close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12409

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/02
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИНИМАЛЬНОЙ И МАКСИМАЛЬНОЙ
ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ХИМИЧЕСКОГО
ВЕЩЕСТВА ИЛИ СМЕСИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
(21) Номер заявки: a 20071577
(22) 2007.12.19
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
(72) Авторы: Дудчик Наталья Владимировна; Соколов Сергей Михайлович;
Мельникова Людмила Александровна (BY)
BY 12409 C1 2009.10.30
BY (11) 12409
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр гигиены" (BY)
(56) ФОНШТЕЙН Л.М. и др. Методы первичного загрязнения генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем.
Методическое указание.- Москва, 1985.C. 20-23.
RU 2105977 С1, 1998.
SU 1784139 А1, 1992.
RU 2131925 С1, 1999.
(57)
Способ определения минимальной и максимальной ДНК-повреждающих концентраций химического вещества или смеси химических веществ, включающий оценку эффекта
химического вещества или смеси на рост в жидкой питательной среде бактерий Escherichia
coli дикого и мутантного по репарации ДНК штаммов, отличающийся тем, что рост бактерий оценивают импедиметрически по регистрации показателя времени детекции DT,
при этом концентрацию химического вещества или смеси веществ, которая вызывает наименьшее увеличение показателя DT при росте мутантного штамма по сравнению с показателем DT при росте дикого штамма, определяют как минимальную ДНК-повреждающую,
а концентрацию химического вещества или смеси веществ, которая вызывает наибольшее
увеличение показателя DT при росте мутантного штамма по сравнению с показателем DT
при росте дикого штамма, - как максимальную ДНК-повреждающую.
Изобретение относится к разделу токсикологии и экологии.
Известен способ оценки ДНК-повреждающего действия химических соединений, заключающийся в том, что учитывают рост суспензии бактерий Escherichia coli дикого типа
(штамм 1) и штаммов, имеющих мутации в генах pol А и rеc А, контролирующих различные этапы репарационных процессов в бактериальной клетке (штамм 2). При наличии
ДНК-повреждающего эффекта исследуемого вещества при определенных его концентрациях рост мутантных бактерий не регистрируется, тогда как бактерии дикого типа при
данных концентрациях агента проявляют нормальную способность к росту, при этом для
визуализации роста бактерий в питательную среду добавляют раствор индикатора бромкрезолового пурпурного и по изменению его окраски от голубого к желтому судят о росте
бактерий и о наличии ДНК-повреждающего эффекта химического вещества [1].
BY 12409 C1 2009.10.30
Указанный способ является прототипом по отношению к заявленному. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является то, что осуществляют параллельное внесение испытуемых образцов в питательную среду, содержащую суспензию
штамма 1, и в такую же по составу среду, содержащую суспензию штамма 2 в той же концентрации, что и штамм 1, проводят их совместное культивирование при оптимальной
температуре, оценивают рост микроорганизмов с последующей обработкой полученных
данных. Однако визуальный принцип детекции роста микроорганизмов, используемый в
способе-прототипе, затрудняет анализ темноокрашенных химических веществ и их смесей, а также ограничивает проведение анализа химических веществ, имеющих сильный
кислотно-щелочной потенциал, т.к. в этом случае маскируются изменения окраски применяемого индикатора. Кроме того, способ-прототип обладает низкой чувствительностью,
что приводит к необходимости длительного, до 18 часов, времени проведения испытаний.
Задачей заявленного изобретения является разработка высокоэффективного экспрессспособа определения минимальной и максимальной ДНК-повреждающих концентраций
химического вещества или смеси химических веществ, позволяющего тестировать темноокрашенные химические вещества и/или их смеси, химические вещества с сильным кислотно-щелочным потенциалом.
Поставленная задача достигается следующим образом.
Предложен способ определения минимальной и максимальной ДНК-повреждающих концентраций химического вещества или смеси химических веществ, включающий оценку эффекта химического вещества или смеси химических веществ на рост в жидкой питательной
среде бактерий Escherichia coli дикого и мутантного по репарации ДНК штаммов, при этом
рост бактерий оценивают импедиметрически по регистрации показателя времени детекции
DT, при этом концентрацию химического вещества или смеси веществ, которая вызывает
наименьшее увеличение показателя DT, определяют как минимальную ДНК-повреждающую,
а концентрацию химического вещества или смеси веществ, которая вызывает наибольшее
увеличение показателя DT при росте мутантного штамма по сравнению с показателем DT при
росте дикого штамма, - как максимальную ДНК-повреждающую.
Такой прием позволяет повысить чувствительность способа за счет того, что осуществляется импедиметрическая регистрация активной проводимости питательной среды, а
это позволяет провести детекцию роста штаммов в течение 3-6 часов и определить показатель времени детекции для среды с суспензией штамма 1 и для среды с суспензией штамма 2, а также расширить ассортимент исследуемых химических веществ и/или их смесей,
включая темноокрашенные, а также химические вещества с сильным кислотно-щелочным
потенциалом.
Пример выполнения.
Требуется определить степень ДНК-повреждающего действия трех образцов:
1 образец - химическое вещество 1;
2 образец - химическое вещество 2;
3 образец - химическое вещество 3.
В качестве питательной среды при проведении исследования используют среду следующего состава (на 1000,0 мл дистиллированной воды):
1
Хлористый аммоний
1,0 г
2
Калий фосфорнокислый однозамещенный
3,0 г
3
Натрий фосфорнокислый двузамещенный
6,0 г
4
Натрий хлористый
0,5 г
рН 7,2-7,4.
Стерилизация 121 °С в течение 30 мин.
После стерилизации добавляют 10 мл 20 % раствора глюкозы.
Используют штаммы Escherichia coli дикого типа (штамм 1), а также мутантный по
репарации штамм (штамм 2).
2
BY 12409 C1 2009.10.30
Для приготовления ночных культур бактерий культуры с косяков мясопептонного агара петлей высевают в среду предложенного состава. Перед опытом готовят инокулят, для
чего ночную культуру разводят примерно в 100 раз средой, доводя титр бактерий до
5-7×106 клеток/мл.
Приготовленную среду разливают в ячейки анализатора, инокулируют штаммом 1, а
также штаммом 2, вносят исследуемые.образцы в возрастающих концентрациях и инкубируют в термоинкубаторе при 37 °С в течение 3-10 часов.
Получены следующие результаты (таблица).
Результаты оценки ДНК-повреждающего действия изучаемых веществ предлагаемым экспресс-способом
Время Время
детек- детекОценка минимальной и максимальной поврежКонцентрация
ции
ции
дающей концентрации
штамма штамма
1
2
Вещество 1
Концентрация 1
Вещество 1 в концентрации 1 не вызывает
3,0
3,0
ДНК-повреждающего эффекта
Концентрация 2
Концентрация 2 является минимальной ДНК3,0
3,1
повреждающей концентрацией
Концентрация 3
Концентрация 3 является максимальной ДНК3,0
3,7
повреждающей концентрацией
Концентрация 4
Увеличение концентрации вещества не приводит
3,0
3,7
к увеличению ДНК-повреждающего эффекта
Вещество 2
Концентрация 1
Вещество 2 в концентрации 1 не вызывает
3,0
3,0
ДНК-повреждающего эффекта
Концентрация 2
Вещество 2 в концентрации 2 не вызывает
3,0
3,0
ДНК-повреждающего эффекта
Концентрация 3
Вещество 2 в концентрации 3 не вызывает
3,0
3,0
ДНК-повреждающего эффекта
Концентрация 4
Вещество 2 в концентрации 4 не вызывает
3,0
3,0
ДНК-повреждающего эффекта
Вещество 3
Концентрация 1
Концентрация 1 является минимальной ДНК3,0
3,1
повреждающей концентрацией
Концентрация 2
Концентрация 2 является максимальной ДНК3,0
6,0
повреждающей концентрацией
Концентрация 3
Увеличение концентрации вещества не приводит
3,0
6,0
к увеличению ДНК-повреждающего эффекта
Концентрация 4
Увеличение концентрации вещества не приводит
3,0
6,0
к увеличению ДНК-повреждающего эффекта
Параллельно было проведено определение ДНК-повреждающего действия трех химических веществ по способу-прототипу. Получены следующие результаты. Для определения ДНК-повреждающего действия образца № 1 потребовалось 18 часов. ДНКповреждающее действие образцов № 2 и № 3 не могло быть определено с помощью способа-прототипа, т.к. образец № 2 обладал сильным кислотно-основным потенциалом, а
образец № 3 представлял собой темноокрашенную смесь, что приводило к маскирующему
эффекту работы индикатора.
3
BY 12409 C1 2009.10.30
Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается
в точной количественной оценке ДНК-повреждающего действия нейтральных химических
веществ, а также обладающих сильным кислотно-основным потенциалом; светлоокрашенных и темноокрашенных, что дает возможность определить критерии для их количественной оценки. Способ позволяет сократить время определения с 18 часов до 3,06,0 часов, что дает основание рекомендовать его в качестве экспресс-метода.
Источники информации:
1. ФОНШТЕЙН Л.М. и др. Методы первичного выявления генетической активности
загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Методические указания.Москва, 1985.- С. 20-23.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
91 Кб
Теги
патент, by12409
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа