close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12277

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 12277
(13) C1
(19)
(46) 2009.08.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
C 12N 15/64
(54) ЧЕЛНОЧНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ
В БАКТЕРИЯХ РОДА PSEUDOMONAS И ESCHERICHIA COLI
И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ
BY 12277 C1 2009.08.30
(21) Номер заявки: a 20071525
(22) 2007.12.10
(43) 2008.08.30
(71) Заявитель: Белорусский государственный университет (BY)
(72) Авторы: Ковальчук Константин Валентинович; Василенко Светлана
Леонидовна; Титок Марина Алексеевна (BY)
(73) Патентообладатель: Белорусский государственный университет (BY)
(56) PRIDMORE R.D. // Gene. - 1987. V. 56. - P. 309-312.
SCHÄFER A. et al. // Gene. - 1994. V. 145. - No. 1. - P. 69-73.
LEE B. U. et al. // J. Microbiology. 2006. - V. 44. - No. 6. - P. 671-673.
OLEKHNOVICH I.N. et al. // Gene. 1994. - V. 140. - No. 1. - P. 63-65.
OLEKHNOVICH I.N. et al. // Genetika. 1994. - V. 30. - No. 2. - P. 176-180.
(57)
1. Челночный вектор рКМ размером 3690 п.н. для молекулярного клонирования в бактериях рода Pseudomonas и Escherichia coli, содержащий репликон: rep-ген и oriV-сайт
плазмиды BS267 группы несовместимости Р-9, ColE1-репликон плазмиды MB1ori, маркер
канамицинрезистентности KmR и полилинкер с единичными сайтами для клонирования
EcoR I, Apo I, Sac I, Ecl136 II, Ban II, Kpn I, Acc65 I, Xba I, Sal I, Hinc II, Acc I, BspM I, Sph I,
Hind III, расположенный в lacZα-гене, позволяющий осуществлять встраивание чужеродного фрагмента ДНК размером 8000 п.н., вызывая инактивацию lacZα-гена.
2. Способ конструирования челночного вектора рКМ по п. 1, заключающийся в том,
что ДНК плазмиды К18 гидролизуют рестриктазой VspI, обрабатывают фрагментом Кленова и соединяют ДНК-лигазой с амплифицированной в полимеразной цепной реакции
последовательностью репликона плазмиды BS267, обработанной фрагментом Кленова.
BY 12277 C1 2009.08.30
Предлагаемое техническое решение относится к химии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в биотехнологии для клонирования чужеродных молекул
ДНК в системе грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas - Е. coli.
Для молекулярного клонирования в бактериях рода Pseudomonas создано два типа
челночных векторов. Все они способны поддерживаться в бактериях Е. coli (за счет repобластей плазмид pBR322, pUC19, p15, pMZ7 или рМK16) и отличаются типом репликона, обеспечивающего наследование в клетках Pseudomonas [1-10].
Первый тип векторов создан на основе плазмиды RSF1010 группы несовместимости
Р-4 [1-7]. Несмотря на присутствие репликона широкого круга хозяев, некоторые из них
не способны передаваться и наследоваться в клетках бактерий Pseudomonas [4-6]. Кроме
того, все они характеризуются большими размерами (от 11,6 до 16,9 т.п.н.), что осложняет
работу с ними при постановке экспериментов in vitro, особенно со встроенными фрагментами чужеродной ДНК значительного размера. Для введения данного типа векторов в
клетки бактерий Pseudomonas в основном применялся метод конъюгации с использованием мобилизующей плазмиды группы несовместимости IncP-1, которая передается совместно с векторными молекулами в клетки реципиентов и затрудняет дальнейший анализ
трансконъюгантного потомства. Недостатком всех векторов данного типа является принцип отбора вставок чужеродных фрагментов ДНК, основанный на инактивации маркеров
антибиотикорезистентности. Многие сайты, пригодные для клонирования, не могут быть
использованы, поскольку не обеспечивают получение конструкций с искомым фенотипом.
Второй тип челночных векторов создан на основе репликонов узкого круга хозяев [8-10].
Основным недостатком этих векторных систем является способность их наследоваться
только в одном виде псевдомонад. Например, вектор pJH1 размером 4,87 т.п.н., содержащий rep-область плазмиды pRO1614, имеет удобную систему отбора вставок (инактивация
lacZ-гена), но способен наследоваться только в бактериях P. putida, в клетки которых может вводиться путем трансформации или электропорации (не содержит mob-сайта) [9].
Задачей изобретения является создание челночного вектора для молекулярного клонирования в бактериях рода Pseudomonas и Е. coli, позволяющего клонировать в указанных организмах фрагменты чужеродной ДНК, размером более 8 т.п.н., и содержащего
систему, позволяющую вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в
клетках Е. coli.
Технический результат состоит в конструировании челночного вектора, содержащего
ColE1-репликон, обеспечивающий наследование в бактериях Е. coli, и rep-область плазмиды широкого круга хозяев pBS267 группы несовместимости Р-9, обеспечивающей поддержание в клетках бактерий рода Pseudomonas.
Поставленная задача решается тем, что с помощью генно-инженерных манипуляций
конструируют вектор для молекулярного клонирования, способный эффективно вводиться и поддерживаться в бактериях рода Pseudomonas и Е. coli.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем,
что в функционально незначимую область вектора рК18 была осуществлена вставка repобласти плазмиды pBS267 группы несовместимости Р-9, обеспечивающая поддержание
векторной молекулы в широком круге бактерий рода Pseudomonas.
Сущность изобретения поясняется на фигуре.
На фигуре представлена схема молекулярно-генетической организации предлагаемого
вектора для молекулярного клонирования рКМ.
Предлагаемый вектор - вектор рКМ размером 3690 п.н. для молекулярного клонирования
в бактериях рода Pseudomonas и Escherichia coli, содержащий репликон плазмиды pBS267
(rep-ген и oriV-сайт) группы несовместимости Р-9, ColE1-репликон (pMB1ori), маркер канамицинрезистентности KmR и полилинкер с единичными сайтами для клонирования
EcoR I, Apo I, Sac I, Ecl136 II, Ban II, Kpn I, Acc65 I, Xba I, Sal I, Hinc II, Асc I, BspM I, Sph I,
Hind III), расположенный в lacZα-гене, позволяющий осуществлять встраивание чужеродных фрагментов ДНК размером более 8 000 п.н., вызывая инактивацию lacZα-гена.
2
BY 12277 C1 2009.08.30
Пример 1
В качестве базовой конструкции, обеспечивающей наследование вектора в системе
Е. coli, используют многокопийную плазмиду рК18 (размером 2661 п.н.) [11], содержащую ColE1-репликон, маркер канамицинрезистентности (KmR), полилинкер (MCS) с единичными сайтами для клонирования: EcoR I, Apo I, Sac I, Ecl136 II, Ban II, Kpn I, Acc65 I,
Xba I, Sal I, Hinc II, Acc I, BspM I, Sph I, Hind III, расположенный непосредственно в
lacZα-гене, что позволяет осуществлять встраивание чужеродных фрагментов ДНК, вызывая инактивацию lacZα-гена, и может эффективно вводиться в клетки бактерий Е. coli и
Pseudomonas путем трансформации (электропорации).
В качестве rep-области, обеспечивающей наследование вектора рКМ в бактериях Pseudomonas, используют фрагмент плазмиды pBS267 [13] размером 1088 п.н., содержащий
rep-ген и oriV-сайт инициации вегетативной репликации.
В полимеразной цепной реакции с использованием набора "Takara" (Япония) амплифицируют rep-область плазмиды pBS267 размером 1088 п.н. с помощью праймеров, содержащих на 5'-концах сайты узнавания для Sal I рестриктазы, fRep-ori-Sal I (5'-ACG CGT
CGA CAA CGT GAT GCG TAA TCG TG -3') и rRep-ori-Sal I: (5'-ACG CGT CGA CCC TCA
GTT ACC GTG GG-3') при режиме амплификации: 94 °С - 5 мин (1 цикл); 94 °С - 30 сек,
50 °С - 30 сек, 68 °С - 1,5 мин (30 циклов); 68 °С - 10 мин (1 цикл). Продукт амплификации встраивают в вектор, предназначенный для клонирования продуктов амплификации pGEM-T Easy. Встроенную последовательность ДНК вырезают из вектора pGEM-T
Easy с помощью рестриктазы Sal I с последующей обработкой фрагментом Кленова и лигируют с вектором рK18, предварительно обработанный сначала рестриктазой Vsp I, а затем фрагментом Кленова. Рестриктаза Vsp I узнает два сайта в векторе рK18 в
функционально незначимой области, обеспечивая образование делеции размером 59 п.н.
Лигированной смесью трансформируют бактерии P. putida KT2442, осуществляя отбор
плазмидосодержащих бактерий на среде с канамицином. Из отобранных клонов выделяют
плазмидную ДНК [14], которой трансформируют бактерии Е. coli XL-1 Blue [15]. Отобранную таким образом конструкцию называют вектор рКМ.
Размер вектора рКМ составляет 3690 п.н. В состав вектора рКМ входит: ColE1-репликон, rep-область плазмиды pBS267, маркер устойчивости к канамицину, полилинкер с 14
единичными сайтами, расположенный в lacZα-гене, позволяющий осуществлять встраивание
чужеродных фрагментов ДНК, вызывая инактивацию lacZα-гена. Полученный вектор
пригоден для молекулярного клонирования в клетках Е. coli и в бактериях рода Pseudomonas. Емкость вектора составляет более 8,0 т.п.н. Спектр хозяев: Е. coli и бактерии рода
Pseudomonas (P. putida, P. mendocina, P. aeruginosa, P. stutzeri, P. chlororaphis, P. marginata,
P. aureofaciens, P. pseudoalcaligenes, P. caryophylli, P. fluorescens, P. palleroni, P. aurantiaca).
Пример 2
При введении вектора рКМ в клетки Е. coli путем трансформации частота возникновения
трансформантов составляла 106 клеток на 1 мкг ДНК, а в бактерии рода Pseudomonas (использовали метод электропорации [16]) - от 103 до 107 клеток на 1 мкг ДНК.
Пример 3
Клонирование фрагмента хромосомной ДНК бактерий Е. coli XL-1 Blue в клетках
Е. coli и бактериях рода Pseudomonas. Хромосомную ДНК бактерий штамма Е. coli XL-1
Blue, обработанную рестриктазой Kpn I, лигировали с вектором рКМ, предварительно линеаризированным по сайту Kpn I. Лигированной смесью трансформировали клетки Е. coli
XL-1 Blue. Селекцию вели на среде, содержащей X-Gal, IPTG, канамицин в конечной концентрации 25 мкг/мл. Полученные конструкции со вставками размером 3,8 т.п.н. и более
8 т.п.н. сохраняли структурную стабильность при наследовании в клетках Е. coli и бактериях рода Pseudomonas (проверено в штаммах P. putida KT2442, P. mendocina PM46,
P. aeruginosa ML4600, P. chlororaphis В1391, P. marginata ТВ, P. aureofaciens В1393). При
этом частота трансформации векторной конструкции, несущей вставки разного размера,
соответствовала таковой исходного вектора рКМ.
3
BY 12277 C1 2009.08.30
Источники информации:
1. BARTH Р.Т. et al. Plenum Publ. Co., 1981. - P. 439-448.
2. BAGDASARIAN M. et al. // Gene. - 1981. - V. 16. - No. 1-3. - P. 237-247.
3. GAUTIER F. et al. // Mol. Gen. Genet. - 1980. - V. 178. - No. 2. - P. 375-380.
4. WOOD D.O. et al. // J. Bacteriol. - 1981. - V. 145. - No. 3. - P. 1448-1451.
5. BAGDASARIAN M. Elsevier/North Holland, Amsterdam, 1979. - P. 411- 422.
6. TSYGANKOV Yu.D. et al. // Plasmid. - 1985. - V. 14. - No. 2. - P. 118-125.
7. ЦЫГАНКОВ Ю.Д. и др. // Генетика. - 1986. - № 11. - С. 2606-2619.
8. BOVIN R. et al. // Curr. Microbiol. - 1994. - V. 28. - No. 1. - P. 41-47.
9. LEE B.U. et al. // J. Microbiol. - 2006. - V. 44. - No. 6. - P. 671-673.
10. OLEKHNOVICH I.N. et al. // Gene. - 1994. - V. 140. - No. 1. - P. 63-65.
11. PRIDMORE R.D. // Gene. - 1987. - V. 56. - P. 309-312.
12. SCHFER A. et al. // Gene. - 1994. - V. 145. - P. 69-73.
13. ЕСИКОВА Т.З. и др. // Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. - 1990. - № 4. - С. 25-28.
14. BIRNBOIM H.L. et al. // Nucl. Acids. Res. - 1979. - V. 7. - No. 6. - P. 1513-23.
15. МАНИАТИС Т. и др. - М.: Мир, 1984. - 480 с.
16. DENNIS J.J. et al. // Humana Press Inc. - 1995. - P. 125-132.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
85 Кб
Теги
by12277, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа