close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12527

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/02
СПОСОБ ОЦЕНКИ ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ
КОНТАМИНАНТА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
(21) Номер заявки: a 20071578
(22) 2007.12.19
(43) 2009.08.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
(72) Авторы: Дудчик Наталья Владимировна; Соколов Сергей Михайлович; Мельникова Людмила Александровна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное учреждение "Республиканский
научно-практический центр гигиены" (BY)
BY 12527 C1 2009.10.30
BY (11) 12527
(13) C1
(19)
(56) ФОНШТЕЙН Л.М. и др. Методы первичного загрязнения генетической активности загрязнителей среды с
помощью бактериальных тест-систем.
Методическое указание. - М., 1985. С. 20-23.
RU 2105977 С1, 1998.
SU 1784139 А1, 1992.
БУДКИНА Е.А. и др. Проблемы общественного здоровья и здравоохранения Республики Беларусь. Материалы Республиканской научно-практической конференции. - Минск, 2005. С. 332-333.
(57)
Способ оценки ДНК-повреждающего действия контаминанта окружающей среды,
включающий сравнение способности к росту бактерий Escherichia coli дикого и мутантного
по генам pol A и rec A штаммов в жидкой питательной среде с внесенным контаминантом,
отличающийся тем, что способность бактерий к росту оценивают импедиметрически по
регистрации времени детекции роста DT, а оценку ДНК-повреждающего действия контаминанта осуществляют по показателю TR, который определяют по формуле:
TR = DT2/DT1,
где DT1 - время детекции роста Escherichia coli дикого штамма;
DT2 - время детекции роста Escherichia coli мутантного штамма,
причем при значении TR, равном 1,0, определяют отсутствие ДНК-повреждающего действия, при значении TR от 1,1 до 1,4 - незначительную степень ДНК-повреждающего действия
и при значении TR, равном 1,5 или более, - значительную степень ДНК-повреждающего
действия контаминанта.
Изобретение относится к разделу токсикологии и экологии.
Известен способ оценки ДНК-повреждающего действия химических соединений, заключающийся в том, что учитывают рост суспензии бактерий Escherichia coli дикого типа
(штамм 1) и штамма, имеющего мутации в генах pol А и rec А, контролирующих различные этапы репарационных процессов в бактериальной клетке (штамм 2). При наличии
ДНК-повреждающего эффекта исследуемого вещества при определенных его концентрациях рост мутантных бактерий не регистрируется, тогда как бактерии дикого типа при
данных концентрациях агента проявляют нормальную способность к росту, при этом для
BY 12527 C1 2009.10.30
визуализации роста бактерий в питательную среду добавляют раствор индикатора бромкрезолового пурпурного и по изменению его окраски от голубого к желтому судят о росте
бактерий и о наличии ДНК-повреждающего эффекта химического вещества [1].
Указанный способ является прототипом по отношению к заявленному. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является то, что осуществляют параллельное внесение испытуемых образцов в питательную среду, содержащую суспензию
штамма 1, и в такую же по составу среду, содержащую суспензию штамма 2, в той же
концентрации, что и штамм 1, проводят их параллельное культивирование при оптимальной температуре, оценивают рост микроорганизмов с последующей обработкой полученных данных.
Однако визуальный принцип детекции роста штаммов микроорганизмов, используемый в способе-прототипе, затрудняет анализ непрозрачных, пигментированных, негомогенных образцов, что часто приводит к невозможности провести анализ объектов
окружающей среды, т.к. в этом случае маскируются изменения окраски применяемого индикатора. Кроме того, способ-прототип обладает низкой чувствительностью, что приводит к необходимости длительного, до 18 часов, времени проведения испытаний.
Отсутствуют также количественные характеристики оценки интегральной токсичности
объектов окружающей среды.
Задачей заявленного изобретения является разработка высокочувствительного экспресс-способа оценки ДНК-повреждающего действия контаминантов окружающей среды,
позволяющего тестировать непрозрачные, пигментированные, негомогенные образцы.
Поставленная задача достигается следующим образом.
Предложен способ оценки ДНК-повреждающего действия контаминанта окружающей
среды, включающий сравнение способности к росту бактерий Escherichia coli дикого и
мутантного по генам pol А и rec А штаммов в жидкой питательной среде с внесенным
контаминантом, при этом способность бактерий к росту оценивают импедиметрически по
регистрации времени детекции роста DT, а оценку ДНК-повреждающего действия контаминанта осуществляют по показателю TR, который определяют по формуле:
TR = DT2/DT1
где DT1 - время детекции роста Escherichia coli дикого штамма;
DT2 - время детекции роста Escherichia coli мутантного штамма,
причем при значении TR, равном 1,0, определяют отсутствие ДНК-повреждающего
действия, при значении TR от 1,1 до 1,4 - незначительную степень ДНК-повреждающего
действия и при значении TR, равном 1,5 и более, - значительную степень ДНК-повреждающего действия контаминанта.
Такой прием позволяет повысить чувствительность способа за счет того, что осуществляется импедиметрическая регистрация активной проводимости питательной среды, а
это позволяет провести детекцию роста штамма в течение 3-6 часов и определить показатель времени детекции для штамма 1 и для штамма 2, расширить ассортимент исследуемых образцов, включая темноокрашенные, негомогенные, непрозрачные образцы, а также
определить количественные характеристики ДНК-повреждающего действия контаминантов окружающей среды.
Пример выполнения.
Требуется определить степень ДНК-повреждающего действия трех объектов окружающей среды:
1-й образец - химическое вещество 1;
2-й образец - химическое вещество 2;
3-й образец - объект окружающей среды.
В качестве питательной среды при проведении исследования используют среду следующего состава (на 1000,0 мл дистиллированной воды), г:
Хлористый аммоний
1,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный
3,0
2
BY 12527 C1 2009.10.30
Натрий фосфорнокислый двузамещенный
6,0
Натрий хлористый
0,5.
pH 7,2-7,4
Стерилизация 121 °С в течение 30 мин.
После стерилизации добавляют 10 мл 20 % раствора глюкозы.
Используют штаммы Escherichia coli дикого типа, а также мутантные по репарации
штаммы.
Для приготовления ночных культур бактерий, для чего культуры с косяков мясопептонного агара петлей высевают в среду указанного состава. Перед опытом готовят инокулят, для чего ночную культуру разводят примерно в 100 раз средой, доводя титр бактерий
до 5-7·106 клеток/мл.
Приготовленную среду разливают в ячейки анализатора, инокулируют штаммом дикого типа, а также мутантным по репарации штаммом, вносят исследуемые образцы или
вытяжки из них и инкубируют в термоинкубаторе при 37 °С в течение 3-10 ч.
Получены следующие результаты (таблица).
Номер об- Время детекции Время детекции
разца
штамма 1
штамма 2
1
3,0
3,0
2
3,0
6,0
3
4,2
5,9
TR - показатель степени ДНКповреждающего действия образца
TR = 1 - образец 1 не показал ДНКповреждающего действия
ТR = 2 - ДНК-повреждающее действие образца 2 значительное
TR = 1,4 - ДНК-повреждающее действие
образца 3 незначительное
Параллельно было проведено определение ДНК-повреждающего действия трех образцов по способу-прототипу. Получены следующие результаты. Для определения ДНКповреждающего действия образца № 1 потребовалось 18 часов. ДНК-повреждающее действие образцов № 2 и № 3 не могло быть определено с помощью способа-прототипа, т.к.
образцы представляли собой темноокрашенные негомогенные суспензии, что приводило к
маскирующему эффекту работы индикатора.
Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается
в точной количественной оценке ДНК-повреждающего действия прозрачных и непрозрачных, пигментированных и непигментированных, гомогенных и ненегомогенных образцов, что дает возможность определить критерии и провести их количественную
оценку. Способ позволяет сократить время определения с 18 до 3,0-6,0 часов, что дает основание рекомендовать его в качестве экспресс-метода, а также разработка количественных характеристик ДНК-повреждающего действия контаминантов.
Источники информации:
1. Фонштейн Л.М. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Методические указания. - М.,
1985. - С. 20-23.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
81 Кб
Теги
by12527, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа