close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12529

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 12529
(13) C1
(19)
(46) 2009.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
A 61K 31/095
C 07C 321/00
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СРЕДСТВО ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА
ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
(21) Номер заявки: a 20070973
(22) 2007.07.30
(43) 2009.04.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Научно-исследовательский
институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь
(BY)
(72) Авторы: Рытик Петр Григорьевич;
Полозов Генрих Иванович; Кучеров
Игорь Иванович; Сорокин Виктор
Леонидович; Мистрюкова Любовь
Олеговна; Подольская Ирина Александровна; Мельнова Наталья Ивановна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь (BY)
(56) АКИМОВ Д.В. и др. Химико-фармацевтический журнал. - 2002. - Т. 36. № 11. - С. 3-7.
US 2005/0241645 A1.
BY 3164 C1, 1999.
(57)
Применение сульфидов о-аминобензойной кислоты формулы
BY 12529 C1 2009.10.30
COOH
NH
Sn
,
NH
COOH
где n = 1-3,
в качестве препарата, подавляющего репродукцию вируса иммунодефицита человека в
культуре Т-лимфобластоидных клеток.
Изобретение относится к сульфидам о-аминобензойной кислоты формулы I
C14H12N2O4Sn (где n = 1-3) - новым биологически активным соединениям, обладающим
анти-ВИЧ активностью, которые могут найти применение в медицине, в частности в терапии ВИЧ-инфекции/СПИДа. Структурная формула соединений:
BY 12529 C1 2009.10.30
COOH
I
.
NH
Sn
NH
COOH
n = 1-3
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вызывает тяжелое инфекционное заболевание, названное СПИД, летальность при котором достигает 100 %. Численность ВИЧинфицированных во всем мире составляет около 40 млн. человек и постоянно возрастает.
В основе применяемой в настоящее время высокоактивной антиретровирусной терапии
(HAART) ВИЧ/СПИДа лежит использование этиотропных ингибиторов ВИЧ [1]. Несмотря на очевидные ощутимые успехи в борьбе с инфекцией, в последние годы все больше
обращают на себя внимание недостатки HAART. Основными из них являются ее высокая
стоимость (до 12000 долларов США в год на одного пациента при применении стандартной 3-компонентной терапии), наличие практически у всех используемых антивирусных
препаратов выраженных побочных эффектов и существенное снижение с течением времени эффективности лечения за счет формирования у вируса резистентности к применяемым терапевтическим средствам [2, 3]. По этой причине представляется оправданным и
целесообразным поиск новых антиретровирусных (АРВ) соединений, лишенных указанных недостатков [4, 5, 6].
Известно, что некоторые представители класса полисульфидов являются сильными
антиоксидантами [7]. Это свойство привлекает к ним особое внимание фармакологов, т.к.
такого рода препараты, как правило, не лишены и противовирусной активности.
Задача изобретения - поиск среди представителей класса полисульфидов коммерчески
доступных, малотоксичных, обладающих выраженной анти-ВИЧ активностью соединений.
Результат достигается применением сульфидов о-аминобензойной кислоты формулы I
в качестве препарата, подавляющего репродукцию вируса иммунодефицита человека в
культуре Т-лимфобластоидных клеток.
Указанное соединение получают реакцией о-аминобензойной кислоты с монохлористой серой в растворе ацетонитрила при охлаждении в присутствии каталитического количества железа:
COOH
COOH
S2Cl2
NH2
CH3CN, Fe
-15 °C
NH
Sn
.
NH
COOH
n = 1-3
Новизна изобретения заключается в обнаружении у данного соединения способности
тормозить репликацию ВИЧ в инфицированных клетках.
Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
К раствору 2,74 г (20 ммоль) о-аминобензойной кислоты в 30 мл сухого ацетонитрила
при -15 °С и интенсивном перемешивании добавляли 50 мг порошкообразного железа и
2
BY 12529 C1 2009.10.30
далее по каплям раствор 1,35 г (10 ммоль) свежеперегнанной монохлористой серы. Реакционную смесь выдерживали 2 ч при -15 - -10 °С и затем 1 ч при комнатной температуре,
выливали на лед. Образовавшийся осадок фильтровали, промывали на фильтре водой
(3×30 мл), затем толуолом (3×10 мл) и сушили в вакууме. Получили 3,0 г продукта I в виде желто-зеленого порошка.
Т. пл. 160-170 °С (с разложением).
Найдено (%): С 42,92; Н 3,05; N 7,04; S 26,65. М.м. 368,45.
Для продукта I (n = 3) С14Н12N2O4S3 вычислено (%): С 45,63; Н 3,28; N 7,60; S 26,11.
Данные ВЭЖХ образца I указывают на значительное преобладание (64 %) в смеси
трисульфида (n = 3).
В масс-спектре I имеются пики молекулярных ионов три-, ди- и моносульфидов (соответственно m/z 368, 336 и 304).
Пример 2.
Определение максимально переносимой концентрации (МПК) соединения на Т-лимфобластоидной линии клеток человека МТ-4.
Клеточную суспензию в концентрации 400×105 клеток/мл в объеме 200 мкл вносили в
лунки 96-луночной панели. Питательная среда RPMI-1640 содержала 10 % сыворотки эмбрионов коров, 0,03 % L-глютамина, 10 mM HEPES, 50 мкг/мл гентамицина сульфата и
8 мкг/мл тилозина тартрата. Титрование соединения (исходная концентрация 5,0 мг/мл в
96 %-м этаноле) проводили с 5-кратным шагом параллельно с эталонным АРВ препаратом азидотимидином (AЗT). Панели инкубировались в атмосфере, содержащей 5 % CO2 при
t = 37 °C в течение 4 суток. Учет результатов путем определения жизнеспособности клеток при окрашивании витальным красителем трипановым синим проводили с помощью
светового микроскопа.
В результате испытаний установлено, что максимально переносимая концентрация
для клеток МТ-4 соединения I составила 45,0 мкг/мл, в то время как для АЗТ этот показатель был равен 5,5 мкг/мл.
Пример 3.
Определение анти-ВИЧ активности соединения методом формазанового теста (ФТ).
Эксперименты проводились на Т-лимфобластоидных клеточных линиях человека
CEM.SS и МТ-4. Инфекционным агентом служил высокорепликативный (rapid/high)
штамм ВИЧ-1zmb [8] с инфекционным титром не менее 6,0 lg ТЦД50. Испытания проводили по терапевтической схеме, предусматривающей последовательное внесение в лунки
с клетками препарата и вируса. Исходный раствор препарата (5,0 мг/мл) готовили ex tempore на 96 %-м этаноле, титровали в лунках 96-луночной панели с 5-кратным шагом, после чего в лунки вносили клетки и вирус. Контролями служили необработанные
препаратом ВИЧ-инфицированные клетки (контроль вируса) и необработанные препаратом неинфицированные клетки (контроль клеток). Панели инкубировались в атмосфере,
содержащей 5 % СО2 при t = 37 °C в течение 4 суток. Титрование исследуемого образца
соединения проводили параллельно с АЗТ.
Методика базируется на определении содержания формазанового продукта, который
формируется за счет митохондрий живых клеток после внесения в культуру реагента МТТ
(3-(4,5-диметил-тиазол-2)-2,5-дифенал-тетразолиум-бромида). После растворения с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) образовавшегося в лунках формазанового продукта
интенсивность развившегося окрашивания измерялась на спектрофотометре при длине
волны 540 нм. Результаты теста учитывали путем определения индекса защиты (ИЗ) клеток. Показатель ИЗ выше 50 % свидетельствовал о наличии анти-ВИЧ активности у испытуемого соединения. В положительных случаях определяли 50 %-ную эффективную
концентрацию (EC50 - effective concentration) препарата и химиотерапевтический индекс
(ХТИ) - соотношение МПК/ЕС50, характеризующее широту спектра его нетоксических
эффективных концентраций. Показатель соотношения МПК/EC50 менее 2,0 указывал на
3
BY 12529 C1 2009.10.30
низкую, 2,1-7,9 - на среднюю и более 8,0 - на высокую антивирусную активность препаратов [9].
В результате испытаний установлено, что ВИЧ-ингибирующая активность соединения
в зависимости от условий проведения экспериментов проявлялась в диапазоне концентраций от 40,0 до 0,32 мкг/мл, при среднем показателе ЕС50 13,56 мкг/мл, ХТИ - 3,32.
Пример 4.
Оценка анти-ВИЧ активности соединения методикой прижизненной окраски клеток
индикатором трипановым синим (ОТС).
Испытания проводились на Т-лимфобластоидной клеточной линии МТ-4 в аналогичных с ФТ условиях. Результаты теста учитывались на 4-е сутки с помощью прижизненной
окраски клеток 0,2 % раствором трипанового синего (trypan blue). Методика позволяет непосредственно судить о количестве живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных в синий цвет) клеток, подсчитываемых в камере Горяева под световым микроскопом "Ломо
АУ-12" (ув. 1,5×7×20). Об эффективности препарата судили по величине ЕС50, при которой количество живых клеток, обработанных препаратом и инфицированных ВИЧ, на
50 % превышало их число в контроле вируса, и соотношению МПК/ЕС50.
В результате установлено, что испытуемый препарат защищал клетки от цитопатического действия ВИЧ-1zmb. Анти-ВИЧ активность соединения в зависимости от условий
проведения экспериментов регистрировалась в диапазоне концентраций от 35,0 до
1,4 мкг/мл. Показатель ЕС50 составил 10,9 мкг/мл, ХТИ = 4,13.
Пример 5.
Подавление соединением I репликации ВИЧ в инфицированных клетках регистрируемой реакцией непрямой иммунофлуоресценции (НИФ).
Испытания проводили на Т-лимфобластоидной линии клеток человека МТ-4. Условия
проведения экспериментов были аналогичны вышеописанным. Учет результатов проводили через 72 ч после начала эксперимента путем фиксации клеток и последующей их последовательной обработкой поликлональной ВИЧ-позитивной сывороткой, а затем
меченным ФИТЦ конъюгатом (кроличья сыворотка против иммуноглобулинов G человека) с добавлением красителя Evans-blue для устранения неспецифического свечения. Полученные препараты просматривали в УФ-диапазоне под люминесцентным микроскопом
с использованием масляной иммерсии (МИ 90×1,25). Об эффективности соединения судили по величине EC50 - концентрациях, на 50 % снижающих число специфически светящихся (т.е. инфицированных) клеток по сравнению с контролем вируса (инфицированных,
но не обработанных препаратом клеток). Этот показатель определяли путем подсчета 200
клеток каждого образца, включая все контроли.
В результате экспериментов установлено, что в диапазоне концентраций 35,00,8 мкг/мл испытуемое соединение подавляло репродукцию вирусных антигенов. Показатель составил 13,7 мкг/мл, ХТИ = 3,28.
Суммарные данные оценки различными методами ингибирующего действия полидисульфида о-аминобензойной кислоты на ВИЧ приведены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты испытаний соединения I на анти-ВИЧ активность
различными методами
Методы испытаний
Показатели
ФТ
ОТС
НИФ
Диапазон активных концен40,0-0,32
35,0-1,4
35,0-0,8
траций (мкг/мл)
EC50 (мкг/мл)
13,56
10,90
13,72
МПК/ЕС50
3,32
4,13
3,28
4
BY 12529 C1 2009.10.30
Пример 6.
Определение токсической дозы соединения I.
Методические приемы испытаний осуществлялись в соответствии с "Руководством по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств"
(Москва, 2005 г.). Опыты проводились на беспородных мышах-самках, содержащихся на
обычном пищевом режиме и стандартизованных по массе тела (18-20 г). Минимальное
количество животных в опытных группах составляло 6 (ориентировочное определение
стартовой дозы) и 12 особей (титрование токсической дозы). Навески субстанций растворяли в 0,9 % растворе NaCl (5 мг препарата на 150 мкл растворителя). Готовые растворы
вводились с помощью зонда внутрижелудочно в объеме 0,5 мл. Наблюдение за животными велось в течение 2 недель. По истечении срока наблюдения определяли среднелетальную (острая LD50 при однократном внутрижелудочном введении) дозу соединения I.
Расчет LD50 осуществляли по формуле:
(50 − a )d
LD 50 = A +
,
b−a
где А - начальная токсическая доза (мг/кг);
d - интервал между дозами (мг/кг);
а - смертность при начальной токсической дозе;
b - смертность при последующей токсической дозе.
Установлено, что доза препарата 1250 мг/кг явилась абсолютно токсичной для животных: все опытные особи погибли в течение I недели эксперимента. Доза 250 мг/кг оказалась безвредной (по истечении 2 недель все опытные животные были живы).
Результаты последующего титрования токсичности соединения I представлены в
табл. 2.
Таблица 2
Результаты определения токсичности соединения I на беспородных мышах
Испытуемые Кол-во животных
Из них
Накопление частоты
Показатель
дозы (мг/кг)
в опыте
погибли
Погибли
Выжили смертности (%)
250,0
12
0
0
40
0
500,0
12
0
0
28
0
750,0
12
2
2
16
11,1
1000,0
12
6
8
6
57,1
1250,0
12
12
20
0
100,0
Проведенными исследованиями установлено, что показатель LD50 соединения I составил 961,4 мг/кг:
(50 − 11,1)250
LD 50 = 750 +
.
57,1 − 11,1
В соответствии с методом классификации токсичности [10] установленную дозу 961,4 мг/кг - следует отнести к V разряду, что соответствует определению "умеренная
токсичность".
Таким образом, установлено, что сульфиды о-аминобензойной кислоты формулы I являются среднеактивными в отношении ВИЧ соединениями, способными подавлять активность ВИЧ in vitro. Как видно из примеров 3-5 (таблица), испытанный образец защищает
более 50 % чувствительных клеток от цитопатического и цитолитического действия ВИЧ1zmb и препятствует репродукции вирусных антигенов инфицированными клетками. Полученные результаты позволяют рассматривать данное соединение в качестве препарата,
обладающего анти-ВИЧ свойствами и умеренно выраженной токсичностью.
5
BY 12529 C1 2009.10.30
Источники информации:
1. Schutz M., Wendrow A. Quick reference guide to antiretrovirals // Medscape Web site. Junuary 3, 2002. - P. 3.
2. Bourinbaiar A.S., Jirathitikal V. Low-cost anti-HIV compounds: potential application for
AIDS therapy in developing countries // Current Pharmaceutical Design. - 2003. - Vol. 9(18). P.1419-1431.
3. Папуашвили М.Н. Подходы к терапии ВИЧ-инфекции // ВИЧ/СПИД и родственные
проблемы. - 2001. - Т. 5. - № 2. - С. 92.
4. Патент BY 7675, МПК A 61K 33/26, C 12N 7/04, А 61Р 31/18, 2006.
5. Патент BY 7678, МПК A 61K 31/455, 31/52, C 12N 7/04, А 61Р 31/18, 2006.
6. Акимов Д.В., Филимонов Д.А., Коростков В.В. Ингибиторы протеазы - возможное
будущее ВИЧ/СПИД терапии // Хим.-фарм. журнал. - 2002. - Т. 36. - № 11. - С. 3-7.
7. Патент BY 3164, МПК C 07C 323/63, C 08G 75/14, А 61К 31/195, 31/795, 1999.
8. Рытик П.Г., Ван-дер-Гроен Г., Еремин В.Ф. Биологические свойства вируса иммунного дефицита, выделенного от жителя БССР // Здравоохранение Белоруссии. - 1989. № 11. - С. 11-12.
9. Бореко Е.И. Сравнительная характеристика и закономерности проявления противовирусной активности синтетических и природных соединений (экспериментальное исследование): Автореф. дис. д-ра мед. наук: 03.00.06 / ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ. - Минск, 2003. - 52 с.
11. Заугольников С.Д., Качанов А.О. // Медицина, 1978. - С. 184.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
107 Кб
Теги
by12529, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа