close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12707

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 01N 63/00
C 12N 1/21
ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ
BURKHOLDERIA VIETNAMIENSIS, УЛУЧШАЮЩИЙ
МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ
КУЛЬТУРЫ, И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ
(21) Номер заявки: a 20071051
(22) 2007.08.21
(43) 2009.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт генетики и
цитологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Бажанов Дмитрий Петрович (BY); Бажанова Алеся Александровна (BY); Хуан Юй (CN);
Жанг Ксиньян (CN); Ли Джишан
(CN); Чен Кай (CN); Янг Хетонг
(CN); Гуо Юнг (CN)
BY 12707 C1 2009.12.30
BY (11) 12707
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) KN 1020050034000 A, 2005.
CA 2205976, 1998.
БАЖАНОВ Д.П. и др. Доклады Академии наук Беларуси.- 1995.- Т. 39.№ 1.- C. 84-87.
БАЖАНОВ Д.П. Получение и характеристика генетически измененных
ризобактерий: Автореф. дис.- Минск,
1993. - C. 6-15.
STEYAERT J.M. The Mycological Society of America.- 2004.- V. 96.- No. 6.- P.
1245-1252.
(57)
1. Полифункциональный рекомбинантный штамм Burkholderia vietnamiensis CGMCC
2097, улучшающий минеральное питание сельскохозяйственной культуры и обеспечивающий защиту от фитопатогенов.
2. Способ конструирования штамма Burkholderia vietnamiensis по п. 1, заключающийся
в том, что в хромосому бактерии Burkholderia vietnamiensis Р418 встраивают ген хитиназы
Chi113 бактерии Bacillus subtilis Ap113.
Фиг. 1
BY 12707 C1 2009.12.30
Изобретение относится к области генетического конструирования полезных полифункциональных ризосферных бактерий, способных увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур за счет стимуляции их роста, улучшения минерального питания и
защиты от фитопатогенов. Полифункциональный штамм Burkholderia vietnamiensis может
быть использован в качестве продуцента при производстве биологических препаратов для
растениеводства, а метод его конструирования - для усиления защитного действия других
штаммов-продуцентов.
Болезни растений являются одним из основных факторов снижения урожайности
сельскохозяйственных культур. Использование химических средств защиты растений требует больших материальных затрат и сопровождается неблагоприятным экологическим
эффектом. Кроме того, химические средства не всегда достаточно эффективны, а их широкое применение может привести к появлению устойчивых рас фитопатогенов.
Задачей изобретения является защита прав на генетически сконструированный
штамм Burkholderia vietnamiensis P418-Chi113 и метод его конструирования. Полифункциональный генетически сконструированный штамм P418-Chi113 депонирован в Главном центре коллекций микробиологических культур Китая 11 июня 2007 г. под номером
CGMCC No.2097.
Прототипом штамма Burkholderia vietnamiensis P418-Chi113, в результате генетической модификации которого он был сконструирован, является полифункциональный
штамм Burkholderia vietnamiensis 418, он же Р418. Штамм Р418 был изолирован из корневой системы ячменя, росшего на участке, примыкающем к северо-восточной границе
г. Минска, Республика Беларусь [1].
Штамм Р418 обладает способностью заселять корни различных сельскохозяйственных
культур, фиксировать молекулярный азот, мобилизовать труднорастворимые фосфаты,
стимулировать рост растений и сдерживать развитие ряда фитопатогенов [2-4]. Штамм
Р418 депонирован в Главном центре коллекций микробиологических культур Китая 30
августа 2004 г. под номером CGMCC No.1212. Для получения штамма Р418-Chi113 ген
хитиназы из Bacillus subtilis Ap113 [5] был встроен в хромосому штамма Р418 в составе
транспозона Тn5 с помощью самоэлиминирующейся плазмиды pUT-Chi113. По сравнению с исходным штаммом Р418 сконструированный штамм Р418-Chi113 обладает более
выраженной антагонистической активностью в отношении более широкого круга фитопатогенных грибов.
Конструирование плазмиды pUT-Chi113.
Ген хитиназы был изолирован из Bacillus subtilis Ар113 [5] с помощью полимеразной
цепной
реакции
(ПЦР)
с
использованием
праймеров
Chi113NotIup
(5'CGGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGAAAAAAG-3')
и
Chi113NotIdo
(5'CGGCGGCCGCTTATTTGCAATCACCAATT-3'). Для приготовления реакционной смеси
использовали буфер производства Tian Wei (Пекин) с добавлением 2,5 мM MgCl2, по
0,2 мМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, по 50 пкмолей каждого из праймеров,
1 единицу Taq ДНК-полимеразы и 15 нг ДНК в качестве матрицы. ПЦР включала в себя
денатурацию при 94 °С в течение 5 мин; 10 циклов: 94 °С - 1 мин, 39 °С - 1,5 мин и 72 °С 2 мин; 25 циклов: 94 °С - 1 мин 41 °С - 1,5 мин и 72 °С - 2 мин, завершающая элонгация
72 °С - 10 мин. Продукт амплификации и вектор pUT-Km1 [6] были обработаны рестриктазой NotI, а затем лигированы. Продукты лигирования использовали для трансформации
штамма E.coli DH5α. Трансформанты отбирали на агаризованной среде с 25 мг/л ампициллина через 2 суток инкубации при 37 °С. Присутствие рекомбинантной плазмиды pUTChi113 обнаруживали с помощью ПЦР (94 °С в течение 5 мин; 30 циклов: 94 °С - 1 мин,
50 °С - 1,5 мин и 72 °С - 2 мин; завершающая элонгация 72 °С - 10 мин) при использовании праймеров JCHI113-F (5'-TTGGCGGATGGTCTTGGT-3') и JCHI113-R (5'TCTGCGATGTTTGCTCCG-3'). Продукты амплификации разделяли электрофорезом в
2
BY 12707 C1 2009.12.30
агарозном геле [7], о наличии свидетельствовало обнаружение ампликона размером около
1 тысячи пар оснований (фиг. 1, дорожки 1-3).
Конструирование штамма P418-Chi113.
Перенос гена хитиназы в геном штамма Р418 осуществляли методом трехродительских скрещиваний. Трансформанты E.coli DH5α, содержащие рекомбинантную плазмиду
pUT-Chi113, использовали в качестве донора в скрещиваниях со штаммом Р418. В качестве "помощника" использовали штамм E.coli DH5α, содержащий плазмиду pRK600. Ночные культуры донора, реципиента и "помощника" смешивали в соотношении 1 : 1 : 1 и
осаждали центрифугированием. Осажденные бактерии переносили на агаризованную среду с канамицином и равномерно рассевали по ее поверхности с помощью шпателя. Устойчивые к канамицину трансконъюганты отбирали через 2 суток инкубации при 28 °С.
Полифункциональный штамм Р418-Chi113 был отобран в результате скрининга 76 полученных в трехродительских скрещиваниях трансконъюгантов по следующим параметрам:
1. Проверка наличия гена хитиназы с помощью ПЦР при использовании праймеров
JCHI113-F и JCHI113-R как при отборе трансформантов (см. Конструирование плазмиды
pUT-Chi113). В результате отобран 31 трансконъюгант, несущий ген хитиназы из Bacillus
subtilis (фиг. 2).
2. Проверка наличия гена хитиназы с помощью блот-гибридизации по Саузерну по
методу [7]. Для обработки геномной ДНК трансконъюгантов использовали рестриктазу
EcoRI, в качестве зонда - фрагмент гена хитиназы Bacillus subtilis Ар113, получаемый с
помощью праймеров JCHI113-F и JCHI113-R. Проверка показала, что 27 из 31 отобранных
на первом этапе трансконъюгантов штамма Р418 содержат в хромосоме единичную копию
гена хитиназы Bacillus subtilis Ap113 (фиг. 3).
3. Оценка активности хитиназы. Культуры 27 отобранных трансконъюгантов были посеяны на поверхность агара с хитином. В результате у 8 из них был обнаружен высокий
уровень хитинолитической активности, выявляемый по образованию зон просветления
среды в результате разрушения суспензии хитина (фиг. 4). Количественное определение
хитинолитической активности этих штаммов было проведено в соответствии с методикой
[8]. Ее результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Количественная оценка хитинолитической активности трансконъюгантов
№ трансконъюганта
12
33
35
37
38
39
40
41
Активность, ед.
0,56 1,64 0,93 1,84 0,64 1,22 0,40 0,85
Трансконъюгат № 37, обладавший максимальной активностью, был отобран для дальнейшей работы, обозначен как P418-Chi113 и депонирован как CGMCC No.2097.
Антагонистическая активность штамма P418-Chi113 (CGMCC No.2097).
Антагонистическая активность штаммов Р418-Chi113 (CGMCC No.2097) и Р418
(CGMCC No.1212) была определена в отношении фитопатогенов Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia cerealis, Bipolaris sorokiniana, Verticillium dahliae, Gaeumannomyces graminis var. tritici. Для определения диск с мицелием патогена помещали в центр
чашки Петри с картофельно-глюкозным агаром, на расстоянии 3 см от него с противоположных сторон наносили по 30 мкл ночной культуры исследуемых штаммов. Чашки инкубировали при 28 °С в течение 5 суток. Зону ингибирования определяли как расстояние
между краем псевдоколонии бактерий и краем мицелия гриба (фиг. 5, табл. 2). Присутствие гена хитиназы в штамме Р418-Chi113 (CGMCC No.2097) привело к существенному (в
1,4-4,5 раза в зависимости от вида гриба) увеличению зон ингибирования роста мицелия,
что свидетельствует о более высокой антагонистической активности этого штамма в отношении фитопатогенных грибов различной таксономической принадлежности.
3
BY 12707 C1 2009.12.30
Таблица 2
Сравнительная оценка антагонистической активности штаммов Р418-Chi113
(CGMCC No.2097) и Р418 (CGMCC No.1212)
Зона ингибирования, см
Фитопатоген
P418 (CGMCC 1212) Р418-Chi113 (CGMCC 2079)
Rhizoctonia solani
0,3
0,8
Fusarium oxysporum
0,4
0,9
Rhizoctonia cerealis
0,5
1,2
Bipolaris sorokiniana
0,3
1,3
Verticillium dahliae
0,8
1,1
Gaeumannomyces graminis var. tritici
0,2
0,9
Биологическая характеристика штамма P418- Chi113 (CGMCC No.2097).
Была проведена оценка сохранения полезных биологических свойств у рекомбинантного штамма P418-Chi113 (CGMCC No.2097): способности мобилизовать труднорастворимые соединения фосфора и калия, а также заселять корневую систему после
инокуляции семян.
Мобилизацию фосфатов оценивали по образованию зон растворения при росте культур на среде, имеющей следующий состав (на 1 л): глюкоза - 10 г; (NH4)2SО4 - 0,5 г; NaCl 0,2 г; MgSO4⋅7H2O - 0,3 г; FeSO4⋅7H2O - 0,03 г; MnSO4⋅4H2O - 0,03 г; Са3(РО4)2 - 10 г, агар 15 г; pH 7,5. Как видно из фиг. 6, штаммы Р418 (CGMCC No.1212) и Р418-Chi113
(CGMCC No.2097) образовывали зоны растворения одинакового размера, что свидетельствует о сохранении способности к мобилизации фосфатов у рекомбинантного штамма
Р418-Chi113 (CGMCC No.2097).
Мобилизацию калия оценивали по образованию зон растворения при росте культур на
среде Александрова, имеющей следующий состав (на 1 л): глюкоза - 5 г; MgSO4⋅7H2O 0,5 г; FеСl3 - 0,005 г; Na2HPO4 - 2,0 г; СаСО3 - 1 г; аллюмосиликаты калия - 1 г, агар 15 г;
pH 7,5. Как видно из фиг. 7, штаммы Р418 (CGMCC No.1212) и Р418-Chi113 (CGMCC
No.2097) образовывали зоны растворения одинакового размера, что свидетельствует о сохранении способности к мобилизации калия у рекомбинантного штамма Р418-Chi113
(CGMCC No.2097).
Способность заселять корневую систему ячменя определяли по методике, приведенной в [9]. Через 2 недели после появления всходов популяции штаммов Р418 (CGMCC
No.1212) и Р418-Chi113 (CGMCC No.2097) на корнях ячменя составляли 1,5-4,0×106 КОE
на 1 г и не различались достоверно, что свидетельствует о сохранении способности заселять корни у рекомбинантного штамма P418-Chi113 (CGMCC No.2097).
Фиг. 1 - обнаружение гена хитиназы в плазмиде pUT-Chi113 по амплификации фрагмента размером около 1,0 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.) (дорожки 1-3). М - маркеры молекулярной массы.
Фиг. 2 - проверка наличия гена хитиназы в трансформантах по амплификации фрагмента размером около 1,0 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.). М - маркеры молекулярной массы.
Фиг. 3 - проверка встраивания гена хитиназы в геном штамма Burkholderia vietnamiensis Р418 (CGMCC No.1212) с помощью блот-гибридизации по Саузерну.
Фиг. 4 - отбор трансформантов с высоким уровнем хитинолитической активности по
образованию зон просветления среды в результате разрушения суспензии хитина.
Фиг. 5 - тестирование ингибирования роста мицелия фитопатогенных грибов штаммами Р418 (CGMCC No.1212) и Р418-Chi113 (CGMCC No.2097).
Фиг. 6 - растворение суспензии Са3(РО4)2 штаммами Р418 (CGMCC No.1212) и Р418Chi113 (CGMCC No.2097).
Фиг. 7 - растворение алюмосиликатов калия штаммами Р418 (CGMCC No.1212) и
Р418-Chi113 (CGMCC No.2097).
4
BY 12707 C1 2009.12.30
Источники информации:
1. Бажанаў Д.П., Рудава А.У., Троiцкi М.А. Вылучэнне i характарыстыка аэробных
азотфiксуючых бактэрый з рызыпланы дзiкарослых i культурных аднадольных раслiн //
Весцi АН БССР. Сер. бiял. навук. - 1991. - № 5. - С. 8-12.
2. Бажанов Д.П., Бажанова А.А., Окулич Л.А., Чернышев С.П. Азотфиксирующие ризосферные псевдомонады: перспективы использования в агробиотехнологии. Сельскохозяйственная агробиотехнология. Мат. межд. науч.-практ. конф. - Горки. 14-17 декабря
1998. - С. 12-15.
3. Yang H., Li J., Chen К. and Bazhanov D. Beneficial effects of multifunctional biocontrol
agents on tomato. // International Conference on Environmentally Sustainable Agriculture for
Dry Areas for the 3rd Millennium. Shijiazhuang, Hebei, P. R. China. September 15-19, 2002.
Proceedings. - P. 406-408.
4. Бажанов Д.П., Бажанова А.А., Окулич Л.А., Стриенок Н.С. Первичное заселение
корневой системы сельскохозяйственных культур азотфиксирующей бактерией
Burkholderia sp.418 и ее Nif- и Nif-производными // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2005. - № 4. - С. 48-50.
5. Bacillus subtilis strain Ap113 chitinase (Chi113) gene, complete cds. (Accession No.
DQ661650) // http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
6. Lorenzo V., Herrero M., Jacubzik U., Timmis K.N. Mini-Tn5 transposon derivatives for
insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in gramnegative eubacteria. // J. Bacteriol. - 1990. - V.I72. - P. 6568-6572.
7. Sambrook J., Fritsch. E.F. and T. Maniatis. Molecular cloning: A laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. - New York, 1989.
8. Nahar P., Ghormade V., Deshpande M.V. The extracellular constitutive production of chitin deacetylase in Metarhizium anisopliae: possible edge to entomopathogenic fungi in the biological control of insect pests. - 2004. - V. 85. - P. 80-88.
9. Бажанов Д.П., Бажанова А.А., Окулич Л.А., Стриенок Н.С. Первичное заселение
корневой системы сельскохозяйственных культур азотфиксирующей бактерией
Burkholderia sp.418 и ее Nif- и Nif-производными // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2005. - № 4. - С. 48-50.
Фиг. 2
Фиг. 3
5
BY 12707 C1 2009.12.30
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 285 Кб
Теги
патент, by12707
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа