close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12018

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 12018
(13) C1
(19)
(46) 2009.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
G 01N 33/68
G 01N 30/00
C 12N 9/66
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
БИОСЕЛЕКТИВНЫЙ СОРБЕНТ ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО
ВЫДЕЛЕНИЯ ЭЛАСТАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ЖИДКОСТЕЙ
(21) Номер заявки: a 20070651
(22) 2007.05.29
(43) 2008.12.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Голубович Владимир Петрович; Чемитова Лилия Михайловна; Поликарпова Валентина Ивановна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) ГОЛУБОВИЧ В.П. и др. Биорегуляторы: исследование и применение:
Сб. науч. тр. - Минск, 2004. - С. 200-209.
JP 58101692 A, 1983.
JP 58183093 A, 1983.
EP 0864864 A1, 1998.
(57)
Биоселективный сорбент для избирательного выделения эластаз из различных биологических жидкостей, имеющий общую формулу
O
NH2
C
CH2
CH
n
CH2
CH
C
m
O
NH
BY 12018 C1 2009.06.30
CH
C
CH3
CH
O OH
NH
NH2+Cl-
CH
C
(CH2)3
CH
C
C
,
CH3
CH
O CH3
NH
CH
C
NH2
O
NH
NH
CH3
CH
O CH3
OH
где n - число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации тетрапептидных лигандов, которое имеет значение от 1 до 70;
m - число участков цепи с лигандом, имеющее значение 50-10000.
BY 12018 C1 2009.06.30
Изобретение относится к области биоорганической химии и медицины и может быть
использовано для избирательного выделения эластаз из различных биологических жидкостей, в том числе из плазмы крови больных с различными воспалительными заболеваниями.
Протеолитический фермент эластаза вовлечен в развитие многих воспалительных процессов, таких как: эмфизема; артриты; хронический бронхит; хронический и острый панкреатиты; новообразование (рак) поджелудочной железы и др. [1].
Известен сорбент OVOSORB [2, 3], содержащий в качестве лиганда ковалентно пришитый белок овомукоид, обладающий ингибиторной активностью по отношению к ряду
протеолитических ферментов. Недостаток данного сорбента заключается в том, что он позволяет выделять из биологической жидкости все присутствующие в ней протеолитические ферменты и не является специфичным по отношению к эластазе.
Задачей данного изобретения является получение нового биоселективного сорбента
для избирательной сорбции эластаз из различных биологических жидкостей. Для решения
данной задачи в качестве полимера-матрицы используют полиакриламидный гель, а в качестве биоселективного лиганда-ингибитора - тетрапептид Thr-Arg-Val-Val-OH при следующем соотношении компонентов (мас. %): полиакриламид - от 5 до 10, Thr-Arg-ValVal-OH-от 0,1 до 0,4.
Сорбент имеет следующую химическую формулу:
O
NH2
C
CH2
CH
n
CH2
CH
C
m
O
NH
CH
C
CH3
CH
O OH
NH
NH2+Cl-
CH
C
(CH2)3
CH
C
C
,
CH3
CH
O CH3
NH
CH
C
NH2
O
NH
NH
CH3
CH
O CH3
OH
где n - число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации тетрапептидных лигандов, которое имеет значение от 1 до 70,
m - число участков цепи с лигандом, имеющее значение 50-10000.
Выбор полиакриламидной матрицы обусловлен ее стабильностью, биологической
инертностью, возможностью введения лиганда на стадии полимеризации. Для превращения вводимого в качестве лиганда пептида Thr-Arg-Val-Val-OH в мономер проводят его
ацилирование акрилоилхлоридом. Полученное производное используют как мономер при
сополимеризации акриламида, N,N'-метиленбисакриламида в присутствии персульфата
аммония и N,N,N,N'-тетраметилендиамина в качестве инициаторов полимеризации.
Получение заявляемого сорбента приведено в примере 1.
2
BY 12018 C1 2009.06.30
Пример 1.
К раствору 0,033 г (0,06 ммоль) дигидрохлорида треонил-аргинил-валил-валина в 5 мл
2 % раствора бикарбоната натрия по каплям прибавляют 0,008 мл (0,09 ммоль) акрилоилхлорида и перемешивают реакционную смесь в течение 30 мин, затем фильтруют. В реакционный сосуд вносят 0,342 г акриламида и 0,036 г N,N'-метиленбисакриламида. После
растворения компонентов к реакционной смеси прибавляют 0,015 г персульфата аммония
и 0,01 мл N,N,N',N'-тетраметилендиамина. Через 1-3 мин образуется прозрачный гель.
Гель оставляют на 30 мин, затем измельчают с использованием шприца с диаметром выходного отверстия 2 мм. Опалесцирующие гранулы сперва многократно промывают дистиллированной водой (общий объем 0,5 л), а затем 0,9 % раствором NaCl (общий объем
0,3 л). Содержание треонил-аргинил-валил-валина в набухшем геле составляет 1-2 мг/мл.
Отмытый гель хранят в 0,9 % растворе NaCl в холодильнике.
Сорбционная избирательность заявляемого сорбента подтверждается сорбционными
характеристиками, приведенными в примерах 2 и 3.
Пример 2.
Исследования проводят на приборе SPECORD UV VIS.
Используют водную суспензию панкреатической эластазы свиньи Sigma (США).
Гель, содержащий треонил-аргинил-валил-валиновый лиганд (5 мл), промывают буферным раствором Трис-HCl (рН 8,0) (общий объем 5 мл). К набухшему гелю прибавляют
5 мл буферного раствора Трис-HCl (рН 8,0), содержащего 0,4 мл водной суспензии эластазы с концентрацией 2⋅10-5 моль/л. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной
температуре.
Для определения оптической плотности холостого образца, т.е. до сорбции, в опытную кювету вносят 2,7 мл буферного раствора Трис-НСl (рН 8,0), 0,1 мл водной суспензии
эластазы (С 2⋅10-5 моль/л) и 0,2 мл субстрата Boc-Glu(OBu)-Pro-Nva-pNA (С 1⋅10-3 моль/л).
В кювету сравнения перед субстратом вносят 0,15 мл ледяной уксусной кислоты.
Для определения оптической плотности после сорбции в опытную кювету вносят
2,8 мл раствора после отфильтровывания сорбента и 0,2 мл субстрата Boc-Glu(OBu)-ProNva-pNA (С 1⋅10-3 моль/л). Кювета сравнения, как в опыте с холостым образцом.
Результаты исследований показали, что на полиакриламидной матрице, содержащей
треонил-аргинил-валил-валиновый лиганд, адсорбировалось 80 % эластазы, что свидетельствует о высокой сорбционной способности заявляемого сорбента по отношению к
протеолитическому ферменту эластазе.
Методика выделения адсорбированной эластазы приведена в примере 3.
Пример 3.
Исследования проводят на приборе SPECORD UV VIS.
Десорбцию эластазы с полимерной матрицы проводят последовательно с помощью: 1)
0,05 М раствора Трис-HCl (рН 3,2, 5-8 мл); 2) 0,1 М раствора Трис-HCl (рН 8,0, 8-10 мл);
3) 1,0 М раствора Трис-HCl (рН 8,0, 8-10 мл).
Для определения оптической плотности после десорбции эластазы с полимерного носителя в опытную кювету вносят 2,8 мл промывного раствора, прошедшего через сорбент,
и 0,2 мл субстрата Boc-Glu(OBu)-Pro-Nva-pNA (С 1⋅10-3 моль/л). В кювету сравнения вносят 2,7 мл буферного раствора Трис-HCl (рН 8,0), 0,1 мл водной суспензии эластазы (С
2⋅10-5 моль/л), 0,15 мл ледяной уксусной кислоты и 0,2 мл субстрата Boc-Glu(OBu)-ProNva-pNA (С 1⋅10-3 моль/л).
По результатам исследований 40 % эластазы десорбировалось с полиакриламидной
матрицы, содержащей тетрапептидный лиганд-ингибитор, что свидетельствует о возможности выделения эластазы с помощью заявляемого сорбента.
3
BY 12018 C1 2009.06.30
Источники информации:
1. Janoff A. Elastase in tissue injury. // Ann. Rev. Med. - 1985. - Vol. 36. - P. 207-216.
2. Кирковский, В.В. Детоксикационная терапия при перитоните. - Минск: ПолифактАльфа, 1997. - С. 200.
3. Голубович В.П. и др. Биоаффиные сорбенты для применения в эфферентных методах
лечения (гемосорбции). Биорегуляторы: исследование и применение: Сб.науч.тр. ИБОХ
НАН Беларуси. - Минск, 2003. - С. 200-209.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
75 Кб
Теги
by12018, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа