close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12311

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.08.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61L 2/16
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУЛИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ
ДЕЗИНФЕКТАНТА
(21) Номер заявки: a 20060805
(22) 2006.07.31
(43) 2008.04.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Научно-исследовательский
институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь (BY)
(72) Авторы: Гудков Владимир Георгиевич; Плотникова Ксения Юрьевна;
Виринская Анна Сергеевна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и
микробиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь
(BY)
BY 12311 C1 2009.08.30
BY (11) 12311
(13) C1
(19)
(56) ИВАНОВА Е.Б. и др. Эпидемиология и
инфекционные болезни.- 2003.- № 5.С. 56-57.
НОСИК Н.Н. и др. Сборник опубликованных материалов по актуальным
вопросам дезинфектологии и применению дезинфекционных средств серии "ВЕЛТ".- Вып. 2.- М., 2005.- С. 5-12.
ТИТОВ Л.П. и др. Вирусные гепатиты
и ВИЧ-инфекция. Эпидемиология, диагностика, профилактика, лечение. Вторая международная конференция.Минск, 1999.- С. 70.
ТИТОВ Л.П. и др. Актуальные проблемы профилактики внутрибольничных инфекций, дезинфекции и стерилизации. Тез. докл. Республиканской
научно-практической конференции.Минск, 1997.- С. 53-54.
(57)
Способ определения вирулицидного действия дезинфектанта, включающий обработку
тест-вирусов испытуемым дезинфектантом и сравнительную оценку содержания жизнеспособных тест-вирусов до и после обработки дезинфектантом, отличающийся тем, что
содержание жизнеспособных тест-вирусов оценивают по образованию иммунного комплекса при специфической иммуносорбции тест-вирусов и детектированию методом полимеразной цепной реакции генома тест-вирусов в составе иммунного комплекса, причем
при уменьшении содержания жизнеспособных тест-вирусов после обработки дезинфектантом
более чем в 10 раз, считают, что дезинфектант обладает вирулицидным действием.
BY 12311 C1 2009.08.30
Изобретение относится к микробиологии и дезинфектологии и может быть использовано для определения эффективности дезинфектантов в отношении вирусов.
Дезинфекция - процесс устранения болезнетворных микроорганизмов с зараженных
инструментов, одежды или окружающих предметов путем оказания физического или химического воздействия на них (использования дезинфицирующих средств) (Медицинский
словарь (Oxford), 1999, с. 269). Методы исследования вирулицидных свойств многообразны и зависят от назначения конкретного дезсредства. Суть их состоит в следующем. Вирус определенной концентрации обрабатывают дезинифектантом, после чего
производится оценка вирулицидного действия дезсредства. Эффективность дезинфектанта
определяется кратностью уменьшения количества жизнеспособных микроорганизмов и
скоростью их отмирания после применения того или иного дезинфицирующего средства
(Черкасский Б.Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека. Справочник эпидемиолога, 1994, с. 95).
Известен способ определения вирулицидного действия дезинфектантов с помощью
метода культуры клеток (Исследование вирулицидных свойств дезинфицирующих и антисептических препаратов, методические рекомендации, 1996 с. 15-18). Принцип определения вирулицидного действия дезинфектантов заключается в сравнении инфекционной
активности исходной вируссодержащей взвеси с инфекционной активностью той же вируссодержащей взвеси после ее обработки испытуемыми дезинфектантами. С этой целью
после обработки исходной вирусной взвеси дезинфектантом готовят параллельные последовательные разведения суспензии вируса, обработанной дезинфектантом и исходной
взвеси вируса на охлажденной культуральной среде. Затем этими разведениями инфицируют культуры клеток. Инфекционность вирусной взвеси определяется макро- или микрометодом, по образованию бляшек, цитопатическому эффекту или другим показателям
размножения вируса.
Недостатком известного способа является то, что он требует индивидуальных условий
индикации возбудителя: различных культур клеток, специальных условий культивирования, состава питательных сред. Кроме того, тестирование дезинфектантов в отношении
многих эпидемиологически значимых вирусов практически невозможно из-за их некультивируемости в культуре клеток при отсутствии или недоступности реальных биологических моделей. Так, например, к некультивируемым относится вирус гепатита В, а
экспериментально эта инфекция может быть воспроизведена только на шимпанзе, что для
целей тестирования дезинфектантов практически неприемлемо по многим обстоятельствам [Шандала М.Г. Эпидемиология и инфекционные болезни.- № 2.- 2005.- С. 42].
В тех случаях, когда пермиссивная экспериментальная система вируса отсутствует
(вирус не адаптирован к культуре клеток), эффективность дезинфектанта определяют по
потере или снижению содержания антигенов или ДНК (РНК) вируса [Исследование вирулицидных свойств дезинфицирующих и антисептических препаратов. Методические рекомендации, 1996.- С. 39].
Известен способ определения вирулицидного действия дезинфектантов с помощью
иммуноферментного анализа (ИФА) [Исследование вирулицидных свойств дезинфицирующих и антисептических препаратов. Методические рекомендации, 1996.- С. 18]. Антигенную активность испытуемых и контрольных проб определяют с помощью стандартных
коммерческих иммуноферментных тест-систем.
Однако на Межотраслевой международной конференции в 1997 году было единогласно
решено, что тестирование уменьшения антигенности HbsAg не может быть принято как основание для регистрации, сертификации и разрешения к продаже и применению дезинфектантов [Шандала М.Г. Эпидемиология и инфекционные болезни.- № 2.- 2005.- С. 42]. На
примере вируса гепатита А также показано, что после обработки вируса гепатита А дезинфектантами (в частности, формалином), нарушающими целостность вирусной оболочки и приводящими к разрушению его нуклеиновой кислоты и потере инфекционной
2
BY 12311 C1 2009.08.30
активности, в этой пробе методом ИФА определяются антигены вируса, так как подобное
воздействие сохраняет эпитопы антигенов, необходимые для их взаимодействия с паратопами специфических иммуноглобулинов. Обработанный таким образом вирус уже не является инфекционным, но сохраняет антигенные свойства. Таким образом, в этом и
подобных случаях адекватно определить вирулицидность испытуемых дезинфектантов с
помощью ИФА невозможно.
Известен способ определения вирулицидного действия дезинфектантов с помощью
полимеразной цепной реакции (ПЦР) - прототип [Иванова Е.Б. и др. Эпидемиология и
инфекционные болезни.- № 5.- 2003.- С. 56-57]. Суть способа в следующем. Готовится
суспензия тест-вируса (вирус гепатита В) и осуществляется контаминация тест-объектов
взвесью тест-вируса; затем контаминированные тест-вирусом тест-объекты обрабатываются испытуемым дезинфектантом согласно инструкции по применению. После экспозиции с дезинфектантом берутся пробы с обработанных дезинфектантом и необработанных
им контаминированных объектов. Взятые пробы исследуются на содержание тест-вирусов
методом ПЦР. На основании полученных результатов определяется наличие вирулицидного действия у испытуемого дезинфектанта.
Недостатком этого способа является то, что с его помощью невозможно адекватно определить наличие вирулицидных свойств у дезинфектантов, обладающих реальной способностью инактивировать вирус, но не разрушающих его геном. Так, например,
инкубирование вируса с 70 % этанолом приводит к денатурации белковых структур вируса, в т.ч. антигенов, однако РНК, не растворяющаяся в спиртах, сохраняет свою целостность. В результате традиционная ПЦР дает положительный результат, выявляя
неповрежденный геном инактивированного возбудителя. Подобная картина наблюдается
при пастеризации и обработке вирусов гепатитов В и С, полиовирусов растворителями и
детергентами [Hilfenhaus J. et al. Transfusion.- 1997 Sep.- No. 37(9).- P. 40].
Таким образом, два последних метода прямо не отражают инфекционную активность
вируса и результаты определения вирулицидных свойств дезинфектантов с их помощью
могут не соответствовать истинной картине.
Задачей, решаемой изобретением, является разработка способа определения вирулицидного действия дезинфектантов, не требующего использования культур клеток и пригодного для тестирования инфекционных частиц (вирионов) некультивируемых вирусов
путем индикации инфекционного вируса, а не его отдельных структурных компонентов,
что, как было показано выше, вполне вероятно при исследованиях традиционными методами ИФА и ПЦР.
Результат достигается в способе определения вирулицидного действия дезинфектанта,
включающем обработку тест-вирусов испытуемым дезинфектантом и сравнительную
оценку содержания жизнеспособных тест-вирусов до и после обработки дезинфектантом.
Содержание жизнеспособных тест-вирусов оценивают по образованию иммунного комплекса при специфической иммуносорбции тест-вирусов и детектированию методом полимеразной цепной реакции генома тест-вирусов в составе иммунного комплекса, причем
при уменьшении содержания жизнеспособных тест-вирусов после обработки дезинфектантом
более чем в 10 раз, считают, что дезинфектант обладает вирулицидным действием.
Результат выражается в одновременной индикации возбудителя сразу по двум основным маркерам (антигену и геному), имеющим различную химическую природу, биологические свойства и обладающим различной чувствительностью к инактивирующим вирус
агентам. ПЦР с иммунологическим компонентом (специфическая иммуносорбция вируса
и последующее детектирование его генома в составе иммунного комплекса методом
ПЦР), сочетая в себе компоненты иммунологической реакции и амплификации генов, выявляет только полноценные инфекционные вирионы. При обработке веществами, разрушающими нуклеиновую кислоту, сорбированные на твердой фазе специфические
антитела связывают антиген, но последующая ПЦР дает отрицательный результат в связи
3
BY 12311 C1 2009.08.30
с отсутствием субстрата (РНК). Вещества, воздействующие только на антиген, нарушают
его взаимодействие с иммуноглобулинами, свободная РНК удаляется на стадии отмывок,
что препятствует появлению ложноположительных результатов после постановки обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.
Примеры осуществления изобретения.
Исследуемый дезинфектант разводят на бидистиллированной воде. При разведении
необходимо учитывать, что исследуемая концентрация дезинфектанта должна содержаться в смести дезинфектант + суспензия вируса. К одной части суспензии, содержащей вирус в высокой концентрации, добавляют восемь частей разведенного дезинфектанта в
концентрации в 1,25 раз выше, чем конечная (исследуемая). Смесь выдерживают при
комнатной температуре необходимое время в соответствии с инструкцией по применению
дезинфектанта. По завершении периода экспозиции с целью удаления дезинфектанта раствор разводят в 1000 раз. Инфекционность смеси проверяют путем постановки ПЦР с иммунологическим компонентом. В основе этого метода лежит связывание вируса
сорбированными на твердой фазе специфическими антителами. Последующие стадия отмывки позволяет удалить ингибиторы, а индикация по двум маркерам (антиген и геном) обнаружить инфекционный вирус. Эффективность дезинфектантов определяется кратностью уменьшения количества жизнеспособных микроорганизмов и скоростью их отмирания после применения того или иного дезинфицирующего средства. Показатели
эффективности задаются методическими рекомендациями, утвержденными Минздравом в
качестве официального документа.
На твердой подложке, например в лунках планшета для иммунологических реакций,
сорбируют специфические антитела к тест-вирусу. Затем в лунки вносят вируссодержащую суспензию и выдерживают время, необходимое для образования иммунного
комплекса вируса с антителами. Полученный иммунный комплекс отмывают несколько
раз и обрабатывают для высвобождения вирусной нуклеиновой детектируют в полимеразной цепной реакции. В результате детектируются только вирионы, содержащие вирусные белки и вирусную нуклеиновую кислоту, которые в данном случае существуют в виде
нуклеопротеинового комплекса, что является неотъемлемым признаком полноценных инфекционных вирусных частиц.
При детекции вируса методом иммуноферментного анализа выявляются только вирусные белки (вне зависимости от того, связаны они с нуклеиновой кислотой или нет), а
при использовании традиционной полимеразной цепной реакции выявляется исключительно вирусная нуклеиновая кислота, которая может и не находиться в нуклеопротеиновом комплексе с вирусными белками. При этом в обоих случаях вирус может быть
инактивирован.
Отдельно ни белок, ни нуклеиновая кислота вируса не обладают инфекционной активностью в обычных условиях, и по изменению их концентрации невозможно судить об
эффективности дезинфектантов.
Осуществление предлагаемого способа возможно в любой лаборатории, имеющей оснащение (реагенты и оборудование), необходимое для его проведения.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
87 Кб
Теги
патент, by12311
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа