close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12645

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61K 31/4164
A 61K 31/4196
ИНГИБИТОР КОРОНАВИРУСА И СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ
РЕПРОДУКЦИИ КОРОНАВИРУСА
(21) Номер заявки: a 20050624
(22) 2005.06.23
(43) 2007.02.28
(71) Заявители: Государственное учреждение "Научно-исследовательский
институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь;
Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное
предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени
С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Бореко Евгений Иванович;
Павлова Наталья Ильинична; Савинова Ольга Владимировна; Савельева Тамара Александровна (BY)
BY 12645 C1 2009.12.30
BY (11) 12645
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатели: Государственное
учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь; Республиканское научно-исследовательское
дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) TAN E.L.S. et al. // Emerging Infectious
Diseases. - V.10, No 4. - P. 581-586.
RU 2234313 C1, 2004.
Информационный экспресс-бюллетень.
Коронавирус SARS - возбудитель атипичной пневмонии: Временные методические рекомендации. Москва, 2003. С. 27.
MORGENSTERN B. et al. // Biochem
Biophys Res Commun. - 2005. - V.326,
No 4. - P. 905-908.
(57)
1. Применение комбинации метронидазола и рибавирина для подавления репродукции
коронавируса в культуре клеток.
2. Способ подавления репродукции коронавируса в культуре клеток, включающий
внесение в среду культивирования рибавирина, отличающийся тем, что вносят рибавирин до концентрации 12,5 мкг/мл и дополнительно метронидазол до концентрации 6200 мкг/мл.
Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, и может быть
использовано для подавления размножения коронавирусов и редукции вызываемых ими
заболеваний.
Среди лекарственных препаратов, разрешенных к применению, наиболее выраженным
противокоронавирусным действием, по данным экспериментов in vitro, обладает рибавирин [1, 2, 3, 4]. Рибавирин обладает широким спектром противовирусного действия в
отношении различных оболочечных вирусов и является единственным противовирусным
средством, применявшимся для лечения больных SARS. Противовирусная активность ри-
BY 12645 C1 2009.12.30
бавирина недостаточна для проявления клинически заметного эффекта при инфекции, вызванной SARS-коронавирусом [5, 6, 7, 8, 4].
Известен способ подавления репродукции коронавируса, регистрируемой по его цитопатическому действию (ЦПД), заключающийся в использовании рибавирина в составе
среды поддержки культуры клеток в концентрации 0,5-5 мг/мл [3]. Недостатком способа
является необходимость применения препарата в концентрациях, превышающих концентрации, оказывающие цитотоксическое действие на неинфицированную культуру клеток
(0,2-1 мг/мл).
Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих противокоронавирусным действием, и увеличение эффективности рибавирина.
Поставленная задача достигается в применении комбинации метронидазола и рибавирина для подавления репродукции коронавируса в культуре клеток и способе подавления
репродукции коронавируса в культуре клеток, включающем внесение в среду культивирования рибавирина, при этом вносят рибавирин до концентрации 12,5 мкг/мл и дополнительно метронидазол до концентрации 6-200 мкг/мл.
Метронидазол является официнальным лекарственным препаратом и предназначен
для лечения протозойных инфекций (трихомониаза, лямблиоза, амебной дизентерии) [9].
Авторами обнаружено неочевидное свойство, позволяющее применить метронидазол
в качестве ингибитора репродукции коронавируса.
Сущность изобретения иллюстрируется примерами.
Пример 1
Токсическое действие метронидазола для культуры клеток.
Токсические свойства определяют по способности вызывать цитодеструктивные изменения клеток спустя 72 ч инкубации. Монослойные культуры клеток СПЭВ отмывают
от ростовой среды и наносят растворы метронидазола на среде поддержки (среды 199 и
Игла в соотношении 1:1) с концентрацией 800-12,5 мкг/мл. По истечении указанного срока неокрашенные культуры просматривают при малом увеличении микроскопа (объектив
×10). Максимальной переносимой концентрацией (МПК) принимают наивысшую концентрацию вещества, не вызывающую указанных изменений. Устанавливают, что в диапазоне
концентраций от 200 мкг/мл и более низких метронидазол не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток.
Пример 2
Токсическое действие рибавирина для культуры клеток.
Исследование, описанное в примере 1, выполняют с рибавирином. Устанавливают,
что в диапазоне концентраций от 800 мкг/мл и более низких рибавирин не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток.
Пример 3
Противовирусное действие метронидазола.
При проведении исследований используют культуру клеток СПЭВ, среды 199 и Игла в
соотношении 1:1 в качестве среды поддержки, коронавирус свиней (штамм Пурдью), метронидазол (0,5 % раствор для инфузий производства РУП "Белмедпрепараты").
Монослойные культуры клеток СПЭВ отмывают от ростовой среды, инфицируют различными разведениями вируса в пределах 0,01-0,00001 ТЦИД50/клетка путем нанесения
вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37 °С. Затем жидкость удаляют и
клетки покрывают средой поддержки с растворенным в ней метронидазолом в различных
концентрациях. Флаконы помещают в термостат на 48 ч и затем учитывают выраженность
цитопатического действия (ЦПД) вируса при малом увеличении микроскопа. Вычисляют
титр вируса и концентрации метронидазола, в присутствии которых титр снижается на
50 % (среднеэффективная концентрация, ЕС50) и на 95 % (EC95). Диапазон концентраций
метронидазола с противовирусным действием выражают в виде отношений максимально
переносимой концентрации (МПК) к EC50 (отношение МПК/ЕС50) и МПК к EC95 (отноше2
BY 12645 C1 2009.12.30
ние МПК/EC95, индекс селективности). МПК соединений для неинфицированной культуры клеток определяют после 72 часов инкубации. Полученные результаты приведены в
таблице.
Как видно, метронидазол обладает некоторой способностью тормозить репродукцию
коронавируса. Его среднеэффективная концентрация (EC50) составляет 0,26 мкг/мл, индекс селективности (МПК/ЕС95) равен 0,3.
Пример 4
Противовирусное действие рибавирина.
Исследование, описанное в примере 3, выполняют с рибавирином.
Полученные результаты приведены в таблице.
Как видно, рибавирин обладает выраженной способностью тормозить репродукцию
коронавируса и является высокоактивным противовирусным средством. В сравнении с
метронидазолом его среднеэффективная концентрация (ЕС50) более высока, однако противовирусное действие характеризуется резким снижением титра коронавируса на величину 95 % и более в широком диапазоне концентраций. В результате индекс
селективности (МПК/ЕС95) рибавирина равен 76,5.
Пример 5.
Способ подавления репродукции коронавируса с использованием метронидазола и
рибавирина.
Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями метронидазола и 12,5 мкг/мл рибавирина с целью определить EC50 и EC95 метронидазола.
Полученные результаты приведены в таблице.
Как видно, в присутствии метронидазола в диапазоне концентраций 200-6 мкг/мл и
12,5 мкг/мл рибавирина имеет место существенное подавление репродукции коронавируса
на величину более 1 lg ТЦИД50/мл (более 90 %). EC50 метронидазола в присутствии
12,5 мкг/мл рибавирина составляет 0,021 мкг/мл, что свидетельствует об увеличении противовирусного действия препарата в 12,4 раза (вычислено делением значения EC50 метронидазола без рибавирина на EC50 препарата в присутствии рибавирина). Увеличение
противовирусной активности метронидазола в присутствии рибавирина по индексу селективности составляет 38 раз.
Пример 6
Способ подавления репродукции коронавируса с использованием рибавирина и метронидазола.
Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями рибавирина и 100 мкг/мл метронидазола с целью определить EC50 и EC95 рибавирина.
Полученные результаты приведены в таблице.
Подавление репродукции коронавируса в культуре клеток СПЭВ в присутствии
метронидазола (Me), рибавирина (Rb) и их сочетаний
Разность
EC50/EC95 (I95)
Шифр Концен- Титр виМПК/ЕС50/МПК/ЕС9
с контровеще- трация*, руса ±Sх,
лем,
мкг/мл
µМ
5
ства мкг/мл lg БОЕ/мл
lg БОЕ/мл
400
<3
>2,18
0,26
769,2
200*
4,10±0,49
1,08
12
(605,82÷1,1×10-4)
100
4,21±0,41
0,97
16
0,3
Me
50
4,30±0,52
0,88
613,82
20
6
25
4,30±0,52
0,88
(1,4×10 ÷0,26)
12,5
5,24±0,26
-0,06
174
0
5,18±0,26
151
3
BY 12645 C1 2009.12.30
Продолжение таблицы
Разность
Шифр Концен- Титр вис контровеще- трация*, руса ±Sх,
лем, lg
ства мкг/мл lg БОЕ/мл
БОЕ/мл
800
<3
>2,18
400
<3
>2,18
200
<3
>2,18
100
<3
>2,18
Rb
50
<3
>2,18
25
<3
>2,18
12,5
<3
>2,18
6
5,10±0,49
0,08
0
5,18±0,26
400
<2
>3,18
200*
2,2±
2,98
100
3,45±0,42
1,73
Me +
50
3,64±0,46
1,54
Rb 12,5
25
3,10±
2,08
12,5
4,0±
1,18
6
4,07±
1,11
0
5,18±0,26
400
<2
>3,18
200*
<2
>3,18
100
<2
>3,18
50
2,37±0,30
2,81
Rb +
25
2,37±0,30
2,81
Me 100
12,5
2,72±
2,46
6
3
2,32±
2,86
0
5,18±0,26
-
EC50/EC95 (I95)
мкг/мл
µМ
7,38
(7,80÷6,98)
МПК/ЕС50/МПК/ЕС9
5
108,4
76,5
10,46
(11,06÷9,90)
1
126
151
0,021
(2,17÷0,0002)
17,51
(1841,58÷0,17)
9523,8
3
4
11,4
10
12
151
0,0001
(53476,7÷1,87×10-13)
2000000,0
1818,2
0,11
(5,95×107÷2,08×10-10)
2
2
5
2
1513
Как видно, в присутствии рибавирина в диапазоне концентраций 200-3 мкг/мл и
100 мкг/мл метронидазола имеет место существенное подавление репродукции коронавируса на величину 2,5 lg ТЦИД50/мл и более (99,7 % и более). EC50 рибавирина в
присутствии 100 мкг/мл метронидазола составляет 0,0001 мкг/мл, что свидетельствует
об увеличении противовирусного действия препарата в 73 800 раз (вычислено делением значения ЕС50 рибавирина без метронидазола на EC50 препарата в присутствии метронидазола).
Увеличение противовирусной активности метронидазола в присутствии рибавирина
по индексу селективности составляет 23,8 раза.
Таким образом, заявляемое решение позволяет решить поставленную задачу. При использовании метронидазола удается получить подавление репродукции коронавируса в
культуре клеток. Противокоронавирусная активность рибавирина, если судить по среднеэффективной концентрации, уступает метронидазолу в 28,4 раза. Однако рибавирин обладает более высокой степенью снижения репродукции вируса и по индексу селективности
его активность превосходит противовирусные свойства метронидазола в 255 раз. При сочетанном использовании метронидазола и рибавирина возрастает противокоронавирусное
действие обоих препаратов. При оценке по среднеэффективной концентрации активность
метронидазола увеличивается в 12,4 раза, рибавирина - в 73 800 раз; при оценке по индек4
BY 12645 C1 2009.12.30
су селективности активность метронидазола увеличивается в 38 раз, рибавирина - в 23,8
раза. Значение фракционального индекса ингибирования (ФИИ), рассчитанное по формуле: ФИИ = EC50 в-ва "А" в комбинации/ЕС50 в-ва "А" в отдельности + EC50 в-ва "Б" в комбинации/ЕС50 в-ва "Б" в отдельности (Janz С., Wigand R., 1982) [10], составляет 0,08. Оно
свидетельствует о крайне выраженном синергизме комбинированного использования препаратов.
Заявляемое решение может быть непосредственно в настоящий момент использовано
в исследовательской лабораторной практике для подавления репродукции коронавирусов
и редукции вызываемых ими заболеваний.
Существенным моментом заявляемого решения является высокая липотропность метронидазола, благодаря чему этот препарат очень хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер, а также другие системы организма, выполняющие барьерную функцию
на разделе сред. Одной из таких систем является сурфактант легких, представляющий собой липидно-протеиновый комплекс на поверхности альвеолярного эпителия. Основным
свойством легочного сурфактанта является способность снижать поверхностное натяжение на границе раздела фаз между альвеолярным эпителием и воздухом в альвеолярном
пространстве. Это позволяет дыхательной мускулатуре обеспечивать цикл вдох-выдох.
Недостаток сурфактанта и нарушение его образования вызывает спадение стенок альвеол
(ателектаз) и так называемый респираторный дистресс-синдром, являющийся одной из
основных причин младенческой заболеваемости и смертности.
Острые респираторные вирусные инфекции, к которым относятся также и заболевания, вызываемые коронавирусами, в частности SARS, сопровождаются очаговым ателектазом, респираторным дистресс-синдромом или пневмонией [11], связанными с
нарушением образования сурфактанта.
Поскольку метронидазол может легко проникать в липидную составляющую сурфактанта, его применением решается вопрос транспорта ингибитора репродукции коронавируса в непосредственное окружение очага инфекции. Эта особенность фармакодинамики метронидазола может быть позитивным этиопатогенетическим моментом, дополняющим экстремальное увеличение противовирусной активности метронидазола и рибавирина при совместном использовании.
Учитывая, что метронидазол, как и рибавирин, является лекарственным препаратом,
разрешенным к применению, на основе заявляемого решения возможно его использование
в комплексной терапии коронавирусных инфекций. Ожидается высокий эффект комбинированного применения метронидазола и рибавирина при SARS. Для выработки окончательных рекомендаций по применению метронидазола и рибавирина с этой целью
необходимы клинические испытания и отработка оптимальных схем применения.
Источники информации:
1. Chen F., Chan K.H., Jiang Y., Kao R.Y., Lu H.T., Fan K.W., Cheng V.C., Tsui W.H.,
Hung I.F., Lee T.S., Guan Y., Peiris J.S., Yuen K.Y. In vitro susceptibility of 10 clinical isolates
of SARS coronavirus to selected antiviral compounds. J. Clin. Virol. - 2004.- V. 31(1). - P. 6975.
2. Chu C.M., Cheng V.C., Hung I.F., Wong M.M., Chan K.H., Chan K.S., Kao R.Y., Poon L.L.,
Wong C.L., Guan Y., Peiris J.S., Yuen K.Y. Role of lopinavir/ritonavir in the treatment of
SARS: initial virological and clinical findings. Thorax. - 2004. - V. 59(3). - P. 252-256.
3. Tan E.L., Ooi E.E., Lin C.Y., Tan H.С., Ling A.E., Lim В., Stanton L.W. Inhibition of
SARS coronavirus infection in vitro with clinically approved antiviral drugs. Emerg. Infect. Dis. 2004. - V. 10(4). - P. 584.
4. Zhaon G. Antiviral treatment of SARS: can we draw any conclusions? CMAJ. - 2003. V. 169(11) - P. 1165-1166.
5
BY 12645 C1 2009.12.30
5. Fujn Т., Nakamura Т., Iwamoto A. Current concepts in SARS treatment. J. Infect. Chemother. - 2004. - V. 10(1). - P. 1-7.
6. Leong H.N., Ang В., Earnest A., Teoh C., Xu W., Leo Y.S. Investigational use of ribavirin in the treatment of severe acute respiratory syndrome, Singapore, 2003. Trop. Med. Int.
Health. - 2004. - V. 9(8). - P. 923-927.
7. Mazzulli Т., Kain K., Butany J. Severe acute respiratory syndrome: overview with an emphasis on the Toronto experience. Arch. Pathol. Lab. Med. - 2004. - V. 128(12). - P. 1346-1350.
8. Morgenstern В., Michaelis M., Baer P.C., Doerr H.W., Cinatl J.Jr. Ribavirin and interferonbeta synergistically inhibit SARS-associated coronavirus replication in animal and human
cell lines. Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2005. - V. 326(4). - P. 905-908.
9. Лекарственные средства: Пособие для врачей, ч. II, 12-е изд., М.: Медицина, 1993. С. 390-391.
10. Janz С., Wigand R. Combined interaction of antiherpes substances and interferon beta on
the multiplication of herpes simplex virus // Arch. Virol. - 1982. - Vol. 73. - P. 135-143.
11. Инструкция по эпидемиологии, клинике, диагностике, лечению случаев тяжелого
острого респираторного синдрома (SARS) и организации профилактических и противоэпидемических мероприятий. Утв. приказом Минздрава РБ № 64 от 08 апреля 2003.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
112 Кб
Теги
патент, by12645
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа