close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12059

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 7/00
C 12N 5/10
A 61K 39/275
A 61P 31/00
ИЗМЕНЕННЫЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ВИРУС
КОРОВЬЕЙ ОСПЫ АНКАРА
(21) Номер заявки: a 20020748
(22) 2001.03.10
(31) PA 2000 00410 (32) 2000.03.14 (33) DK
(85) 2002.10.14
(86) PCT/EP01/02703, 2001.03.10
(87) WO 01/68820, 2001.09.20
(43) 2003.03.30
BY 12059 C1 2009.06.30
BY (11) 12059
(13) C1
(19)
(71) Заявитель: Бавариан Нордик А/С (DK)
(72) Авторы: МАЙЕР, Антон (DE)
(73) Патентообладатель: Бавариан Нордик
А/С (DK)
(56) WO 97/02355 A1.
(57)
1. Модифицированный вирус коровьей оспы Анкара, адаптированный к выращиванию
в клетках клеточной линии Vero (Vero-MVA), для иммунизации млекопитающего, включая человека, полученный путем выращивания модифицированного вируса коровьей оспы
Анкара (MVA) в клетках клеточной линии Vero.
2. Vero-MVA по п. 1, отличающийся тем, что адаптирован к выращиванию в клетках
клеточной линии Vero, депонированной в АТСС под номером CCL-81.
3. Vero-MVA по п. 2, отличающийся тем, что представляет собой штамм вируса, депонированный в ЕСАСС под номером 99101431.
4. Vero-MVA по п. 2, отличающийся тем, что представляет собой штамм вируса, депонированный в ЕСАСС под номером 01021411.
5. Vero-MVA по любому из пп. 1-4, геном которого рекомбинирован с, по меньшей
мере, одним гетерологичным геному MVA участком последовательности, кодирующим
терапевтический белок или антигенную детерминанту.
6. Клетка-хозяин, инфицированная Vero-MVA по любому из пп. 1-5.
7. Фармацевтическая композиция для иммунизации против ортопокс-инфекции, содержащая в качестве активного ингредиента Vero-MVA по любому из пп. 1-5 или геном
указанного вируса и фармацевтически приемлемый носитель.
8. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что применяется для иммунизации млекопитающего, включая человека.
9. Композиция по п. 7 или 8, отличающаяся тем, что применяется для иммунизации
кошки против кошачьей покс-инфекции, мыши против инфекции эктромелия или верблюда
против верблюжьей покс-инфекции.
10. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что обладает активностью активатора,
супрессора или стабилизатора в отношении иммунной системы.
11. Фармацевтическая композиция для применения в качестве адъюванта, содержащая
в качестве активного ингредиента Vero-MVA по любому из пп. 1-5 или геном указанного
вируса и фармацевтически приемлемый носитель.
BY 12059 C1 2009.06.30
12. Фармацевтическая композиция для применения в генной терапии, содержащая в
качестве активного ингредиента Vero-MVA по п. 5 или геном указанного вируса и фармацевтически приемлемый носитель.
13. Способ введения генома Vero-MVA по п. 5 в клетку-хозяин, включающий инфицирование клетки-хозяина Vero-MVA по п. 5 или трансфекцию клетки-хозяина геномом
указанного вируса.
14. Способ получения Vero-MVA по любому из пп. 1-4, включающий стадии:
а) инфицирование MVA клеток клеточной линии Vero, предпочтительно MVA, депонированным в ECACC под номером V94012707;
b) сбор вирусов, продуцированных клетками, инфицированными согласно стадии (а);
c) инфицирование свежих клеток клеточной линии Vero вирусами, полученными согласно стадии (b), и, необязательно,
d) повторение стадии (c).
15. Способ получения Vero-MVA по любому из пп. 1-5, включающий стадии:
а) культивирование клеток клеточной линии, подходящей для репликации Vero-MVA
по любому из пп. 1-5;
b) инфицирование клеток, полученных согласно стадии (а), Vero-MVA по любому из
пп. 1-5;
c) сбор вирусов, продуцированных клетками, инфицированными согласно стадии (b).
16. Способ получения генома Vero-MVA по п. 5 или пептида и/или полипептида, кодируемого указанным геномом, включающий стадии:
а) инфицирование клетки-хозяина Vero-MVA по п. 5;
b) культивирование клетки-хозяина, инфицированной согласно стадии (а);
c) выделение генома из вируса, продуцированного клеткой-хозяином, культивированной согласно стадии (b), и, необязательно,
d) получение пептида и/или полипептида, кодируемого геномом, выделенным согласно стадии (с).
17. Применение Vero-MVA по любому из пп. 1-5 для получения фармацевтической
композиции для иммунизации против заболевания, вызываемого чувствительным к иммунизации вирусом.
18. Применение по п. 17, отличающееся тем, что предназначено для получения вакцины для иммунизации млекопитающего, включая человека.
19. Применение Vero-MVA по любому из пп. 1-5 для получения активатора, супрессора или стабилизатора иммунной системы.
20. Применение Vero-MVA по любому из пп. 1-5 для получения адъюванта.
21. Применение Vero-MVA по любому из пп. 1-5 в качестве вакцины.
22. Применение Vero-MVA по любому из пп. 1-5 в качестве адъюванта.
23. Применение Vero-MVA по любому из пп. 1-5 в качестве активатора, супрессора
или стабилизатора иммунной системы.
24. Способ иммунизации млекопитающего, включая человека, заключающийся в том,
что вводят млекопитающему терапевтически эффективное количество композиции по любому из пп. 7-9.
25. Способ активации, супрессии или стабилизации иммунной системы млекопитающего, включая человека, заключающийся в том, что вводят млекопитающему терапевтически эффективное количество композиции по п. 10.
26. Способ усиления иммунной реакции у млекопитающего, включая человека, против
антигенной детерминанты вакцины, заключающийся в том, что вводят млекопитающему
терапевтически эффективное количество композиции по п. 11.
27. Vero-MVA по любому из пп. 1-4, полученный способом, включающим стадии:
а) инфицирование MVA клеток клеточной линии Vero, предпочтительно MVA, депонированным в ECACC под номером V94012707;
2
BY 12059 C1 2009.06.30
b) сбор вирусов, продуцированных клетками, инфицированными согласно стадии (а),
и, необязательно,
c) инфицирование свежих клеток клеточной линии Vero вирусами, полученными согласно стадии (b), и, необязательно,
d) повторение стадии (c).
Настоящее изобретение относится к новым штаммам модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA), адаптированным к выращиванию в клетках клеточной линии,
одобренной для получения терапевтического средства, такого как вакцина, в частности в
клетках клеточной линии Vero. Изобретение также относится к способу получения указанного модифицированного вируса. Новый штамм модифицированного вируса, согласно
изобретению, может использоваться, например, для парентеральной иммунизации, в качестве векторной системы, или в активной или инактивированной форме в качестве адъюванта или в качестве регулятора неспецифических компонентов иммунной системы.
Организм постоянно провоцируется инфекционными агентами, подобными бактериям, вирусам, грибкам или паразитам. Иммунная система оберегает организм от постоянных инфекций, вызываемых этими агентами, путем уничтожения и удаления этих
инфекционных агентов и любых продуцируемых ими токсичных молекул. Иммунную
систему можно разделить на специфическую и неспецифическую части, хотя обе части
тесно переплетены. Неспецифический иммунный ответ вызывает немедленную защиту против широкого ряда чужеродных веществ и инфекционных агентов. В отличие от него специфический иммунный ответ возрастает после лаг-фазы, когда организм провоцируется
веществом впервые. Однако специфический иммунный ответ высоко эффективен. Специфический иммунный ответ ответственен за такое явление, что индивидуум, выздоровевший после специфической инфекции, является защищенным против этой специфической
инфекции, но по-прежнему восприимчив к другим инфекционным болезням. В общих
чертах, второе инфицирование таким же или очень похожим инфекционным агентом вызывает очень слабые симптомы или не вызывает симптомов вообще. Иммунитет удерживается долгое время, в некоторых случаях даже всю жизнь. Эта иммунологическая память
используется для вакцинации, когда организм провоцируется безвредной или инактивированной формой инфекционного агента, чтобы вызвать специфический иммунитет. Иногда
в вакцины вводятся адъюванты, чтобы усилить специфическую иммунную реакцию.
Большинство знаний об инфекционных болезнях и иммунитете получены путем изучения натуральной оспы. Болезнь вызывается вирусом оспы, членом рода ортопоксвирусов. Почти два столетия назад профилактическая прививка коровьей оспы положила
начало иммунизации против натуральной оспы. Позже иммунизацию проводили вирусом
коровьей оспы. В начале 50-х годов многие промышленно развитые страны ликвидировали эндемическую оспу, используя вакцинацию вирусом коровьей оспы. Однако вакцинация против натуральной оспы вирусом коровьей оспы иногда приводит к серьезным
осложнениям, таким как поствакцинальный энцефалит, генерализованный вирусом коровьей оспы или контактной инфекцией.
Новая вакцина, не дающая таких осложнений, была разработана Антоном Мауром.
Осповакцина состоит из покс-вируса модифицированного вируса коровьей оспы Анкара
(MVA) и использовалась для парентеральной вакцинации против натуральной оспы почти
в 150000 вакцинациях без каких-либо осложнений, сопровождающих вакцинацию. Даже у
детей с иммунодефицитом не наблюдалось серьезных побочных эффектов. MVA был получен мутацией и селекцией исходного вируса коровьей оспы Анкара после 575 пассажей
в культурах фибробластов куриных эмбрионов. Безопасность этого MVA подтверждается
его биологическими, химическими и физическими свойствами. MVA имеет уменьшенный
3
BY 12059 C1 2009.06.30
молекулярный вес, шесть делеций в геноме, и является сильно аттенуированным (ослабленным) для клеток млекопитающих, т.е. ДНК и белок синтезированы, но практически
вирусные частицы не получены. Модифицированный вирус коровьей оспы Анкара, разработанный Антоном Мауром, был депонирован в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС), Солсбери, UK, под депозитарным номером V 94012707.
Вакцинация против натуральной оспы была очень успешной. В 1979 г. Всемирная организация здравоохранения декларировала уничтожение натуральной оспы. Соответственно, вакцинация детей была прекращена, и только работники лабораторий и
военнослужащие вооруженных сил некоторых стран вакцинированы.
С уничтожением натуральной оспы преимущественная причина покс-инфекции у человека была устранена. Однако некоторые нечеловеческие покс-вирусы имеют пониженную хозяйскую специфичность, т.е. они вызывают инфекцию не только у их типичного
хозяина (например, корова для коровьей оспы), но также и у других животных (например,
крыс и кошек). Люди также могут быть инфицированы этим путем. Так как часть населения не обладает длительным иммунитетом против натуральной оспы, ортопокс-инфекции
животных видов могут быть опасны для них. Следовательно, вакцинация домашних животных против ортопоксвирусов исключительно важна. Кроме того, MVA может быть важен в качестве вектора для генной терапии, т.е. может перемещать последовательности
нуклеиновых кислот в клетку-мишень, где они экспрессируются.
Для логарифмической репродукции MVA необходимы клеточные культуры первичных и вторичных фибробластов куриных эмбрионов. Клетки, полученные из куриных яиц,
инкубировались в течение 10-12 дней. Так как яйца подвержены биологической изменчивости, то клетки, полученные для систем клеточных культур, также изменчивы на клеточном уровне. Кроме того, в "культурах фибробластов" куриных эмбрионов часто находят
другие типы клеток, такие как эпителиальные клетки. Эта изменчивость клеток приводит
к изменчивости вирусов, генерируемых в фибробластах куриных эмбрионов. Поэтому
трудно стандартизировать и утвердить систему клеточных культур, чтобы гарантировать
постоянно высокое качество продуцируемого MVA. Кроме того, нельзя полностью исключить то, что контаминация систем клеточных культур микроорганизмами или вирусами уже присутствует в инкубируемых яйцах. Когда MVA выращивается в контаминированных вирусом клетках, MVA может рекомбинировать с контаминирующим вирусом.
Таким образом, может быть генерирован MVA с новыми и непредсказуемыми характеристиками. Для получения вируса в большом масштабе в суспензиях культур не очень пригодны первичные и вторичные фибробласты куриных эмбрионов. Кроме того, была бы
полезна очистка и концентрация MVA методом ультраградиентного центрифугирования.
Однако такая очистка трудна, когда MVA культивируется на первичных и вторичных
фибробластах куриных эмбрионов. И, наконец, увеличивается число пациентов, у которых
развивается аллергия против куриного яичного альбумина. Хотя условия культивирования
in vitro сильно снижают аллергенный потенциал, возможность аллергической реакции
нельзя исключить полностью.
В заключение, с одной стороны, MVA может эффективно расти только в первичных и
вторичных фибробластах куриных эмбрионов, причиняющих ряд неудобств, однако, с
другой стороны, выгода применения MVA у людей показана его широкомасштабным
применением в качестве вакцины.
Задача настоящего изобретения - обеспечить условия для производства гомогенных
вирусных частиц MVA. Кроме того, указанные условия должны учитывать легкость и широкий масштаб производства MVA.
Для достижения вышеупомянутой и других целей настоящее изобретение предоставляет новый штамм MVA, адаптированный для выращивания в клетках непрерывной линии клеток, причем указанные линии клеток одобрены для производства терапевтических
агентов.
4
BY 12059 C1 2009.06.30
Согласно настоящему изобретению, впервые возможно эффективное и крупномасштабное производство MVA. Так как клетки непрерывных клеточных линий гомогенны и
их свойства стабильны, то MVA, собранные с этих клеточных линий, также гомогенны и
имеют хорошо предсказуемые свойства. Кроме того, риск контаминации микроорганизмами может контролироваться, и контаминация препарата MVA белками куриных яиц,
как было обнаружено при культивировании MVA на фибробластах куриных эмбрионов,
может быть исключена. Использование перманентной линии клеток удобно и пригодно
для промышленного применения.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения MVA адаптирован к выращиванию в клетках клеточной линии млекопитающих, которые одобрены для производства вакцин. Неожиданно было найдено, что MVA, адаптированный к выращиванию в
клетках клеточной линии млекопитающих, такой как клеточная линия Vero, имеет еще и
пониженную вирулентность для людей и широкого ряда других млекопитающих. Следовательно, этот вирус является сильно аттенуированным, т.е. ДНК и протеин синтезированы, но фактически вирусные частицы не получены, в результате практически устранена
способность вызывать болезнь. Поэтому модифицированный вирус по настоящему изобретению особенно пригоден в качестве вакцины для человека и широкого круга млекопитающих. Соответственно, он особенно пригоден в ветеринарии.
Кроме того, в рамках настоящего изобретения разработан способ получения указанного вируса. Согласно этому способу, клетки клеточной линии, одобренной для производства терапевтического вещества, инфицировали MVA дикого типа. Предпочтительна
высокая множественность инфицирования (MOI), то есть для этого инфицирования используется большое число вирусов на клетку. Затем вирусы собирают и свежие клетки той
же клеточной линии инфицируют вновь полученными вирусами. Указанный процесс повторяют (серийное пассирование) до тех пор, пока MVA не адаптируется к указанной клеточной линии. Адаптация считается достигнутой, когда через 72 ч после инфицирования
титр вируса увеличивается, по меньшей мере, 1-9-кратно, предпочтительно 10-99-кратно,
более предпочтительно 100-106-кратно и наиболее предпочтительно более чем 107-1010кратно, по сравнению с титром вводимого вируса. Адаптация достигается после ограниченного числа пассажей.
"Адаптированный к выращиванию" означает, что количество вируса, полученного
после инфицирования (Output), увеличивается по сравнению с количеством вируса, первоначально используемого для инфицирования клеток (Input). В этом случае отношение
Output/Input больше 1.
"Производный" MVA, депонированного в ЕСАСС, Солсбери, UK, под депозитарным
номером 99101431 и/или временным инвентарным номером 01021411, означает MVA, который адаптирован для выращивания в Vero клетках со скоростью, по существу такой же,
как скорость выращивания депонированного штамма, но несет, по меньшей мере, одно
отличие в геноме по сравнению с депонированным штаммом.
Термин "иммунная система" в основном описывает комплекс, включающий защиту
организма против чужеродных веществ и микроорганизмов. Он делится на клеточную
часть, содержащую различные типы клеток, такие как, например, лимфоциты и другие
клетки, производные от белых клеток крови, и гуморальную часть, содержащую пептиды
и белки, такие как антитела, комплементные факторы и цитокины.
Термин "иммунный ответ" описывает реакцию иммунной системы, когда в организм
вводится чужеродное вещество или микроорганизм. Обычно иммунный ответ делится на
специфическую и неспецифическую реакции, хотя обе тесно переплетаются. Неспецифический иммунный ответ рассматривается как непосредственная защита против широкого
ряда чужеродных веществ и инфекционных агентов. Специфический иммунный ответ
может быть охарактеризован как высокоэффективный механизм защиты организма против чужеродного вещества, который повышается против указанного вещества после лаг5
BY 12059 C1 2009.06.30
фазы и высокоспецифичен для указанного вещества. Специфический иммунный ответ ответственен за тот феномен, что индивидуум, который выздоровел после специфической
инфекции, защищен против этой специфической инфекции в будущем.
"Активатор иммунной системы" означает любое вещество, способное провоцировать
или усиливать иммунный ответ.
"Супрессор иммунной системы" означает любое вещество, способное ослаблять или
ингибировать иммунный ответ.
"Стабилизатор иммунной системы" означает любое вещество, способное сохранять
иммунный ответ на постоянном уровне.
Изобретатели предлагают два предпочтительных штамма MVA, адаптированных к
выращиванию в клетках клеточной линии африканской зеленой мартышки, называемой
клеточной линией Vero (ATCC No. CCL-81). MVA-штамм, который пересевали 100 раз в
Vero клетках, назвали Vero-MVA и депонировали в Европейской коллекции клеточных
культур, Солсбери, UK, под депозитарным номером 99101431. MVA-штамм после 200
пассажей в Vero клетках назвали Vero-MVA-200 и депонировали в ЕСАСС под временным инвентарным номером 01021411.
MVA, полученный как описано выше, затем амплифицировали путем культивирования клеток одобренной клеточной линии при подходящих условиях, инфицирования клеток вирусом MVA и сбора вирусных частиц, продуцированных указанными клетками.
Впредь MVA может быть эффективно и легко амплифицирован в большом масштабе. Неожиданно Vero-MVA по изобретению не проявил повышенной вирулентности в клетках,
других, чем Vero клетки, таких как человеческие клеточные линии, в том числе HL, НЕР-2
или HeLA.
В другом варианте осуществления изобретения Vero-MVA содержит, по меньшей мере, одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, т.е. последовательность нуклеиновой кислоты, не найденную в геноме MVA (рекомбинантный Vero-MVA).
Предпочтительно гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты представляет
собой ген, более предпочтительно ген, кодирующий иммунизированный белок, и наиболее предпочтительно кодированный белок, иммунизированный против малярии, бешенства и/или гепатитов. Экспрессия указанной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты осуществляется предпочтительно под транскрипционным контролем промотора вируса коровьей оспы, более предпочтительно собственного MVA промотора. В
следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты включена по месту природной делеции в геном
MVA (раскрыто в РСТ/ЕР96/02926).
Рекомбинантный Vero-MVA используется для введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты гомологична или гетерологична клетке-мишени. Введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень может быть использовано для получения in vitro гетерологичных нуклеиновых кислот, пептидов и/или полипептидов и/или
белков, кодированных указанной последовательностью нуклеиновой кислоты. Этот метод
включает инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным Vero-MVA, культивирование
инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях, и необязательно выделение
и/или обогащение пептида и/или белка, продуцированного указанной клеткой-хозяином.
Кроме того, введение гомологичной или гетерологичной последовательности может
применяться для in vitro и предпочтительно in vivo генной терапии. Для in vitro и ex vivo
генной терапии соответственно клетки выделяли из леченой особи, трансформировали рекомбинантным Vero-MVA и повторно вводили особи, у которой были взяты клетки. Для
in vivo генной терапии рекомбинантный ген непосредственно вводили в тело живого животного, в том числе в тело человека. В предпочтительном варианте осуществления изобретения Vero-MVA экспрессирует антиген или антигенную детерминанту. Наиболее
6
BY 12059 C1 2009.06.30
предпочтительно указанный вектор экспрессирует антигенную детерминанту Plasmodium
falciparum, Mycobacteria, Herpes virus, Influenza virus, гепатитов или вируса иммунодефицита человека.
Так как Vero-MVA по изобретению неожиданно является сильно аттенуированным, то
Vero-MVA идеален для иммунизации широкого ряда млекопитающих, включая человека.
Поэтому изобретение также предлагает вакцину, содержащую Vero-MVA, для иммунизации животных, в том числе человека, против покс-инфекций, преимущественно ортопоксинфекций. Вакцина, кроме Vero-MVA, может дополнительно содержать одно или более
вспомогательных веществ, таких как антибиотик, консервант или стабилизатор. Вакцина
особенно применима в ветеринарии, например, для иммунизации животных против ортопокс-инфекций, например кошек против кошачьей оспы, мышей против эктромелии или
верблюдов против верблюжьей оспы. Иммунизация преимущественно проводится парентерально.
Иммунизационный эффект антигенной детерминанты в вакцине часто усиливают добавлением так называемых адъювантов. Адъювант также стимулирует иммунную систему
неспецифическим образом, вызывая сильную специфическую иммунную реакцию против
антигенной детерминанты вакцины. Согласно другому варианту осуществления изобретения, Vero-MVA используют как адъювант, чтобы совместно стимулировать иммунный
ответ против антигенной детерминанты вакцины. В этом случае Vero-MVA предпочтительно инактивирован. Инактивация Vero-MVA может быть осуществлена, например, нагреванием или с помощью химикатов. Предпочтительно Vero-MVA инактивируют с помощью β-пропиолактона. Согласно этому варианту осуществления изобретения, инактивированный Vero-MVA может быть добавлен к вакцинам против ряда инфекционных
болезней, чтобы увеличить иммунитет против этой болезни.
В случае инфекции иммунная, нервная, гормональная и сосудистая системы работают
вместе. Эти взаимодействия могут регулироваться элементами неспецифической иммунной системы, например цитокинами, такими как интерфероны и интерлейкины. Поксвирусы могут влиять на регуляцию иммунной системы (Swiss Vet 11/99, 13-17). Поэтому в
следующем варианте осуществления изобретения Vero-MVA и предпочтительно инактивированный Vero-MVA используются у млекопитающих, включая человека, для регуляции клеточного и гуморального элементов неспецифической (врожденной) иммунной
системы. Предпочтительно Vero-MVA используется как биорегулятор, когда дисфункции
иммунной системы устраняются и собственные защитные механизмы организма активируются, стабилизируются и/или супрессируются. Более предпочтительно Vero-MVA используется как биорегулятор в случае вирусных инфекций, например вирусов герпеса,
гепатитов В или С, в случае хронических воспалительных заболеваний, и/или поддерживающей раковой терапии. Vero-MVA могут также использоваться для стабилизации иммунной системы в ситуации повышенной чувствительности к инфекциям, например, в
случае стресса или у новорожденных. Активный и/или предпочтительно инактивированный MVA может применяться системно, например внутримышечно, и/или локально, например через слизистые оболочки и/или кожу.
В заключение, настоящее изобретение включает штаммы MVA, которые могут быть
использованы по тому же назначению, что и Vero-MVA дикого типа, но устраняют проблемы, обусловленные амплификацией Vero-MVA дикого типа в фибробластах куриных
эмбрионов.
Изобретение, inter alia, включает следующие объекты, сами по себе или в комбинации.
Модифицированный вирус коровьей оспы Анкара, адаптированный к выращиванию в
клетках клеточной линии Vero (Vero-MVA), полученный путем выращивания модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA) в клетках клеточной линии Vero.
Vero-MVA, описанный выше, адаптированный к выращиванию в клетках клеточной
линии Vero, депонированной в АТСС под номером CCL-81.
7
BY 12059 C1 2009.06.30
Vero-MVA, описанный выше, который представляет собой штамм вируса, депонированный в ЕСАСС под номером 99101431.
Vero-MVA, описанный выше, который представляет собой штамм вируса, депонированный в ЕСАСС под номером 01021411.
Vero-MVA, описанный выше, геном которого рекомбинирован с, по меньшей мере,
одним гетерологичным геному MVA участком последовательности, кодирующим терапевтический белок или антигенную детерминанту.
Клетка-хозяин, инфицированная описанным выше Vero-MVA.
Фармацевтическая композиция для иммунизации против ортопокс-инфекции, содержащая в качестве активного ингредиента описанный выше Vero-MVA или геном указанного вируса и фармацевтически приемлемый носитель.
Фармацевтическая композиция, описанная выше, для иммунизации млекопитающего,
включая человека.
Фармацевтическая композиция, описанная выше, для иммунизации кошки против
кошачьей покс-инфекции, мыши против инфекции эктромелия или верблюда против верблюжьей покс-инфекции.
Фармацевтическая композиция, описанная выше, которая обладает активностью активатора, супрессора или стабилизатора в отношении иммунной системы.
Фармацевтическая композиция для применения в качестве адъюванта, содержащая в
качестве активного ингредиента вышеописанный Vero-MVA или геном указанного вируса
и фармацевтически приемлемый носитель.
Фармацевтическая композиция для применения в генной терапии, содержащая в качестве активного ингредиента вышеописанный Vero-MVA или геном указанного вируса и
фармацевтически приемлемый носитель.
Способ введения генома Vero-MVA в клетку-хозяин, включающий инфицирование
клетки-хозяина вышеописанным Vero-MVA или трансфекцию клетки-хозяина геномом
указанного вируса.
Способ получения вышеописанного Vero-MVA, включающий стадии:
a) инфицирование MVA клеток клеточной линии Vero, предпочтительно MVA, депонированным в ЕСАСС под номером V 94012707;
b) сбор вирусов, продуцированных клетками, инфицированными согласно стадии (а);
c) инфицирование свежих клеток клеточной линии Vero вирусами, полученными согласно стадии (b), и, необязательно,
d) повторение стадии (с).
Способ получения вышеописанного Vero-MVA, включающий стадии:
a) культивирование клеток клеточной линии, подходящей для репликации вышеописанного Vero-MVA;
b) инфицирование клеток, полученных согласно стадии (а), вышеописанным VeroMVA;
с) сбор вирусов, продуцированных клетками, инфицированными согласно стадии (b).
Способ получения вышеописанного генома Vero-MVA или пептида и/или полипептида, кодируемого указанным геномом, включающий стадии:
a) инфицирование клетки-хозяина вышеописанным Vero-MVA;
b) культивирование клетки-хозяина, инфицированной согласно стадии (а);
c) выделение генома из вируса, продуцированного клеткой-хозяином, культивированной согласно стадии (b), и, необязательно,
d) получение пептида и/или полипептида, кодируемого геномом, выделенным согласно стадии (с).
Применение вышеописанного Vero-MVA для получения фармацевтической композиции
для иммунизации против заболевания, вызываемого чувствительным к иммунизации вирусом,
в частности для получения вакцины для иммунизации млекопитающего, включая человека.
8
BY 12059 C1 2009.06.30
Применение вышеописанного Vero-MVA для получения активатора, супрессора или
стабилизатора иммунной системы.
Применение вышеописанного Vero-MVA для получения адъюванта.
Применение вышеописанного Vero-MVA в качестве вакцины.
Применение вышеописанного Vero-MVA в качестве адъюванта.
Применение вышеописанного Vero-MVA в качестве активатора, супрессора или стабилизатора иммунной системы.
Способ иммунизации млекопитающего, включая человека, заключающийся в том, что вводят млекопитающему терапевтически эффективное количество вышеописанной композиции.
Способ активации, супрессии или стабилизации иммунной системы млекопитающего,
включая человека, заключающийся в том, что вводят млекопитающему терапевтически
эффективное количество вышеописанной композиции.
Способ усиления иммунной реакции у млекопитающего, включая человека, против
антигенной детерминанты вакцины, заключающийся в том, что вводят млекопитающему
терапевтически эффективное количество вышеописанной композиции.
Вышеописанный Vero-MVA, полученный способом, включающим стадии:
a) инфицирование MVA клеток клеточной линии Vero, предпочтительно MVA, депонированным в ЕСАСС под номером V94012707;
b) сбор вирусов, продуцированных клетками, инфицированными согласно стадии (а),
и, необязательно,
c) инфицирование свежих клеток клеточной линии Vero вирусами, полученными согласно стадии (b), и, необязательно,
d) повторение стадии (с).
Примеры
Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Специалисту в данной
области должно быть понятно, что приведенные примеры никоим образом не могут быть
интерпретированы как ограничивающие применение технологии, приведенной в настоящем изобретении, этими примерами.
Пример 1.
Адаптация MVA к Vero клеткам и определение свойств указанного штамма MVA
1. Адаптация MVA к Vero клеткам
Разработанный Антоном Мауром MVA дикого типа, представляющий собой модифицированный вирус коровьей оспы Анкара, был депонирован в ЕСАСС под депозитарным
номером V94012707. MVA дикого типа был адаптирован к выращиванию в Vero клетках
серийным пассированием вируса в Vero клетках (табл. 1). Клеточный клон ATCC-No.
CCL-81 стабильной Vero клеточной линии (семенной фонд WHO ЕСАСС No. 88020401)
использовали в пассажах No. 148-165 (WHO seed lot, Master and Working Bank). Клетки
размножали в среде, состоящей из Earle's MEM (минимальная поддерживающая среда)
(ICN), pH 7,4-7,6, и 5 % заменителя сыворотки BMS (Biochrom). Способом, известным
специалистам в данной области, почти такие же клетки из действующего банка были засеяны путем расщепления клеток от 1:2 до 1:4. Среда содержала приблизительно
250000 клеток на мл. Клетки соответственно размножали в пробирках (2 мл), Roux чашках (100 мл), и пластиковых чашках (6 и 40 мл соответственно). Обычно клетки образуют
сливающийся монослой через 16-24 ч. Затем среду заменяли чистой Earle's MEM без каких-либо добавок.
Для адаптации MVA дикого типа была использована пробирочная культуральная система. Результаты пассажей суммированы в табл. 1 и 2. Vero клетки инфицировали дозой
10 MOI (множественность заражения) MVA дикого типа, т.е. в среднем 10 вирусных частиц на Vero клетку. Исходный MVA дикого типа был генетически гомогенным, очищенным от бляшек MVA после 575 пассажей на фибробластах куриных эмбрионов (титр:
9
BY 12059 C1 2009.06.30
107,75 KID50/мл). Через 24 ч 90 % Vero клеток слившегося монослоя были разрушены токсичными процессами (50 % токсичностью, 40 % лизисом). Среда плюс клеточный детрит
после замораживания и оттаивания клеток, содержащих продуцированные вирусы, была
собрана, и 0,2 мл этой смеси были засеяны на монослой Vero клеток в пробирочной культуре (2-й пассаж). Эта процедура была повторена 200 раз. После третьего пассажа токсический эффект больше не наблюдался, тогда как было заметно слабое цитопатическое
действие (ЦПД), характеризующееся округлением клеток и лизисом в течение 4-6 дней
после инфицирования. Вирусный титр был 101,0 KID50/мл. Был сделан вывод, что пролиферация MVA в Vero клетках началась, хотя очень неэффективно. После пятого пассажа
наблюдалось типичное ЦПД, которое завершалось через 4-5 дней после инфицирования.
Вирусный титр увеличился с 101,0 KID50/мл после третьего пассажа до 104,0 KID50/мл после
пятого пассажа. Следовательно, вирус амплифицируется более эффективно в Vero клетках. В пассажах с № 5 по № 11 полное ЦПД наблюдалось все раньше, и раньше и вирусный титр увеличивался с каждым пассажем. На пассаже № 11 плато достигалось при
107,5 KID50/мл. Следовательно, после одиннадцатого пассажа была достигнута адаптация
MVA к Vero клеткам. В следующих 30 дополнительных пассажах результаты были для
всех пассажей одинаковыми и высоковоспроизводимыми: ЦПД начинается уже через 24 ч
после инфицирования, и все клетки были поражены через три дня после инфицирования.
В это время 20 % Vero клеток были округлыми и 80 % лизисными. Через три дня после
инфицирования вирусный титр был почти около 107,75 KID50/мл. После пятнадцатого пассажа вирусы всегда собирали через два-три дня после инфицирования и только 1 MOI
вместо 10 MOI использовали для инфицирования клеток (табл. 2). В следующих дополнительных пассажах характеристики роста MVA только слегка изменялись. Примечательно,
что вирусный титр увеличивался и достиг 1010 KID50/мл на пассаже 200.
В заключение, вирус растет воспроизводимо по экспоненциальному типу в Vero клетках.
Указанные характеристики роста неожиданно отличаются от характеристик MVA дикого типа. Таким образом, серийным пассированием был получен новый штамм MVA. Указанный
новый штамм назвали "Vero-MVA", а после 200 пассажа в Vero клетках "Vero-MVA-200".
Vero-MVA и Vero-MVA-200 культивировали в больших количествах. Для хранения
Vero-MVA концентрировали центрифугированием, ресуспендировали в 2,5 % полигелине
и лиофилизировали, хранили в пузырьках по 2 мл. Титр после лиофилизации был, по
меньшей мере, 108,5 KID50/мл. Лиофилизированные Vero-MVA и Vero-MVA-200 были испытаны на контаминацию и токсичность и хранились при + 4 °С.
2. Определение биологических свойств Vero-MVA.
Биологические свойства Vero-MVA (100 пассажей) и Vero-MVA-200 (200 пассажей)
сравнили со свойствами MVA дикого типа (табл. 3 и 5). Таким образом, методы, известные специалистам, были использованы практиками. Изобретатели показали, что не изменился диапазон хозяев вируса, за исключением Vero клеток, и не увеличилась
вирулентность для людей или животных. Vero-MVA также характеризуется абортивным
воспроизведением в непермиссивных клетках-хозяевах.
В основном идентичность вирусных частиц Vero-MVA по сравнению с вирусными
частицами штамма Elstree вируса коровьей оспы была показана путем перекрестной реактивности антител, выращенных против штамма Elstree. Штамм Elstree является штаммом
коровьей оспы, рекомендованным ВОЗ для оспенной вакцинации. Поликлональная гипериммунная сыворотка кроликов, выращенная против штамма Elstree, была добавлена к
Vero-MVA. 100 KID50/мл Vero-MVA были полностью нейтрализованы при разведении сыворотки 1:512. Двойное разведение сыворотки необходимо, чтобы нейтрализовать штамм
Elstree коровьей оспы (1:256). Следовательно, Vero-MVA также может быть эффективно
нейтрализован с помощью иммунной сыворотки коровьей оспы.
Vero-MVA, Vero-MVA-200 и MVA дикого типа сравнили с помощью ряда дополнительных тестов, как указано в табл. 3, 4 и 5. Изобретатели показали, что вирулентность
10
BY 12059 C1 2009.06.30
Vero-MVA и Vero-MVA-200 для млекопитающих, включая человека, не увеличилась по
сравнению с MVA дикого типа. Было также показано, что Vero-MVA и Vero-MVA-200 не
заразны и не токсичны для млекопитающих, в том числе для человека. Неожиданно, клеточная специфичность Vero-MVA была более или менее идентичной специфичности MVA
дикого типа, за исключением Vero клеток: Vero-MVA амплифицирует почти также неэффективно в клетках человеческих клеточных линий (табл. 4: HL-, HEP-2-, и HeLa-клетки),
как и MVA дикого типа. Таким образом, хотя человеческие клетки и клетки африканской
зеленой мартышки являются филогенетически тесно связанными, Vero-MVA не получил
способности к амплификации в человеческих клетках. В других тестах не было замечено
существенных отличий.
Кроме того, сравнивали физические, химические и биологические свойства MVA дикого типа и Vero-MVA-200 (табл. 5). Тогда как MVA дикого типа, выращенный в клеточных культурах куриных эмбриональных фибробластов, имел три делеции в левой
инвертированной концевой области, Vero-MVA-200 имел четыре делеции в левой концевой области по сравнению с геномом поксвируса, выделенного в Анкаре. Следовательно,
пассирование MVA дикого типа в Vero клетках привело к дополнительным делециям.
Vero-MVA использовали для иммунизации домашних животных против ортопоксинфекций. Сыворотку животных собрали и выполнили нейтрализационный тест. Изобретатели показали, что животные продуцируют антитела с высоким титром. Титры антител
были стабильны в течение, по меньшей мере, 111 дней. Было показано, что антитела способны нейтрализовать in vitro вирусные частицы MVA в тесте восстановления бляшек. В
заключение, Vero-MVA может быть использован в качестве вакцины против ортопоксинфекций у домашних животных и у людей.
Таблица 1
Адаптация MVA к Vero клеткам
Пассаж
№
Культура клеток
Высший титр
вируса
[log10/мл]
1
токсичный эффект
через 24 ч
2,0
3
нетоксичный, среднее
ЦПД через 4-6 дней
1,0
Результат
Вывод
остатки вируса высевают
остатки вируса высе- слепые пассажи
вают
феномен зон и
начало репродукции выработка цитовируса
кина
возрастающая репродукция вируса
логарифмическая реуспешная
продукция вируса
адаптация
типичное ЦПД, завер4,0
шенное через 4-5 дней
ЦПД завершенное
11
7,5
через 3 дня
ЦПД начинается через
воспроизводимая ре12-42* 24 ч, завершается через
7,75
Vero-MVA
продукция вируса
3 дня
ЦПД начинается через
воспроизводимая ре43-100* 24 ч, завершается через
8,0
Vero-MVA
продукция вируса
3 дня
ЦПД начинается через
воспроизводимая рев результате
100-200* 24 ч, завершается через
10,0
продукция вируса
Vero-MVA-200
3 дня
* только 1 MOI вместо 10 MOI высевали после одиннадцатого пассажа.
5
11
BY 12059 C1 2009.06.30
Таблица 2
Изменение титров вируса во время адаптации MVA к Vero клеткам
Пассаж №
1
2
3
5
8
11
18
19
20
25
29
30
31
45
51
60
66
68
75
100
200
Собранный через
[дни п. инф.]
1
3
5
5
4
3
2
2
3
2
2
3
3
2
3
2
2
2
3
2
2
Титр на мл [log10/мл]
<2,0
2,0
1,0
4,0
6,5
7,5
8,0
7,75
8,0
7,75
7,75
7,75
8,0
7,75
7,75
8,0
7,75
8,0
8,0
8,0
10,0
Таблица 3
Сравнение биологических характеристик MVA дикого типа и Vero-MVA
Маркер
ЦПД в монослое клеточных культур (1 MOI
засеян)
MVA дикого типа
Vero-MVA (пассаж
100)
Vero-MVA-200
округление и лизис
клеток через 5 дней
(90 % ЦПД)
округление и лизис
клеток через 5 дней
(100 % ЦПД)
округление и лизис
клеток через
3-5 дней (100 %
ЦПД)
Титр оптимального
108,0 KID50/мл
107,75 KID50/мл
1010 KID50/мл
съема
Абортивная репродукция вируса в непермисда
да
да
сивных системах
клеток
Пониженная вирулентда: не вирулентный
ность для человека и
да
да
вовсе
животных
Заразность
нет
нет
нет
Характер первичных
не пролиферативные не пролиферативные не пролиферативбляшек на хорион
утолщения без нек- утолщения без нек- ные утолщения без
аллантоис мембране
роза
роза
некроза
12
BY 12059 C1 2009.06.30
Продолжение табл. 3
Маркер
Гемагглютинация (куриные эритроциты)
Инактивация
β-пропиолактоном
MVA дикого типа
Vero-MVA (пассаж
100)
Vero-MVA-200
отрицательна
отрицательна
отрицательна
кинетическая первокинетическая перкинетическая первого
го порядка для
вого порядка для
порядка для 0,05 %
0,05 %
0,04-0,05 %
Протективный эффект
в провокационном тесда
да
да
те VSV-мышат
Токсичность для людей
нет
нет
нет
и животных
Стимуляция цитокином интерферон α, IL-2, и интерферон α, IL-2, и интерферон α и γ,
12, CSA
12, CSA
IL-1,2, и 12, CSA
Активация фагоцитоза,
природных клетокда
да
да, повышенные
киллеров, и
Т-лимфоцитов
Таблица 4
Скорость репродукции в KID50/мл Vero-MVA и MVA дикого типа в различных системах клеточных культур [log10/мл]
Система клеточной культуры
MVA дикого типа (575 пасVero-MVA (31
саж в первичных фиброблаVero-пассаж)
стах куриных эмбрионов)
1
) Vero (почечные клетки африканской зе8,0
4,5
леной мартышки)
Первичные куриные эмбриональные фиб4,5
8,5
робласты
1,2
) HL (легкие человека)
3,0
2,5
1,2
) НЕР-2 (плоскоклеточный рак человека)
3,0
2,5
1,2
) HeLA (цервикальный рак человека)
2,75
2,75
l,2
) BHK (почечные клетки хомяка)
5,75
5,25
1,2
3,5
3,5
) MDBK (бычьи почечные клетки)
1,2
) РК-15 (свиные почечные клетки)
3,25
3,5
1) непрерывные клеточные линии, производные из тканей и биотипов, указанных в
скобках.
2) клеточные линии, полученные из коллекции института медицинской микробиологии
в Мюнхене, Германия.
13
BY 12059 C1 2009.06.30
Таблица 5
Сравнение MVA дикого типа (572 пассаж в фибробластах куриных эмбрионов (CEF))
с Vero-MVA-200 (200 пассаж в Vero клетках)
Маркер
MVA дикого типа
Vero-MVA-200
3 делеции в левой концевой
4 делеции в левой концевой
области (повтор инвертирообласти
ванного конечного фрагмента)
Генетические маркеры
размер генома уменьшается с дальнейшее уменьшение раз(сравнение со штаммом
208 до 178 kb
мера генома до 172 kb
поксвируса, выделенным
потеря 15 % молекулярного
потеря 20 % молекулярного
в Анкаре)
веса исходного генома
веса исходного генома
дополнительная потеря рецеппотеря рецептора интерферона
торов, например для IL-1β
активация Т-хелперных клеток повышенная активация цитоКлеточные маркеры
(CD4, CD8, CD25)
токсических Т-лимфоцитов
повышенная активация
активация NK клеток
NK клеток
абортивная репродукция в
дальнейшее сужение спектра
клетках млекопитающих (ис- хозяев в системах клеточных
ключая клетки ВНК)
культур
Цитокин
интерферон α, IL-2, IL-12
интерферон α и γ, IL-1, 2, 12
9,5
CEF: 10 KID50/мл
CEF: 104,5 KID50/мл
Титр вируса
Vero клетки: 104,0 KID50/мл
Vero клетки: 109,5 KID50/мл
восстановление активности
усиленная активность неспеИммунная система
специфической иммунной сисцифической иммунной
темы
системы
Вирулентность для челонизкая
нет
века и животных
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
14
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
183 Кб
Теги
by12059, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа