолитической активности: фибрин, казеин, гемоглобин [2].
Задачей заявляемого способа является повышение точности и специфичности оценки
протеолитической активности γ- и β-субъединиц фактора роста нервов. Поставленная задача достигается следующим образом.
Предложен способ определения протеолитической активности γ- или β-субъединиц
фактора роста нервов, когда исследуемую субъединицу фактора роста нервов добавляют
к протамин-сульфату в концентрации 1-2 %, инкубируют при температуре 37 °С в течение 2-24 ч и проводят определение протеолитической активности по доле расщепленного белка.
Использование в качестве белкового субстрата протамин-сульфата позволяет оценить
собственную, т.е. прямую протеолитическую активность γ- и β-субъединиц фактора роста
нервов, так как протамин-сульфат расщепляется этими субъединицами непосредственно
без участия образованного из плазминогена плазмина.
Пример 1.
Определение активности в пробирке.
В две пробирки, опытную и контрольную, вносят по 1,0 мл 1 %-ного раствора протамин-сульфата в 0,06 М фосфатном буфере рН 7,4. В опытную пробирку добавляют 0,1 мл
раствора (1,28 мг/мл) γ- субъединицы фактора роста нервов в этом же буфере. Обе пробирки инкубируют при 37 °С в течение 2 ч. Затем в обе пробирки вносят по 2,0 мл 2 н раствора трихлоруксусной кислоты, а в контрольную - дополнительно 0,1 мл γ- субъединицы
фактора роста нервов. Пробирки выдерживают в течение 20 мин при 4 °С и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин. Супернатанты сливают, а осадки растворяют в
аликтвотах по 0,5 мл 0,06 M фосфатного буфера pH 7,4. Отбирают по 50 мкл полученных
растворов осадков и определяют содержание белка по Бредфорд [3].
Содержание белка в опытной пробе соответствует 0,17 мг/мл, а в контрольной пробе 1,65 мг/мл. Следовательно за 60 мин при температуре 37 °С и рН 7,4 0,128 мг γ- субъединицы фактора роста нервов расщепляет 1,48 мг протамин-сульфата.
Пример 2.
Определение активности в тонком слое.
На пластину 1 %-ого агара "Difco", приготовленную на 0,06 М фосфатном буфере рН
7,4 и содержащую протамин-сульфат в концентрации 2 % наносят по 15 мкл микродозатором 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4 (контроль) и растворы β-субъединицы фактора
роста нервов при концентрации 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл. Затем инкубируют белок-агаровую
пластину с нанесенными на поверхность образцами при 37 °С в течение 24 ч. Затем обрабатывают пластину 2 н раствором трихлоруксусной кислоты и измеряют площадь зон
расщепления белкового субстрата. Эта площадь у контроля (фосфатного буфера) равна 0
мм2, она соответствует 192 мм2 при концентрации субъединицы 0,5 мг/мл и 105 мм2 при
концентрации исследуемой субъединицы 0,25 мг/мл.
Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ
позволяет определить прямую протеолитическую активность γ- и β-субъединиц фактора
роста нервов, исключив промежуточную реакцию превращения плазминогена в активную
протеиназу - плазмин, использовать стандартный белок субстрат, промышленное получение которого налажено целым рядом фирм. Этот протамин-сульфат дольше хранится без
изменения свойств и более стандартен. Данный способ может найти широкое применение
при создании (изыскании) специфических эффекторов фактора роста нервов и его миметиков.
2
BY 11953 C1 2009.06.30
Источники информации:
1. Никандров В.Н., Пыжова Н.С. Энзиматические свойства фактора роста нервов и его
субъединиц//В кн.: "Труды Всероссийской конфер. "Проблемы медицинск. энзимологии",
"Соврем. Технологии лаборат. диагностики нового столетия", "Международ. Сим-поз.",
"Пиридоксальфосфатзависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина". - М., 2002. - С. 163-164 (прототип).
2. Thomas K.A., Bradshaw R.A. γ-subunit of mouse submaxillary gland 7S nerve growth
factor: an endopeptidase of the serine family // Methods Enzymol. - 1981. - Vol. 80. - P. 618.
3. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quiantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein dye biding // Anal. Biochem. - 1976. - Vol. 72. P. 248-254.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
73 Кб
Теги
by11953, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа