close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12134

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.08.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 01N 63/00
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЗАЩИТЫ ПЛОДОВЫХ
И ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР ОТ БОЛЕЗНЕЙ
(21) Номер заявки: a 20071024
(22) 2007.08.15
(43) 2009.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Коломиец Эмилия Ивановна; Романовская Татьяна Витальевна; Молчан Ольга Владиславовна;
Здор Наталья Анатольевна; Колтун
Наталья Евгеньевна (BY)
BY 12134 C1 2009.08.30
BY (11) 12134
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) RU 2216173 C2, 2003.
SU 1706504 A1, 1992.
SU 1738200 A1, 1992.
RU 2126210 C1, 1999.
(57)
1. Способ получения препарата для защиты плодовых и ягодных культур от болезней,
включающий глубинное культивирование бактерий Bacillus subtilis в питательной среде,
содержащей источник углерода, отличающийся тем, что используют в качестве бактерий
штамм Bacillus subtilis БИМ В-262 и в качестве источника углерода сахарозу в количестве
1 об. % или глюкозу в количестве 1 об. %, или мелассу в количестве 1-4 об. %, или овсяную муку в количестве 1-4 об. %, или гороховую муку в количестве 2 об. %, или пшеничную муку в количестве 2 об. %, или ячменную муку в количестве 2 об. %, или кукурузную
муку в количестве 2 об. %, при этом бактерии вносят в питательную среду в количестве
10 об. % до титра (1,8-2,0) × 107 клеток в 1 мл, культивируют в течение 36-42 ч при температуре 30 ± 2 °С и постоянном перемешивании и аэрации с интенсивностью 1,0-1,5 л воздуха на 1 л среды в минуту до титра (8,7-9,0) × 109 спор в 1 мл, после чего дополнительно
вносят 3-5 % NaCl и 0,1-0,3 об. % гидрогеля Гисинар.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют
мелассу или овсяную муку в количестве 2-4 об. % или 1-3 об. % соответственно.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что препарат дополнительно концентрируют путем вакуум-выпаривания при температуре 55 °С до получения титра (2,54,0) × 1010 спор в 1 мл.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству биопестицидов
на основе живых культур микроорганизмов, и касается способа получения эффективного
бактериального препарата для защиты плодовых и ягодных культур от фитопатогенных
грибов и бактерий - возбудителей парши яблони (Fusicladium dendriticum F.), бактериального (Pseudomonas syringae pv. syringae) и обыкновенного (европейского) рака плодовых
(Nectria galligena Bres.), а также серой гнили ягодников (Botrytis cinerea).
BY 12134 C1 2009.08.30
Эффективность микробных препаратов обусловлена как активностью штаммаантагониста, так и выбором способа его культивирования, созданием оптимальных условий для роста и развития культуры, накопления метаболитов с антимикробным действием.
Наиболее продуктивным процессом получения биопрепаратов по сравнению с поверхностным и твердофазным выращиванием является глубинное культивирование
штаммов микроорганизмов в ферментерах, обеспечивающее высокую скорость роста
культур, активную продукцию антимикробных метаболитов и возможность направленного регулирования биосинтетической способности с помощью технологических параметров (термостатирование, рН-статирование, аэрация и др.).
Известен ряд препаратов на основе бактерий рода Pseudomonas [1, 2], способных эффективно подавлять развитие фитопатогенных грибов и бактерий. Однако они имеют ряд
недостатков, главный из которых - ограниченный срок жизнедеятельности бактериальных
клеток. Установлено, что после обработки семян и последующего высушивания бактерии
рода Pseudomonas гибнут в течение 2-3 дней. Кроме того, для выращивания вышеуказанных микроорганизмов используются богатые дорогостоящие питательные среды - МПБ и
среда Кинга В на основе пептона.
Несомненные преимущества в качестве основы биопрепаратов имеют бактерии рода
Bacillus, которые благодаря способности к спорообразованию способны конкурировать с
микроорганизмами других таксономических групп по устойчивости к факторам внешней
среды, стабильности и активности.
Известен препарат на основе Bacillus subtilis ИПМ-215 [3]. Недостатком данного способа является использование поверхностного способа выращивания штамма на агаризованной среде для получения бактериальной суспензии - длительного, малопродуктивного
процесса (не менее 5-7 суток), ограничивающего потенциал штамма.
Известен способ получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis, который включает культивирование бактерий до максимального накопления бактериальных
клеток и спор, после чего их подвергают лиофильной сушке [4]. Однако указанный препарат эффективен только в отношении болезней грибной этиологии и не способен контролировать развитие бактериальных фитопатогенных микроорганизмов. Кроме того,
недостатком способа является высокая энергоемкость, обусловленная необходимостью
лиофильного высушивания культуральной жидкости.
Известен способ получения биопрепарата "Фитоспорин - сухой" на основе живой
культуры (клетки и споры) Bacillus subtilis с наполнителем [5], предназначенного для защиты сельскохозяйственных культур от комплекса болезней. Препарат разливается в стерильные ампулы и запаивается, в качестве наполнителя используются сыворотка крови,
молоко, обрат, сахарозо-желатиновая смесь, необходимые для защиты культуры при лиофилизации. Недостатками данного способа являются высокая продолжительность (50-80
ч) процесса лиофилизации, энергоемкость, отсутствие антимикробных метаболитов в получаемом препарате, а также выпуск в небольших объемах, ограниченных емкостью ампул.
В способе получения биопрепарата "Фитоспорин - жидкий" удалось устранить некоторые вышеуказанные недостатки [6, 7]. Бактерии Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (26Д)
культивируют в больших объемах в жидкой питательной среде на основе пептона или
триптона и углеводов. Для приготовления препарата используют жидкую культуру, содержащую не только живые клетки и споры продуцента, но и антимикробные метаболиты, в качестве стабилизатора и стимулятора роста растений добавляют гумми (0,5-2,0 %).
Недостатком способа является отсутствие у штамма-продуцента ростстимулирующей активности, вследствие чего возникает необходимость внесения стимуляторов роста извне,
что в совокупности с дорогостоящей питательной средой приводит к удорожанию процесса.
2
BY 12134 C1 2009.08.30
Известен способ получения биопрепарата Фитоспорин, включающий засев питательной среды маточной культурой, которую готовят путем подращивания бактерий до экспоненциальной фазы роста последовательно в реакторах возрастающих объемов, и
глубинное культивирование до получения концентрации клеток 1-2×109 кл/мл и перехода
70-100 % клеток в споры. Полученный в процессе ферментации целевой продукт отделяется и смешивается со стабилизатором биомассы - гумми [8]. Недостатками этого способа
являются высокая стоимость используемой для выращивания бактерий среды, содержащей наряду с минеральными солями и микроэлементами пептон и глюкозу в концентрации 10 г/л, низкий титр клеток в конечном продукте - до 2 млрд/мл. Кроме того, для
выращивания культуры по предложенной схеме требуется наличие сложной технологической линии, включающей 4 ферментера емкостью 10, 100, 1000 и 10000 л.
Известен способ получения препарата на основе бактерий Bacillus subtilis 24 Д (ВНИИСХМ 129), предназначенного для предпосевной обработки семян и вегетирующих растений сельскохозяйственных культур, плодовых деревьев и ягодных кустарников [9]. Этот
способ, основанный на смешивании 2-суточной жидкой культуры бактерий Bacillus subtilis 24 Д (титр 5×109 кл/мл) с гуматами и микроэлементами, является наиболее близким
предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату. Полученный конечный продукт обладает как фунгицидным, так и ростстимулирующим действием. Однако
способу присущи следующие недостатки:
для приобретения ростстимулирующих свойств к жидкому препарату требуется добавление гуматов и микроэлементов, что делает процесс получения препарата более трудоемким и затратным;
высокая продолжительность процесса культивирования (48 ч) приводит к повышению
энергозатрат и, соответственно, себестоимости получаемой продукции;
отсутствие данных об эффективности действия препарата против болезней плодовых
деревьев и ягодных кустарников.
Задачей изобретения является создание технологичного способа получения бактериального препарата комплексного действия, эффективного против грибных и бактериальных фитопатогенов - возбудителей наиболее вредоносных болезней плодовых и ягодных
культур: парши яблони (Fusicladium dendriticum F.), бактериального (Pseudomonas syringae
pv. syringae) и обыкновенного (европейского) рака плодовых (Nectria galligena Bres), серой
гнили ягодников (Botrytis cinerea), сочетающего фитозащитную, ростстимулирующую активность, стабильность и высокие адгезионные свойства.
Указанная задача решается за счет:
использования в качестве основы препарата штамма спорообразующих бактерий В.
subtilis БИМ В-262, характеризующегося широким спектром антимикробного действия в
отношении возбудителей болезней плодовых и ягодных культур и фитостимулирующей
активностью;
выращивания штамма В. subtilis БИМ В-262 на оптимизированных питательных средах с мелассой или овсяной мукой в качестве источников углерода, обеспечивающих высокую продуктивность и экономичность процесса;
применения рационального способа культивирования (глубинного) в ферментере при
постоянном перемешивании (200-220 об/мин), аэрации (1-1,5 л воздуха/1 л среды в минуту) и термостатировании (28-32 °С), обеспечивающего интенсивный рост, спорообразование культуры и синтез антимикробных метаболитов при длительности культивирования
36-42 ч;
оптимизации препаративной формы путем вакуум-концентрирования КЖ при температуре 50-55 °С, обеспечивающего сохранность антагонистической активности культуры
и титра жизнеспособных спор;
использования гидрогеля Гисинар в качестве прилипателя для повышения адгезионных свойств препарата и эффективности его действия в агробиоценозах;
3
BY 12134 C1 2009.08.30
добавления в качестве консерванта NaCl.
Штамм-продуцент В. subtilis БИМ В-262 депонирован в Коллекции непатогенных
микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси.
Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Утилизация различных источников углеродного и азотного питания бактериями
В.subtilis БИМ В-262.
При выращивании В.subtilis БИМ В-262 на агаризованной среде с различными источниками углерода установлено, что указанный штамм, предлагаемый в качестве основы
биопрепарата для защиты плодовых и ягодных культур от болезней, способен, наряду с
использованием широкого спектра моно- и дисахаридов, утилизировать крахмалсодержащие субстраты.
В условиях глубинного выращивания максимальная антагонистическая активность
культуры достигается на средах с овсяной, гороховой или кукурузной мукой, а также с
сахарозой и мелассой - отходом свеклосахарного производства (табл. 1).
В соответствии с представленными в табл. 2 результатами оптимальным источником
азота, обеспечивающим активный рост популяции, выход жизнеспособных спор (95,1 %)
и высокую антагонистическую активность культуры в отношении бактериальных и грибных патогенов, является сульфат аммония в концентрации 1,5 г/л.
На основании полученных результатов, а также с целью повышения техникоэкономических показателей процесса для глубинного культивирования В. subtilis БИМ В262 рекомендованы питательные среды с мелассой или овсяной мукой (наиболее эффективными и дешевыми субстратами) следующего состава (г/л):
1. Меласса-30,0; К2НРО4⋅3Н2О - 4,0; NaH2PO4⋅2H2O - 1,0; MgSO4⋅7Н2О - 0,1; (NH4)2SO4 1,5; Н2О - до 1 л.
2. Овсяная мука - 20,0; К2НРО4⋅3Н2О - 4,0; NaH2PO4⋅2H2O - 1,0; MgSO4⋅7Н2О - 0,1;
(NН4)2SО4 - 1,5; Н2О - до 1 л.
Таблица 1
Влияние различных источников углерода на рост и антимикробную активность
В. subtilis БИМ В-262 (культивирование в колбах на качалке)
Диаметр зоны задержки роста
Титр, КОЕ/мл
Вариант
тест-культур, мм
клеток
спор
P. syringae 3-3 F. dendriticum Str.
Сахароза 1 % (контроль)
29,5
34,4
3,9⋅109
2,9⋅108
9
8
Глюкоза 1 %
25,4
23,7
3,9⋅10
3,4⋅10
Меласса 1 %
28,7
25,2
3,0⋅109
2,7⋅109
9
9
Меласса 2 %
32,6
28,4
3,9⋅10
3,0⋅10
9
9
Меласса 3 %
34,5
38,5
4,3⋅10
4,1⋅10
Меласса 4 %
28,0
26,2
3,9⋅109
2,7⋅109
9
9
Овсяная мука 1 %
27,5
29,4
3,2⋅10
2,8⋅10
9
9
Овсяная мука 2 %
33,4
36,3
4,3⋅10
4,0⋅10
Овсяная мука 3 %
29,7
30,5
3,8⋅109
3,5⋅109
9
9
Овсяная мука 4 %
26,0
28,1
2,8⋅10
2,3⋅10
9
9
Гороховая мука 2 %
34,5
35,8
4,3⋅10
3,8⋅10
Пшеничная мука 2 %
26,6
30,5
3,9⋅109
3,0⋅109
9
9
Ячменная мука 2 %
27,6
24,2
3,9⋅10
2,9⋅10
9
9
Кукурузная мука 2 %
35,7
28,6
4,3⋅10
3,8⋅10
4
BY 12134 C1 2009.08.30
Таблица 2
Влияние концентрации и соотношения источников азота в питательной среде
на антагонистическую активность при культивировании в колбах на качалке
В. subtilis БИМ В-262
Диаметр зоны задержки
Титр, КОЕ/мл
роста, мм
Вариант
P. syringae F. dendriticum
клеток
спор
3-3
Str.
9
9
(NН4)2SО4 - 1,0 г/л
33,6
30,4
3,2⋅10
2,6⋅10
9
9
(NH4)2SO4 - 1,5 г/л
36,5
38,5
4,1⋅10
3,9⋅10
9
9
(NH4)2SO4 - 2,0 г/л
36,5
38,0
4,0⋅10
3,7⋅10
КNO3 - 1,5 г/л
34,7
32,1
3,2⋅109
2,7⋅109
9
9
NH4NO3 - 0,6 г/л
25,5
12,4
2,3⋅10
1,7⋅10
9
9
Мочевина - 0,45 г/л
27,5
19,6
3,0⋅10
2,2⋅10
КЭ - 5 г/л
37,7
18,2
3,2⋅109
2,7⋅109
9
9
ДЭ - 5 г/л
32,5
18,7
3,9⋅10
2,8⋅10
9
9
(NH4)2SO4 - 0,5 г/л + KNO3 - 0,8 г/л
28,7
17,1
3,9⋅10
3,1⋅10
(NH4)2SO4 - 0,5 г/л + NH4NO3 - 0,3 г/л
25,1
19,6
3,9⋅109
3,7⋅109
9
9
(NH4)2SO4 - 1,5 г/л + ДЭ - 25 мг/л
36,5
35,2
3,9⋅10
3,5⋅10
9
9
(NH4)2SO4 - 1,5 г/л + КЭ - 5 г/л
25,2
19,4
3,2⋅10
2,5⋅10
Таким образом, в зависимости от имеющейся сырьевой базы для производства биопрепарата на основе В. subtilis БИМ В-262, кроме мелассы, могут использоваться другие
альтернативные виды дешевого местного сырья и, в частности, овсяная мука, что является
преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом, предусматривающим
глубинное культивирование продуцента только на мелассе.
Пример 2
Спорообразование культуры В. subtilis БИМ В-262 при росте на питательных средах с
мелассой или крахмалсодержащим субстратом (овсяной мукой).
Предложенные питательные среды обеспечивают активный рост и спорообразование
культуры В. subtilis БИМ В-262 (табл. 3, 4). Согласно представленным в таблицах данным,
к 24 ч роста доля спор в популяции составляет около 44 % от общего количества клеток, а
к 36-42 ч процесс спорообразования проходит практически полностью и достигает 9699 %.
Таблица 3
Динамика роста и спорообразования бактерий В. subtilis БИМ В-262
при выращивании в колбах на качалке
Титр клеток, n/мл
Титр спор, n/мл
Длительность кульсреда с месреда с овсяной
среда с месреда с овсяной
тивирования, ч
лассой
мукой
лассой
мукой
7
7
3
0
1,8⋅10
2,0⋅10
4,0⋅10
3,9⋅103
6
1,5⋅108
1,7⋅108
4,0⋅103
4,1⋅103
8
8
4
12
4,9⋅10
4,8⋅10
7,0⋅10
7,3⋅104
24
6,3⋅108
6,1⋅108
2,8⋅108
2,7⋅108
36
8,9⋅109
9,1⋅109
8,6⋅109
8,9⋅109
9
9
9
42
9,0⋅10
9,3⋅10
8,9⋅10
9,0⋅109
5
BY 12134 C1 2009.08.30
Таблица 4
Показатели роста и спорообразования В. subtilis БИМ В-262 на среде
с мелассой в сравнении с прототипом
В. subtilis 24 Д (проВ. subtilis БИМ В-262
тотип), [9]
Показатели
Продолжительность выращивания, ч
36
42
48
9
9
Титр, клеток/мл
8,7⋅10
9,0⋅10
5,0⋅109
Доля спор, %
96
99
нет данных
Диаметр зоны ингибирования, мм:
P. syringae 3-3
34
37
-/F. dendriticum Str.
36
39
-/В. cinerea
33
35
-/N.galligena Bres.
32
35
-/Таким образом, преимуществами предлагаемого способа по сравнению с прототипом
являются:
1. Более высокий титр жизнеспособных клеток и спор, что определяет высокую эффективность действия биопрепарата.
2. Более низкая продолжительность выращивания - в 1,15-1,3 раза ниже, чем в прототипе, что обеспечивает высокую продуктивность процесса и более низкую себестоимость
получаемой продукции.
Пример 3
Получение биопрепарата в форме жидкости и текучей пасты.
Для получения жидкого препарата культуру выращивают на предложенных питательных средах с соблюдением оптимизированных (табл. 5) технологических параметров:
рНисх среды 6,0-8,0 с оптимумом при рН 7,0. За пределами указанного интервала рН
антагонистическая активность В. subtilis БИМ В-262 снижается;
температура культивирования 30 ± 2 °С. Понижение температуры культивирования до
20 °С, равно как и повышение до 37 °С, приводит к замедлению роста бактерий В. subtilis
БИМ В-262 и снижению антагонистической активности культуры;
непрерывная скорость вращения мешалки - 200 об/мин. При повышении скорости вращения мешалки до 250 об/мин происходит увеличение пенообразования, что затрудняет
ферментационный процесс, а при снижении уменьшается выход спор и замедляются ростовые процессы;
аэрация - 1,0-1,5 л воздуха/л среды в мин. Снижение количества подаваемого воздуха
до 0,5 л/л/мин приводит к замедлению роста культуры, при этом концентрация клеток к 36
ч культивирования не превышает 4,8⋅109 при уровне спорообразования 50 %. Повышение
количества воздуха до 2,0 л воздуха/л среды в мин является экономически не выгодным,
поскольку показатели титра клеток и спор, а также антагонистическая активность культуры не превышают оптимального варианта.
Количество вегетативного посевного материала составляет 10 % об. Внесение 5 % посевного материала не обеспечивает высокий выход клеток и спор в течение 36-42 ч, а 15 %
экономически не выгодно.
6
BY 12134 C1 2009.08.30
Таблица 5
Технологические параметры глубинного культивирования бактерий
В. subtilis БИМ В-262*
Антагонистическая активТитр, п/мл
ность, мм
Параметры культивирования
P. syringae
клеток спор
F. dendriticum Str.
3-3
рНисх среды
6,0
30,1
32,4
8,6⋅109 8,4⋅109
9
9
7,0
36,5
38,5
9,0⋅10 8,9⋅10
9
9
8,0
32,5
30,1
8,9⋅10 8,6⋅10
Температура культивирования, °С
25
25,1
23,4
3,2⋅109 2,4⋅109
9
9
30
36,5
38,5
9,0⋅10 8,9⋅10
9
9
35
27,3
23,2
5,0⋅10 4,6⋅10
Скорость вращения мешалки, об/мин
150
26,5
28,5
7,0⋅109 3,9⋅109
9
9
200
36,5
38,5
9,0⋅10 8,9⋅10
9
9
250
35,5
37,5
6,0⋅10 5,7⋅10
Интенсивность аэрации, л воздуха/л среды
в мин
0,5
33,1
29,0
4,8⋅109 2,4⋅109
9
9
1,0
36,5
38,5
9,0⋅10 8,9⋅10
9
9
1,5
36,4
38,3
9,0⋅10 8,9⋅10
Количество вегетативного посевного материала, % об.
5
32,5
36,0
6,8⋅109 6,2⋅109
9
9
10
36,5
38,5
9,0⋅10 8,9⋅10
9
9
15
36,5
38,5
9,1⋅10 8,9⋅10
* Продолжительность культивирования - 40 ч.
Для получения биопрепарата в форме текучей пасты исходную культуральную жидкость с титром спор 8,9⋅109/мл концентрируют в 5 раз путем вакуум-выпаривания при
температуре 55 °С, что обеспечивает максимальную сохранность спор и антимикробных
метаболитов. Титр жизнеспособных спор в конечном продукте (текучей пасте) достигает
4,0⋅1010/мл. Концентрирование при 57 °С и 60 °С приводит к некоторому снижению количества спор и антибактериальной активности, а при низких температурах (45 °С и 50 °С)
удлиняется процесс выпаривания (табл. 6).
Таблица 6
Влияние условий концентрирования на титр спор и антагонистическую активность
биопрепарата в форме текучей пасты
Общая продолжиДиаметр зон задержки роста фитопатогенов,
ТемпераТитр,
тельность упаривамм
тура, °С
спор/мл
ния, мин
P. syringae 3-3
F. dendriticum Str.
10
45
37
36,6
39,9
3,9⋅10
10
50
31
36,6
39,8
3,9⋅10
10
55
25
36,5
40,7
4,0⋅10
10
57
22
33,0
39,3
3,7⋅10
10
60
19
27,7
38,4
2,6⋅10
7
BY 12134 C1 2009.08.30
Для стабилизации антагонистической активности жидкого препарата и препарата в
форме текучей пасты используется хлорид натрия. Введение его в концентрации 4 % позволяет сохранить титр жизнеспособных спор в препаратах через 6-9 месяцев хранения на
уровне 95,0-96,6 %. При этом антагонистическая активность в конце наблюдаемого периода составляет 94,4-97,8 % от исходной (табл. 7, 8). Результаты, полученные при использовании 5 % соли, статистически не отличаются от 4 %-ной концентрации, а
уменьшение количества NaCl до 3 % снижает сохранность спор на 27,5-28 % в сравнении
с исходными титрами, в связи с чем оптимальная концентрация консерванта - 4 %.
Добавка полиакриламидного геля (ПААГ) Гисинар в качестве промотора адгезии не
оказывает отрицательного влияния на качественные показатели жидкого препарата и текучей пасты, напротив, использование его в сочетании с NaCl стабилизирует бактериальную суспензию, предотвращает ее расслоение и образование осадка, что упрощает
технологию применения биопрепарата и повышает его эффективность.
Для получения равной концентрации Гисинара в рабочих растворах для обработки
плодовых деревьев от парши, приготовленных из жидкого препарата (5 %-ая суспензия) и
текучей пасты (1 % суспензия), количество внесенного прилипателя в жидкий препарат
должно быть соответственно в 5 раз меньше, чем в текучую пасту. Концентрации ПААГ в
рабочих растворах, обеспечивающие оптимальную прилипаемость (табл. 9) и одновременно высокие титры спор, и антагонистическую активность (табл. 7, 8), составляют 0,010,015 об. %. Следовательно, с учетом принятых разведений при приготовлении рабочих
растворов для обеспечения высоких качественных показателей препарата требуется внесение Гисинара в количестве 0,1-0,3 об. % (для жидкой формы) и 0,5-1,5 об. % (для текучей пасты).
Таблица 7
Влияние стабилизирующих добавок на сохранность титра спор и антагонистической
активности жидкого биопрепарата
Диаметр зон задержки роста
фитопатогенов, мм
Титр, спор/мл
F.dendriticum
Варианты
P. syringae 3-3
Str.
исход- конеч- исход- конеч- исход- конечный
ный
ный
ный
ный
ный
9
9
Жидкий препарат (ж.) без добавок
36,6
26,4
39,6
28,0
8,9⋅10 4,6⋅10
9
ж. + NaCl (3 %)
-//31,8
-//33,4
-//6,4⋅10
9
ж. + NaCl (4 %)
-//35,8
-//37,4
-//8,6⋅10
9
ж. + NaCl (5 %)
-//35,6
-//37,2
-//8,6⋅10
9
ж. + NaCl (4 %) + ПААГ (0,05 %)
-//35,5
-//37,4
-//8,6⋅10
9
ж. + NaCl (4 %) + ПААГ (0,1 %)
-//35,7
-//37,5
-//8,6⋅10
9
ж. + NaCl (4 %) + ПААГ (0,2 %)
-//35,8
-//37,4
-//8,6⋅10
9
ж. + NaCl (4 %) + ПААГ (0,3 %)
-//35,6
-//37,0
-//8,6⋅10
9
ж. + NaCl (4 %) + ПААГ (0,4 %)
-//35,0
-//36,8
-//8,0⋅10
8
BY 12134 C1 2009.08.30
Таблица 8
Влияние стабилизирующих добавок на сохранность титра спор
и антагонистической активности биопрепарата в виде текучей пасты
Диаметр зон задержки роста
фитопатогенов2, мм
Титр, спор/мл
F. dendriticum
Варианты
P. syringae 3-3
Str.
исход- конеч- исход- конеч- исход- конечный
ный
ный
ный
ный
ный
10
10
Текучая паста (т.пс.) без добавок
37,5
28,4
43,5
30,8
4,0⋅10
2,5⋅10
10
т.пс. + NaCl (3 %)
-//-//34,8
-//35,7
2,9⋅10
10
т.пс. + NaCl (4 %)
-//-//36,7
-//41,1
3,8⋅10
10
т.пс. КЖ + NaCl (5 %)
-//-//36,6
-//40,8
3,7⋅10
10
т.пс. + NaCl (4 %) + ПААГ (0,25 %)
-//-//36,7
-//41,1
3,8⋅10
10
т.пс. + NaCl (4 %) + ПААГ (0,5 %)
-//-//36,6
-//41,1
3,8⋅10
10
т.пс. + NaCl (4 %) + ПААГ (1,0 %)
-//-//36,7
-//41,2
3,8⋅10
10
т.пс. + NaCl (4 %) + ПААГ (1,5 %)
-//-//36,5
-//41,0
3,7⋅10
10
т.пс. + NaCl (4 %) + ПААГ (2,0 %)
-//-//36,0
-//39,5
3,3⋅10
Таблица 9
Влияние концентрации промотора адгезии на прилипаемость препарата*
Удержание спор на стекле, %
Титр спор в смыве, n⋅108 /мл
Варианты1
через 1 ч через 2 ч через 24 ч через 1 ч через 2 ч через 24 ч
Рабочий раствор без
2,52
2,34
2,25
43,8
47,1
48,3
добавок (контроль)
Рабочий раствор +
1,08
0,99
0,99
52,3
54,1
55,0
ПААГ (0,0025 об. %)
Рабочий раствор +
1,35
1,17
0,99
70,7
73,0
77,3
ПААГ (0,005 об. %)
Рабочий раствор +
0,45
0,48
0,45
89,8
89,3
89,8
ПААГ (0,01 об. %)
Рабочий раствор +
0,5
0,5
0,45
89,0
88,7
88,0
ПААГ (0,015 об. %)
Рабочий раствор +
0,54
0,5
0,41
88,7
88,6
88,2
ПААГ (0,02 об. %)
* исходный титр спор в рабочем растворе препарата - 4,5-108.
Пример 4
Фитозащитное и ростстимулирующее действие препарата.
Изучение фитозащитного и ростстимулирующего действия биопрепарата в модельных
опытах с почвой позволило установить, что препарат в испытанных концентрациях активно подавляет развитие популяций фитопатогенных грибов и бактерий (табл. 10). К 10 суткам наблюдений титр фитопатогенного гриба F. culmorum F-55043 при обработке почвы
препаратом резко падает и, начиная с 20 суток, не обнаруживается в высевах из почвенных образцов на агаризованные среды. Численность P. syringae 181 также значительно
снижается к 10 суткам и остается низкой на протяжении всего контролируемого периода.
9
BY 12134 C1 2009.08.30
Таблица 10
Фитозащитное действие биопрепарата на развитие проростков ячменя
в модельных экосистемах
Масса проростков в пересчете
Концентрация
на 1 растение
Варианты
препарата, %
% к контролю
от веса почвы
мг
К1
К2
К3
Почва (К1)
12,9±0,6
100,0
Почва + F. culmorum F-55043 (K2)
12,1±0,4
93,8
100,0
Почва + P. syringae 181 (К3)
12,2±0,4
94,6
100,0
1
13,3±0,6
103,1
Почва + биопрепарат
2
14,1±0,6
109,3
Почва + биопрепарат + F. culmorum
1
13,9±0,6
107,8
114,9
F-55043
2
14,0±0,4
108,5
115,7
Почва + биопрепарат + P. syringae
1
13,5±0,3
104,7
110,7
181
2
15,9±0,8
123,3
130,3
Наряду со снижением инфекционного фона под действием препарата активизируется
развитие проростков ячменя. При этом средняя масса проростков увеличивается на 1625 % (семена, предварительно инфицированные F. culmorum F-55043) и 18-30 % (семена,
предварительно инфицированные Р. syringae 181).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить препарат комплексного действия с высокими антагонистической и ростстимулирующей активностями, не требующий
дополнительного внесения стимуляторов роста извне.
Пример 5
Биологическая эффективность препарата против возбудителя парши яблони.
Оценку биологической эффективности биопрепарата проводили в СПК "Узденский",
Минской области, на сорте яблони Чистотел в условиях интегрированной системы защиты яблони от парши.
Комплекс мероприятий по защите яблони от парши включал следующие варианты:
1. Эталон. 100 % химическая защита.
2. Опыт. Интегрированная система с двукратным использованием биопрепарата.
3. Контроль. Без обработок.
Площадь, занимаемая каждым вариантом, - 1 га. Количество обработок опытных
участков фунгицидами - 5. Приведенные результаты экспериментов представляют собой
усредненные величины 3-5 опытов. При статистической обработке результатов экспериментов проводили определение средних арифметических и их доверительных интервалов для уровня вероятности 95 %.
В период массового рассеивания конидий, со второй декады июля, распространение и
развитие парши в опытном варианте оставалось практически на уровне эталонного варианта на протяжении второй половины вегетационного сезона. А к концу вегетационного
периода развитие болезни на плодах в контрольном варианте достигло эпифитотии и составило 35,0 %, в то время как в вариантах интегрированной системы защиты и эталонном
не превысило умеренно-эпифитотийного уровня (табл. 11).
Таблица 11
Распространенность (Р) и развитие (R) парши на плодах яблони во второй половине
вегетационного сезона (СПК "Узденский", Минская обл., сорт Чистотел)
Р, %
R, %
Вариант
22.06.
9.08.
22.06.
9.08.
Эталон
56,9
80,8
13,4
25,6
Опыт
52,8
83,3
9,5
28,7
Контроль (без обработки)
62,6
95,8
15,9
35,0
10
BY 12134 C1 2009.08.30
Проведенные мероприятия позволили сохранить в опытном варианте 50 ц/га, в эталонном - 20,8 ц/га плодов (табл. 12).
Таблица 12
Хозяйственная эффективность применения биопрепарата против парши яблони
(СПК "Узденский", Минская область, сорт Чистотел)
Развитие парши на
Урожай,
Сохраненный
Вариант
плодах в урожае, %
Урожай, ц/га
кг/дерева
урожай, ц/га
8.09.
Эталон
27,3
34,5
172,3
20,8
Опыт
30,2
40,3
201,5
50,0
Контроль
43,8
30,3
151,5
0
(без обработки)
Кроме того, следует отметить, что пестицидная нагрузка в варианте интегрированной
защиты снизилась в два раза относительно эталонного варианта.
Пример 6
Биологическая эффективность препарата против возбудителей раковых заболеваний
плодовых культур.
Опыт по оценке биологической эффективности препарата в составе лечебных замазок
против возбудителей раковых заболеваний яблони был заложен в фенофазу зимнего покоя
яблони, до начала сокодвижения, в промышленном саду интенсивного типа СПК "Узденский" Минской области. Схема опыта:
1. Эталон. Азофос.
2. Опыт. Биопрепарат.
3. Контроль. Без лечения.
Раковые раны зачищали до здоровой древесины, замеряли их площадь на 50-ти модельных деревьях в каждом варианте и наносили препарат (опыт) или азофос (эталон), затем покрывали смесью глины и коровяка, взятых в равных соотношениях. Осенью
повторно замеряли площадь раковых ран и рассчитанные показатели использовали при
оценке биологической эффективности (табл. 13).
Таблица 13
Биологическая эффективность препарата против раковых заболеваний плодовых
(СПК "Узденский", Минская область, сорт Белорусское малиновое)
Площадь ран до Площадь ран
Биологическая
Площадь заживВариант
лечения (март), после лечения
эффективления, см2
2
2
см
(октябрь), см
ность,%
Эталон (азофос)
41,4
36,6
-4,8
11,6
Опыт
40,7
25,3
-15,4
37,8
Контроль
23,4
45,6
+22,2
0
Примечание.
"-" - уменьшение площади ран;
"+" - увеличение площади ран.
Согласно полученным данным, биологический препарат по эффективности значительно превосходит традиционно используемый для защиты яблоневых культур от рака
азофос.
Анализ представленных результатов свидетельствует о том, что предлагаемый способ
получения биологического препарата превосходит прототип по ряду показателей, а именно:
основой препарата является штамм бактерий с высокой антагонистической активностью, обладающий наряду с фитозащитным выраженным ростстимулирующим действием
и способностью утилизировать как сахаро-, так и крахмалсодержащие субстраты;
11
BY 12134 C1 2009.08.30
более высокий (практически в 2 раза) титр жизнеспособных клеток с выходом свободных термоустойчивых спор в популяции до 96-99 %, что обеспечивает лучшую сохранность препарата и высокую биологическую эффективность;
более низкая по сравнению с прототипом продолжительность ферментационного процесса (36-42 ч вместо 48 ч);
более низкие затраты на производство биопрепарата за счет сокращения процесса ферментации и отсутствия дополнительных расходов на введение стимуляторов роста;
широкий спектр антифунгального и антибактериального действия препарата, способного активно подавлять развитие наиболее вредоносных возбудителей болезней плодовоягодных культур - парши яблони, бактериального и грибного рака плодовых культур, а
также серой гнили ягодников;
высокие адгезивные свойства и стабильность препарата за счет введения в его состав
гидрогеля и NaCl;
технологичность использования предлагаемого биопестицида, обусловленная наличием двух товарных форм препарата - жидкой (для преимущественного применения в
хозяйствах, расположенных в непосредственной близости от завода-изготовителя) и пастообразной, обеспечивающей более длительный срок хранения и возможность транспортировки препарата на большие расстояния.
Источники информации:
1. Патент RU 1805849, МПК А 01N 63/00, С 12N 1/20, 1993.
2. Патент RU 2130261, МПК А 01N 63/00, С 12N 1/20//(С 12N 1/20, С 12R 1:38), 1999.
3. Патент RU 2019966, МПК А 01N 63/00, 1994.
4. Патент RU 2081167, МПК С 12N 1/20//(С 12N 1/20, С 12R 1:125)A 01 N 63/00, 1997
(аналог).
5. Патент RU 2099947, МПК А 01N 63/00, С 12N 1/20//(С 12N 1/20, С 12R 1:125), 1997
(аналог).
6. Патент RU 2129375, МПК А 01N 63/00, С 12N 1/20//(С 12N 1/20, С 12R 1:125), 1999
(аналог).
7. Патент RU 2201678, МПК А 01N 63/00, С 12N 1/20//(С 12N 1/20, С 12R 1:125), 2003
(аналог).
8. Патент RU 2128914, МПК А 01N 63/00, С 12N 1/20//(С 12N 1/20, С 12R 1:125), 1999
(аналог).
9. Патент RU 2216173, МПК А 01N 63/00, А 01С 1/06//(С 12N 1/20, С 12R 1:07), 2003
(прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
12
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
188 Кб
Теги
by12134, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа