close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12432

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07K 5/00
C 07K 1/00
ТЕТРАПЕПТИД, ИНГИБИРУЮЩИЙ СВЯЗЫВАНИЕ
АУТОАНТИТЕЛ С ТИРЕОИДНОЙ ПЕРОКСИДАЗОЙ ЧЕЛОВЕКА, И
СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
(21) Номер заявки: a 20080604
(22) 2008.05.13
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Голубович Владимир Петрович; Шутова Ирина Владимировна; Грибовская Ольга Викторовна;
Мартинович Вера Павловна; Цыганова Олеся Васильевна (BY)
BY 12432 C1 2009.10.30
BY (11) 12432
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) BY 7820 C1, 2006.
RU 2203286 C2, 2003.
(57)
1. Тетрапептид формулы Вос-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe, где Вос - третбутилоксикарбонил, ОМе - метил, ингибирующий связывание специфических аутоантител с тиреоидной
пероксидазой человека.
2. Способ получения тетрапептида по п. 1, заключающийся в том, что проводят реакцию конденсации метилового эфира Nε-карбобензоксилизина с Вос-β-Ala-OH с использованием дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента и гидроксибензатриазола в качестве противорацемической добавки, обрабатывают образовавшийся
дипептид Вос-β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe, где Z - карбобензокси, 4,4 н раствором HCl в этилацетате, проводят реакцию конденсации образовавшегося гидрохлорида дипептида с BocGln-OH, обрабатывают образовавшийся трипептид Вос-Gln-β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe 4,4 н
раствором HCl в этилацетате, проводят реакцию конденсации образовавшегося гидрохлорида трипептида с дициклогексиламмонийной солью γ-бензилового эфира третбутилоксикарбонил глутаминовой кислоты с образованием тетрапептида Вос-Glu(γ-OBzl)-Gln-β-AlaLys(Nε-Z)-OMe, где OBzl - бензиловый эфир, и удаляют OBzl-группу и Z-группу каталитическим гидрогенолизом в присутствии палладиевой черни.
Изобретение относится к области биоорганической химии, биохимии и медицины, а
именно к тетрапептиду Boc-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe, который ингибирует связывание аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека и может найти применение в медицине и
экспериментальной биохимии в качестве лиганда иммуносорбента, а также для диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы.
Аутоиммунные заболевания щитовидной железы (АЗЩЖ) являются наиболее распространенными органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями. Установлено, что
BY 12432 C1 2009.10.30
АЗЩЖ развиваются в результате реакции иммунной системы на собственные белки щитовидной железы - тиреоидную пероксидазу, тиреоглобулин и рецептор тиреотропного
гормона [1], которая проявляется появлением в высокой концентрации специфических аутоантител к указанным тиреоидным аутоантигенам в сыворотке крови больных. Антитела
к тиреоидной пероксидазе присутствуют в сыворотке у большинства пациентов с болезнью Грейвса (более 80 %), тиреоидитом Хашимото (более 90 %), послеродовым тиреоидитом (66 %) и являются маркером аутоиммунных заболеваний щитовидной железы [2-5].
Методом сайт-направленного мутагенеза определены некоторые фрагменты тиреоидной пероксидазы (ТПО353-363, TПO377-386, ТПО506-514, ТПО713-720, ТПО766-775), принимающие
участие в связывании со специфическими аутоантителами [6]. Однако способность рекомбинантных пептидов, экспрессированных в культуре клеток яичников китайского хомячка, ингибировать связывание аутоантител с тиреоидной пероксидазой не превышает
45 % при их концентрации 333,0 nМ. Это не позволяет использовать их в практических целях, например для диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы либо в качестве лиганда иммуносорбента для избирательной элиминации патогенных аутоантител.
Задачей настоящего изобретения является создание нового тетрапептида с общей формулой Boc-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe, где Вос - третбутилоксикарбонил, ОМе - метил, и молекулярным весом 588,3 г/моль. Заявляемый тетрапептид является структурным аналогом
Glu734Gln738Asp739Lys741, последовательности пространственно сближенных аминокислотных остатков, находящихся на поверхности глобулы белка тиреоидной пероксидазы, и отличается высокой способностью к связыванию с патогенными аутоантителами к
тиреоидной пероксидазе человека по сравнению с известными пептидами.
Структура заявляемого тетрапептида выявлена по результатам компьютерного конструирования участков связывания тиреоидной пероксидазы человека со специфическими аутоантителами. Компьютерное конструирование участков связывания проводили с помощью
разработанного авторами программного комплекса [7], позволяющего осуществить компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул и дизайн низкомолекулярных соединений, ответственных за биологическую функцию белка.
Чистота и структура созданного тетрапептида подтверждены методами массспектрометрии, аминокислотного анализа, ВЭЖХ.
Масс-спектр конечного тетрапептида получен на масс-спектрометре РЕ SCIEX AP1
150EX (Perkin Elmer, США) с использованием Turboionspray источника ионов.
Масс-спектр FAB Boc-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe: m/z 589,3 [M + H] + , 611,3 [M + Na] + ,
489,3 [M - 100 + H] + .
Аминокислотный анализ пептида, гидролизированного в запаянной ампуле 6 н НСl в
течение 20 часов при 100 °С, выполнен на автоматическом аминокислотном анализаторе
LMV (Швеция). Данные аминокислотного анализа тетрапептида Boc-Glu-Gln-β-Ala-LysOMe: глутаминовая кислота 1,00 (1), глутамин 1,05 (1), β-аланин 0,90 (1), лизин 1,05 (1).
Аналитическая ВЭЖХ созданного соединения проведена на хроматографе фирмы Waters
(Millenium32, 966 фотодиодный детектор, колонка Vydac 201HS52 RP С18 (2,1*250 мм)). Используемый градиент концентраций от 0 до 40 % ацетонитрила в воде с добавлением
0,1 % TFA. Скорость потока 1 мл/мин. По данным ВЖЭХ содержание целевого пептида
Boc-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe - 94 %. Способность заявляемого тетрапептида ингибировать
связывание аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека подтверждается примером 1.
Пример 1.
In vitro ингибирование связывания аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека.
Анализ ингибирующей способности пептидов проводят с помощью твердофазного
иммуноферментного анализа в полистирольных планшетах марки High Binding ("Greiner
Bio-One GmbH", Германия). Иммобилизацию полноразмерной тиреоидной пероксидазы
человека (чТПО), выделенной из тканей щитовидной железы по методу [8], осуществляют
методом пассивной адсорбции из 0,1 мл 0,1 М NаНСО3, рН 8,3, путем инкубации в тече2
BY 12432 C1 2009.10.30
ние ночи при 4 °С, используя чТПО в концентрации 0,3 мг/л. Блокирующую обработку
пластика раствором БСА (Fluka) в 0,02 М Na-фосфатном буфере, рН 7,5, (1 г/л) проводят
при 37 °С в течение 2 ч.
Калибровочные пробы, содержащие аутоантитела (ААТ) к тиреоидной пероксидазе
человека в концентрациях 50, 250, 1000, 3200 МЕ/мл, готовят последовательным разведением пуловых патологических сывороток с высоким содержанием ААТ инкубационным
буфером. Пробы сыворотки предварительно разводят в 100 раз инкубационным буфером
0,05 М трис-HCl, содержащим 0,2 М NaCl, 0,02 % твин 20 и 1 г/л БСА, рН 7,5.
Для выявления ингибирующего влияния пептидов на связывание ААТ с чТПО инкубируют анализируемое соединение в пошаговых концентрациях 0,01, 0,1, 0,5, 1 мМ в течение 2 ч при комнатной температуре с сывороткой крови человека, содержащей ААТ к
чТПО в концентрации 1000 МЕ/мл. Затем в лунки микроплашета с иммобилизованной
чТПО вносят по 0,1 мл исследуемого раствора ААТ с пептидом или калибровочных проб
с известным содержанием ААТ к чТПО и инкубируют в течение 0,5 ч при комнатной температуре с периодическим встряхиванием. На второй стадии анализа в каждую лунку вносят 0,1 мл конъюгата пероксидазы из корней хрена ("Biozyme", Великобритания) с
антителами козы против иммуноглобулинов человека в предварительно подобранном разведении и инкубируют в течение 30 мин при 37 °С. Для удаления неадсорбированных
белков после каждой стадии анализа лунки промывают трижды по 0,2 мл 0,05 М трисHCl, содержащим 0,2 М NaCl и 0,2 % Твин 20, рН 7,5.
Ферментативную реакцию перекисного окисления инициируют внесением в лунки по
0,1 мл смеси (1 : 4) 0,01 М 3,3'5,5'-тетраметилбензидина в 70 % диметилсульфоксиде и
5 мМ H2O2 в 0,15 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5,0. Реакцию продолжают в течение 15 мин
и останавливают добавлением 0,1 мл 4,8 % H2SO4, затем измеряют поглощение раствора
при 450 нм (А450) в анализаторе иммуноферментном фотоэлектрическом "АИФ" М/340
("Витязь" Беларусь).
Снижение величины показателя оптической плотности в лунках с исследуемым пептидом отражает уменьшение концентрации связавшихся ААТ с ТПО. Заявляемый тетрапептид в концентрации 1 мМ снижает показатель оптической плотности на 22 %, что
соответствует снижению концентрации ААТ с 1000 МЕ/мл до 200-220 МЕ/мл (таблица).
Ингибирование связывания ААТ с чТПО тетрапептидом Boc-Glu-Gln-β
β-Ala-Lys-OMe.
Оптическая плотКонцентрация
ность, ОЕ
ААТ, МЕ/мл
Связывание ААТ с ТПО без Boc-Glu-Gln-β-Ala1,805
1000
Lys-OMe (контроль)
Связывание ААТ с ТПО в присутствии Boc-Glu1,640
440-460
Gln-β-Ala-Lys-OMe в концентрации 0,1 мМ
Связывание ААТ с ТПО в присутствии Boc-Glu1,415
200-220
Gln-β-Ala-Lys-OMe в концентрации 1 мМ
Из представленных в таблице данных можно сделать вывод, что тетрапептид Boc-GluGln-β-Ala-Lys-OMe в концентрации 1 мМ проявляет наибольшую активность по отношению к ингибированию связывания специфических аутоантител с тиреоидной пероксидазой человека по сравнению с известными рекомбинантными пептидными соединениями, и
может найти применение в медицине в качестве лиганда иммуносорбента для избирательной элиминации патогенных аутоантител, а также в медицине и биохимии в качестве реагента в иммуноферментных тест-системах для выявления специфических аутоантител при
аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы.
Другой задачей изобретения является способ получения заявляемого тетрапептида
Вос-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe.
3
BY 12432 C1 2009.10.30
Известен способ получения Lys-Glu-содержащих пептидов [8], включающий в себя
жидкофазный способ с применением Nα,Nε-бис(трифторацетил)-лизина в качестве производного аминокислоты лизин. Однако при использовании трифторацетил производных
аминокислот может наблюдаться значительная рацемизация, и соответственно этот метод
не применим для получения заявляемого тетрапептида.
Заявляемый способ получения тетрапептида Boc-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe включает в
себя последовательное присоединение третбутилоксикарбонил(Вос-)-аминокислот к Сконцевым фрагментам. На первой стадии лизин вводят в реакцию в виде метилового эфира Nε-карбобензокси-лизина, который конденсирован с Вос-β-А1а-ОН. В качестве основного конденсирующего агента на первой, третьей и пятой стадиях используют
дициклогексилкарбодиимид (DCC) с добавлением гидроксибензатриазола (HOBt) в качестве противорацемической добавки. Снятие Вос-защиты с дипептида Вос-β-Ala-Lys(NεZ)-OMe проводят обработкой 4,4 н раствором НСl в этилацетате в течение 40 мин (стадия
2); конденсация соединения HCl⋅β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe с Boc-Gln-OH приводит к получению трипептида Boc-Gln-β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe (стадия 3). Последующее снятие Восзащиты с этого трипептида (стадия 4) и конденсация образовавшегося гидрохлорида с дициклогексиламмонийной (DCHA) солью γ-бензилового эфира третбутилоксикарбонилглутаминовой кислоты приводят к защищенному тетрапептиду Boc-Glu(γ-OBzl)-Gln-βAla-Lys(Nε-Z)-OMe (стадия 5).
Удаление защитных групп с Nε-аминогруппы лизина и γ-карбоксила глутаминовой кислоты групп осуществляют в одну стадию - каталитическим гидрогенолизом в присутствии катализатора палладиевая чернь (стадия 6). Синтез заявляемого тетрапептида
осуществляют по следующей схеме:
4
BY 12432 C1 2009.10.30
Вос-β -Аlа-ОН + НСlLys(Nε -Z)-OMe
Стадия 1
TEA,DCC/HOBt
88 %
Вос-β -Аlа-Lys(Nε -Z)-Оме
Стадия 2
HCl/CН3СООС2H5
99%
Boc-Gln-OH + НСlβ -Ala-Lys(Nε -Z)-OMe
Стадия 3
TEA,DCC/HOBt
68 %
Вос-Gln-β -Аlа-Lys(Nε -Z)-ОМе
Стадия 4
НСl/СН3СООС2Н5
98%
Boc-Glu(γ -OBzl)-OHDCHA + HClGln-β -Ala-Lys(Nε -Z)-OMe
Стадия 5
DCC/HOBt
68 %
Boc-Glu(γ -OBzl)-Gln-β -Ala-Lys(Nε -Z)-OMe
Стадия 6
H2/Pd
94 %
Boc-Glu-Gln-β -Ala-Lys-OMe
Заявляемый способ получения тетрапептида Boc-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe позволяет
вводить лизин в виде метилового эфира Nε-карбобензокси-лизина, а глутаминовую кислоту в виде дициклогексиламмонийной соли γ-бензилового эфира третбутилоксикарбонилглутаминовой кислоты и получать целевой пептид с минимальным числом стадий и высокими постадийными выходами (суммарный выход тетрапептида - 33,7 %). Сущность заявляемого способа подтверждается примером 2.
Пример 2.
Получение тетрапептида Boc-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe.
В примере приведены хроматографические подвижности в системах: (А) - хлороформметанол-20 %-ный аммиак, 60 : 40 : 10, (Б) - бутанол-уксусная кислота-вода, 40 : 10 : 10,
(С) - хлороформ-уксусная кислота-вода, 30 : 20 : 10.
Удельное вращение определяли на спектрополяриметре J-20 ("Jasco", Япония).
Стадия 1. Получение Boc-β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe (I).
К раствору 1,20 г (4,2 ммоль) хлоргидрата метилового эфира Nε-карбобензокси-лизина
в 4,0 мл ДМФ прибавляют 0,6 мл триэтиламина (4,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 15 минут и затем вносят 0,75 г (4,0 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-βаланина. После охлаждения до 0 °С в реакционный сосуд прибавляют последовательно
0,56 г (4,2 ммоль) гидроксибензатриазола (HOBt) и 0,90 г (4,4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 0 °С и 5 ч при
комнатной температуре. После окончания реакции осадки дициклогексилмочевины
5
BY 12432 C1 2009.10.30
(ДЦГМ) и ТЕА⋅НСl отфильтровают, промывают на фильтре 2,0 мл ДМФ. В фильтрат добавляют 15 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 %-ным раствором лимонной кислоты, 5 %-ным раствором NaHCO3, насыщенным раствором натрия хлорида,
водой, сушат над Na2SO4. После сушки этилацетат упаривают, а образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира петролейным эфиром и сушат над P2O5. Получают 1,52 г (выход 88 %) соединения (I), Rf 0,62 (Б).
Стадия 2. Получение HCl⋅β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe (II).
К раствору 1,50 г (3,4 ммоль) Boc-β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe в 0,8 мл этилацетата добавляют 13,9 мл 4,4 н раствора НСl в этилацетате. Перемешивают образовавшуюся взвесь в течение 40 мин, затем осадок отделяют фильтрованием, промывают на фильтре
этилацетатом, эфиром, сушат в эксикаторе над NaOH. Получают 1,23 г (выход 99 %) соединения (II); [α]20D - 10,0° (С 1, МеОН); Rf 0,58 (А).
Стадия 3. Получение Boc-Gln-β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe (III).
К раствору 1,19 г (3,2 ммоль) HCl⋅β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe (II) в 4,0 мл ДМФ добавляют
0,53 мл (3,8 ммоль) триэтиламина (рН 8-9). Реакционную смесь перемешивают в течение
20 мин и затем вносят 0,79 г (3,2 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-глутамина. Охладив реакционную колбу до 0 °С, вносят последовательно 0,45 г (3,3 ммоль) HOBt и 0,78 г
(3,8 ммоль) DCC. Время прохождения реакции - 4 часа. После окончания реакции осадок
ДЦГМ и ТЭА⋅НСl отфильтровывают, промывают небольшим количеством ДМФ, а к
фильтрату добавляют 20,0 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 %-ным раствором лимонной кислоты, 5 %-ным раствором NaHCO3, насыщенным раствором натрия
хлорида, водой, сушат над Na2SO4. После сушки этилацетат упаривают, а образовавшийся
маслообразный остаток переосаждают из эфира петролейным эфиром и сушат над P2O5.
Получают 0,65 г (выход 68 %) соединения (III), [α]20D - 14,5° (С 1, МеОН); Rf 0,88 (А).
Стадия 4. Получение HCl⋅Gln-β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe (IV).
К суспензии 0,51 г (0,9 ммоль) Boc-Gln-β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe (III) в 1,0 мл этилацетата
добавляют 4,6 мл 4,4 н раствора НСl в этилацетате. Реакционную смесь перемешивают
около часа, затем растворитель упаривают, а остаток промывают этилацетатом, эфиром.
Сушат в эксикаторе над NaOH. Получают 0,43 г (выход 98 %) соединения (IV); [α]20D11,1° (С 1, МеОН); Rf 0,36 (С).
Стадия 5. Получение Boc-Glu(γ-OBzl)-Gln-β-Ala-Lys(Nε-Z)-OMe (V).
К раствору 0,40 г (0,8 ммоль) соединения (IV) в 2,5 мл ДМФ добавляют 0,41 г
(0,8 ммоль) дициклогексиламмонийной соли (DCHA) Nα-трет.бутилоксикарбонил-γ-бензилового эфира глутаминовой кислоты (рН 8-9). Реакционную смесь перемешивают в течение 20 минут, выпадает осадок DCHA⋅НСl. Охладив реакционную колбу до 0 °С, вносят
последовательно 0,12 г (0,9 ммоль) HOBt и 0,21 г (1,0 ммоль) DCC. Время прохождения
реакции - 6 часов. После окончания реакции осадок ДЦГМ и DCHA⋅НСl отфильтровывают, промывают небольшим количеством ДМФ, а к фильтрату добавляют 20,0 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 %-ным раствором лимонной кислоты, 5 %-ным
раствором NаНСО3, насыщенным раствором натрия хлорида, водой, сушат над Na2SO4.
Этилацетат упаривают, образовавшийся остаток переосаждают из метанола эфиром. После сушки в эксикаторе над P2О5 получают 0,42 г (выход 68 %) соединения (V); [α]20D 13,6° (С 1, МеОН); Rf 0,79 (А).
Стадия 6. Получение тетрапептида Boc-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe (VI).
Через раствор 0,35 г (0,40 ммоль) соединения Boc-Glu(γ-OBzl)-Gln-β-Ala-Lys(Nε-Z)OMe (V) в смеси 0,5 мл уксусной кислоты и 4,0 мл метанола пропускают в течение 2 ч ток
водорода в присутствии катализатора - 0,0025 г палладиевой черни - при постоянном перемешивании. После деблокирования пептида (контроль ТСХ) катализатор отделяют
фильтрованием, фильтрат упаривают, осадок переосаждают из метанола эфиром, сушат в
6
BY 12432 C1 2009.10.30
вакууме над P2O5. Получают 0,22 г (94 %) соединения Вос-Glu-Gln-β-Ala-Lys-OMe; [α]D20
- 20,8° (С 1, МеОН), Rf 0,39 (А).
Источники информации:
1. Rapoport, В. Thyroid autoimmunity / В. Rapoport, S.M. McLachlan // J. Clin. Invest. 2001. - Vol. 108. - № 9. - P. 1253-1259.
2. Kotani, T. Detection of autoantibodies to thyroid peroxidase in autoimmune thyroid diseases by micro-ELISA and immunoblotting / T. Kotani [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1986. - Vol. 62. - P. 928-933.
3. Mariotti, S. Anti-thyroid peroxidase autoantibodies in thyroid diseases / S. Mariotti [et al.]
// J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1990. - Vol. 71. - P. 661-669.
4. Doullay, F. Prevalence of autoantibodies to thyroperoxidase in patients with various thyroid and autoimmune diseases / F. Doullay et al // Autoimmunity. - 1991. - Vol. 9. - P. 237-244.
5. Prummel, M.F. Thyroid peroxidase autoantibodies in euthyroid subjects / M.F. Prummel,
W.M. Wiersinga // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. - 2005. - Vol. 19. - P. 1-15.
6. Патент WO/2004/055043, МПК7 С 07К 7/04. Epitopic peptides of the thyroperoxidase
enzyme, compositions containing same and uses thereof / S. Peraldi-Roux (FR) et a. № PCT/FR2003/003678. - Заявл. 11.02.2003. - Опубл. 01.07.2004.
7. Шутова, И.В. Компьютерное моделирование пространственной структуры белковых
молекул / И.В. Шутова, Л.М. Чемитова, В.П. Голубович // Химия, структура и функция
биомолекул: Тез.докл.- Минск, 2006. - С. PR-162.
8. Цыганова, О.В. Характеристика иммуноаффинной хроматографии и новый метод
получения тиропероксидазы человека из субклеточных фракций щитовидной железы /
О.В. Цыганова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42, № 2. С. 236-346.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
7
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
116 Кб
Теги
by12432, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа