close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12617

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 01H 1/04
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ
К СТРЕСС-ФАКТОРАМ
(21) Номер заявки: a 20061269
(22) 2006.12.14
(43) 2008.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биофизики и
клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Савченко Галина Евсеевна;
Кабашникова Людмила Федоровна
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное научное учреждение "Институт
биофизики и клеточной инженерии
Национальной академии наук Беларуси" (BY)
BY 12617 C1 2009.12.30
BY (11) 12617
(13) C1
(19)
(56) RU 2049385 C1, 1995.
SU 499856, 1976.
SU 1450790 A1, 1989.
RU 2062562 C1, 1996.
MD 2825 F1, 2005.
SU 1337004 A1, 1987.
RU 2143194 C1, 1999.
RU 2062564 C1, 1996.
ПШИБЫТКО Н.Л. и др. Биологические мембраны. - 2003. - Т. 20. - № 2. С. 121-127.
(57)
Способ определения устойчивости растений к стресс-факторам, включающий измерение флуоресценции листьев растений, подвергшихся воздействию стресс-факторов и контрольных, отличающийся тем, что для измерения используют листья 4-9-дневных
этиолированных проростков, измеряют интенсивность низкотемпературной флуоресценции длинноволновой и коротковолновой форм протохлорофиллида с максимумом свечения при 657 и 635 нм соответственно и по изменению величины отношения
интенсивности флуоресценции этих форм для листьев растений, подвергшихся воздействию стресс-факторов, по сравнению с аналогичным отношением этих форм для листьев
контрольных растений судят об устойчивости растений, при этом, чем меньше изменяется
эта величина, тем выше устойчивость к стресс-факторам.
Изобретение относится к физиологии растений и сельскому хозяйству, может быть
использовано для характеристики перехода растения в стрессовое состояние и при отборе
стрессоустойчивых форм растений в селекции, включая генетически модифицированные
растения.
Известен способ оценки стрессоустойчивости (солеустойчивости) растений, включающий измерение биофизического показателя - электрического сопротивления листьев [1].
Недостатком известного способа является то, что его нельзя применить для оценки
действия других стрессовых факторов (например, термо- и засухоустойчивости).
Наиболее близким, принятым за прототип, является способ определения устойчивости
растений к стресс-факторам путем измерения замедленной флуоресценции образцов рас-
BY 12617 C1 2009.12.30
тений, подвергающихся воздействию стрессового фактора и без этого воздействия, и последующего сравнения уровней флуоресценции, измеряемой в одно и то же время суток
[2].
Недостатком известного способа является то, что он может быть применен только к
растениям со сформировавшимся фотосинтетическим аппаратом и должен учитывать
сложную суточную ритмику изменения измеряемых показателей.
Задачей изобретения является упрощение способа определения устойчивости растений к стресс-факторам, повышение точности определения физиологического состояния и
стрессочувствительности растений, а также расширение возможностей диагностики границ их стрессоустойчивости на самом раннем этапе развития.
Технический результат достигается в способе определения устойчивости растений к
стресс-факторам, включающем измерение флуоресценции листьев растений, подвергшихся воздействию стресс-факторов и контрольных. Согласно изобретению, используют листья 4-9-дневных этиолированных проростков, в которых измеряют интенсивность
низкотемпературной флуоресценции длинноволновой и коротковолновой форм протохлорофиллида (Пд) с максимумом свечения при 657 и 635 нм соответственно. По изменению
величины отношения интенсивности флуоресценции этих форм в листьях растений, подвергшихся воздействию стресс-факторов, по сравнению с аналогичным отношением для
листьев контрольных растений судят об их устойчивости, при этом, чем меньше изменяется эта величина, тем выше устойчивость к стресс-факторам.
Преимущество использования этиолированных проростков в качестве объекта для диагностики стрессоустойчивости на самом раннем этапе развития растений связано с тем,
что в отсутствие фотосинтеза и сформированного фотосинтетического аппарата они наиболее подвержены стрессу и наименее устойчивы и развитие в темноте нивелирует суточные ритмы физиологических процессов.
В предлагаемом способе в качестве физиологического параметра для определения устойчивости растений к стресс-факторам используется соотношение двух основных форм
предшественника хлорофилла - Пд [3], регистрируемых по низкотемпературным спектрам
флуоресценции листа этиолированных проростков: длинноволновой формы Пд, флуоресцирующей in vivo при температуре жидкого азота в области 655-657 нм (Пд657), и коротковолновой формы Пд, флуоресцирующей в этих же условиях при 633-635 нм (Пд635) [4].
В листьях этиолированных растений злаков, выращенных в отсутствие стрессовых воздействий в течение не менее 4 суток при хорошем влагообеспечении при комнатной температуре, преобладает длинноволновая форма Пд657, содержание которой снижается при
старении тканей листа. Оптимальным для измерений является 7-9-дневный возраст проростков.
Нами впервые выявлено, что при однократном тепловом шоке (3 ч при 40 °С) и дефиците влаги в результате изменения физико-химического состояния мембран этиопластов
интенсивность флуоресценции Пд635 может возрастать, а интенсивность флуоресценции
Пд657 снижаться, что приводит к уменьшению величины отношения интенсивности
флуоресценции Пд657/Пд635. Обнаруженная нами однотипность реакции этиолированных растений на различные экстремальные воздействия дает возможность рассматривать
ее как один из видов неспецифического ответа растительного организма на стрессовый
фактор, что позволяет использовать регистрируемое непосредственно в листе соотношение форм протохлорофиллового пигмента как индикатор состояния внутриэтиопластных
мембран, характеризующий стрессочувствительность, стрессоустойчивость и жизнеспособность проростка.
Способ осуществляют следующим образом.
Замоченные семена злаков (или других растений) выращивают несколько суток в полной темноте на водопроводной воде (контрольный вариант), затем подвергают их действию стрессора (высокая температура, обезвоживание или другие воздействия), после чего
2
BY 12617 C1 2009.12.30
регистрируют спектры флуоресценции листьев при температуре жидкого азота при длине
волны возбуждающего света 440 нм. Чтобы уменьшить биологический разброс данных и
повысить их достоверность, измерения проводят на одном и том же участке листа контрольного и опытного вариантов (там, где содержание Пд наиболее высокое). В оптимальных физиологических условиях в таких листьях преобладает флуоресценция формы
Пд657, а при переходе растения в состояние стресса в неблагоприятных условиях растет
интенсивность флуоресценции формы Пд635, что приводит к изменению отношения интенсивности флуоресценции обеих форм.
На фиг. 1 представлены спектры флуоресценции 7-дневных этиолированных проростков ячменя в контроле (1) и после теплового шока (2). Температура регистрации спектров -196 °С, длина волны возбуждения - 440 нм.
На фиг. 2 приведены спектры флуоресценции листьев 9-дневных этиолированных
проростков ячменя, выращенных на водопроводной воде (1), и листьев проростков, находившихся в течение 48 ч (с 7 по 9 сутки) в условиях дефицита влаги, создаваемого раствором 3 %-ного полиэтиленгликоля (2). Температура регистрации спектров - -196 °С, длина
волны возбуждения - 440 нм.
Сущность изобретения иллюстрируется примерами.
Пример 1.
Проростки этиолированных растений ячменя (Hordeum vulgare L., сорт "Гонор") выращивали при 23 °С (контрольный вариант), затем часть их подвергали тепловому шоку
путем нагревания в темноте в течение 3 ч при 40 °С в воздушном термостате (границу
продолжительности нагревания и его интенсивность можно раздвигать), регистрировали
спектры флуоресценции листьев при -196 °С в одних и тех же участках листа и измеряли
отношение интенсивности флуоресценции длинноволновой и коротковолновой форм Пд.
Средняя величина (фиг. 1) отношения интенсивности флуоресценции Пд657/Пд635 для
проростков ячменя в контроле составляла 4,17 ± 0,31, после теплового шока - 1,61 ± 0,32.
Различия между средними арифметическими двух вариантов были статистически достоверными при уровне значимости < 0,001 (критерий значимости t равен 5,81). Данные свидетельствуют о высокой чувствительности данного сорта ячменя к используемому
тепловому воздействию.
Пример 2.
Проростки этиолированных растений тритикале (Triticale, озимый сорт "Дубрава")
выращивали при 23 °С (контрольный вариант), затем часть их подвергали тепловому шоку
путем нагревания в темноте в течение 3 ч при 40 °С в воздушном термостате, регистрировали спектры флуоресценции листьев при -196 °С в одних и тех же участках листа и измеряли отношение интенсивности флуоресценции длинноволновой и коротковолновой форм
Пд. В листьях 7-дневных этиолированных проростков тритикале отношение интенсивности флуоресценции Пд657/Пд635 в контроле составляло 5,96 ± 0,36, а после теплового
шока - 4,69 ± 0,67. Различия между вариантами менее существенны по сравнению с примером 1 и статистически недостоверны (критерий значимости t равен 1,69). Данные свидетельствуют о достаточно высокой устойчивости растений тритикале к использованному
температурному стрессу, что подтверждается и другими физиологическими показателями
для этой культуры.
Пример 3.
Проверка границы засухоустойчивости. Для создания водного дефицита проростки
ячменя (Hordeum vulgare L., сорт "Гонор") выращивали в течение 7 суток на водопроводной воде в темноте, а затем половину проростков погружали корнями на 48 ч в 3 % раствор полиэтиленгликоля 6000, что приводило к дефициту влаги, в то время как
контрольные растения продолжали расти на воде. После этого регистрировали спектры
флуоресценции одинаковых участков листьев контрольного и опытного образцов при
температуре жидкого азота (фиг. 2). Дефицит влаги приводил к практически полному пе3
BY 12617 C1 2009.12.30
реходу формы Пд657 в форму Пд635 (кривая 2), указывающему на недопустимость дальнейшего снижения влагообеспеченности, поскольку было установлено, что проростки в
такой ситуации плохо зеленели на свету. Изменение величины отношения флуоресценции
длинноволновой (Пд657) и коротковолновой (Пд635) форм Пд в листьях этиолированных
проростков ячменя при обезвоживании представлено в таблице. Различия между опытными и контрольными вариантами были статистически надежными.
Вариант
Пд657/Пд635, отн.ед.
9-дневные проростки, контроль
0,73 ± 0,08
9-дневные проростки,
водный дефицит
(с 7 по 9 сутки)
0,18 ± 0,02
Критерий
значимости, t
6,88
Таким образом, по изменению соотношения форм Пд, вызванному увеличением относительного содержания коротковолновой формы Пд в низкотемпературных спектрах
флуоресценции этиолированных листьев, можно судить о переходе растения в стрессовое
состояние, а степень превращения длинноволновой формы Пд в коротковолновую может
отражать не только его стрессоустойчивость (примеры 1 и 2), но и указывать границу повреждающего действия стресс-фактора (пример 3).
Поскольку для измерения спектров флуоресценции достаточно нескольких листьев,
способ можно использовать для определения стрессоустойчивости и жизнеспособности
дефицитных проростков, например полученных путем генной модификации.
Источники информации:
1. Патент РФ 2017408, МПК А 01М 1/04, 1994.
2. Патент РФ 2049385, МПК А 01М 1/04, 1995.
3. Аверина Н.Г., Рудой А.Б., Савченко Г.Е., Фрадкин Л.И., Чайка М.Т., Беляева О.Б.,
Одинцова М.С., Островская Л.К., Филиппович И.И. Биогенез пигментного аппарата фотосинтеза / Под ред. Ф.Ф. Литвина. - Минск: Наука и техника, 1988. - С. 35-50, 234-240.
4. Kis-Peticë К., Boddi В., Kaposi A.D., Fidy J. Protochlorophyllide forms and energy transfer in dark-grown wheat leaves. Studies by conventional and laser excited fluorescence spectroscopy between 10 К - 100 К // Photosynthesis research. - 1999. - V. 60. - No 1. - P. 87-98.
Фиг. 1
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
91 Кб
Теги
by12617, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа