close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12749

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 12749
(13) C1
(19)
(46) 2009.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 7/00
ШТАММ ВИРУСА NEWCASTLE DISEASE
КМИЭВ-36 - ШТАММ-АНТИГЕН
(21) Номер заявки: a 20070324
(22) 2007.03.29
(43) 2008.10.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Бирман Борис Яковлевич;
Насонов Игорь Викторович; Азарова Ирина Андреевна; Згировская
Алла Александровна; Падерова
Инна Ивановна (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское
дочернее
унитарное предприятие "Институт
экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского" (BY)
(56) SU 826584, 1982.
RU 2259844 C1, 2005.
БИРМАН Б.Я. и др. Эпизоотология,
иммунология, фармакология и санитария. - 2005. - № 1. - С. 76-79.
ПРУДНИКОВ А.В. и др. Эпизоотология, иммунология, фармакология и санитария. - 2004. - № 1. - С. 21-23.
БИРМАН Б.Я. и др. Международная
научно-практическая конференция "Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных". - Минск,
2003. - С. 58-61.
BY 12749 C1 2009.12.30
(57)
Штамм вируса Newcastle disease КМИЭВ-36 - штамм-антиген.
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к биотехнологии, и
касается штамма, выделенного из патологического материала голубя, больного ньюкаслской болезнью и депонированного в коллекции культур микроорганизмов РУП "Институт
экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского", обладающего высокой биологической активностью, и может быть использовано для создания вакцин с высокой иммуногенностью.
Известен штамм вируса ньюкаслской болезни "Бор-74 ВГНКИ", относящийся к семейству Paramyxoviriidae, вирионы нитевидной, ракетковидной, сферической и полиморфной
форм размером от 90 до 150 нм. Штамм культивируется на 9-10-дневных эмбрионах кур, не
вызывая их гибели в течение 96-часовой инкубации при 37 °С, термостабилен. При введении восприимчивым птицам вызывает образование напряженного иммунитета против эпизоотического вируса ньюкаслской болезни. Биологическая активность вируса 108,5109,75ЭИД50/мл. Вирус штамма "Бор-74 ВГНКИ" способен агглютинировать эритроциты птиц
и животных, гемагглютинирующий титр 1 : 512 [1].
Недостатком данного штамма является его низкая биологическая активность.
BY 12749 C1 2009.12.30
Известен штамм вируса ньюкаслской болезни Ла-Сота, который культивируется на 910-суточных СПФ-эмбрионах, его биологическая активность составляет 109,7ЭИД50/см3,
гемагглютинирующая активность - 1 : 512 [2].
Недостатком данного штамма является также низкая биологическая активность.
Задачей настоящего изобретения является выделение штамма вируса ньюкаслской болезни (Newcastle disease) с более высокой биологической активностью, что позволит создавать вакцины с высокой иммуногенностью.
Поставленная цель достигается тем, что штамм вируса Newcastle disease (ньюкаслской
болезни птиц) - штамм-антиген - был выделен в 2003 году из патологического материала
от больного голубя.
Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству Раrаmyxoviriidae, род
Rubbullavirus. Это РНК-содержащий вирус. Содержит линейный геном, представленный
минус-нитью РНК в виде единой молекулы.
Культурально-морфологические признаки. Культивируется на куриных эмбрионах 910-суточной инкубации при любом способе заражения или на фибробластах эмбрионов
кур. Максимальное накопление вируса наблюдается через 96-120 часов. Вирус агглютинирует эритроциты амфибий, рептилий, птиц, человека, мыши и морской свинки.
Морфологические признаки. Размер вирионов от 120 до 300 нм. Оболочка имеет выступы или нити длиной 8 нм и содержит антигенные компоненты. Внутренний компонент нуклеокапсид (S-антиген) - представляет собой длинную заостренную трубку диаметром
13 нм. Структурные единицы протеина этой трубки (капсомеры) расположены по спирали
вокруг центральной оси, внутри них находится РНК.
Физико-биохимические свойства. Устойчив к эфиру, хлороформу, устойчив при диапазоне рН 2,0-10,0, при температуре 56 °С сохраняется 5 ч, при 60 °С - 30 мин, а при 30 °С
в присутствии 0,5 % фенола или 0,125 % мертиолята - в течение 1 ч. При воздействии
0,5 % раствора формалина инактивируется за 6 ч. Чувствителен к ультразвуку.
Молекулярно-биологические признаки. Вирион содержит 6 полипептидов: L, HN, F,
NP, М и полипептид с молекулярной массой 47000 Д. В составе вируса имеются 3 основных и 5 минорных белковых компонентов. К основным относятся гемагглютинин, белок
внутренней оболочки и белок РНП. Нейраминидаза является одним из минорных компонентов. Кроме этого, в вирионе обнаружена эндорибонуклеаза.
Маркерные признаки. Вирионы шт. "КМИЭВ-36" содержат V (гемагглютинин и нейраминидазу) и S (РНП) антигены, различающиеся по локализации в вирионе, иммуногенности и антигенной активности. V-антиген обладает высокой гемагглютинирующей
активностью, выраженной антигенностью и иммуногенностью. Инфекционная и гемолитическая активность не выявлена. Серологический вариант PMV-1.
Онкогенность. Штамм вируса Newcastle disease КМИЭВ-36 не является онкогенным.
Данные о контаминации. Штамм вируса Newcastle disease не контаминирован.
Антигенная активность. Антигенная активность составляет не ниже 4,0 log2 в РТГА у
85 % привитых цыплят.
Биологическая активность составляет не ниже 109,8 ЭИД50/см3.
Безвредность. Штамм вируса ньюкаслской болезни КМИЭВ-36 не патогенен для цыплят.
Вирулентность. Штамм вируса Newcastle disease КМИЭВ-36 не вирулентен.
Иммуногенность. Иммуногенность штамма вируса Newcastle disease КМИЭВ-36 составляет не менее 85 %.
Чувствительность к антибиотикам. Вирус резистентен к действию антибиотиков.
Способы и условия хранения. Хранят при + 2…+ 4 °С после лиофильного высушивания в защитной среде в течение 5 лет. Жизнеспособность его поддерживается путем пассажа на эмбрионах кур.
2
BY 12749 C1 2009.12.30
Условия консервации. Лиофильная сушка в защитной среде при температуре
+ 2…+ 4 °С или в морозильнике при - 20 °С.
Пример 1.
Пример выделения штамма вируса Newcastle disease КМИЭВ-36. Штамм выделяли из
патологического материала (паренхиматозные органы, головной мозг) дикого голубя методом заражения развивающихся куриных эмбрионов 9-10-суточного возраста по 0,1 см3 в
хорионаллантоисную оболочку (ХАО). Эмбрионы инкубировали в течение 96-120 ч при
37 °С с ежедневным овоскопированием. Затем эмбрионы вскрывали, отбирали экстраэмбриональную жидкость и проверяли ее в реакции гемагглютинации.
Пример 2.
Пример подтверждения, что выделенный агент является вирусом ньюкаслской болезни (Newcastle disease). Для определения, что выделенный агент является вирусом, суспензией из органов дикого голубя заражали 9-10-суточных эмбрионов по стандартной
методике. Эмбрионы инкубировали 120 ч, после чего отбирали экстраэмбриональную
жидкость и проверяли ее в реакции гемагглютинации. В случае размножения вируса в
данной биологической модели реакция гемагглютинации должна быть положительной.
Установлено наличие размножения вируса в эмбрионах, что подтверждается гемагглютинацией эритроцитов кур (реакция положительная).
Идентификацию выделенного вируса проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с положительной сывороткой к вирусу ньюкаслской болезни (титр антител
в сыворотке - 1 : 512).
Установлено, что титр выделенного вируса в РТГА составлял 1 : 128, что свидетельствует о том, что выделенный возбудитель принадлежит к вирусу ньюкаслской болезни.
Пример 3.
Пример определения биологической активности штамма "КМИЭВ-36". Биологическую активность определяли титрованием на развивающихся эмбрионах кур 9-10-дневной
инкубации. Лиофильно высушенный вирус растворяли стерильным водным раствором натрия хлорида с массовой долей 0,9 % (рН 7,2) в объеме, равном объему до сушки. Из полученной пробы готовили разведения от 10-1 до 10-11 на стерильном водном растворе
натрия хлорида с массовой долей 0,9 % (рН 7,2). Перед заражением скорлупу яйца в области воздушной камеры протирали спиртовым раствором с массовой долей йода 5 % и
фламбировали. Каждым разведением вируса, начиная с 10-11, заражали по 4 эмбриона в
ХАО в объеме 0,2 см3. В качестве контроля оставляли 4 эмбриона, которых не заражали.
После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заклеивали парафином. Зараженные и
контрольные эмбрионы инкубировали в течение 96-120 ч при (37-38) °С и относительной
влажности 60-70 %. Овоскопию эмбрионов проводили 2 раза в сутки. Эмбрионы, павшие
в первые 24 ч после заражения, уничтожали, считая их гибель неспецифической. По истечению срока инкубации все эмбрионы вскрывали (в том числе и павшие), отбирали экстраэмбриональную жидкость и исследовали ее в капельной реакции гемагглютинации
(РГА) с 1 %-ным раствором куриных эритроцитов.
Учет результатов титрования проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина.
Биологическая активность вируса составляла 109,8 ЭИД50/см3. Определение гемагглютинирующей активности штамма вируса Newcastle disease КМИЭВ-36 показало, что титр
гемагглютинации составлял не менее 1 : 512.
Пример 4.
Пример определения вирусной контаминации. Контаминацию посторонними вирусами определяли на 10 цыплятах 15-20-суточного возраста. Для этого каждому цыпленку
вводили внутримышечно по 100 LD50/0,2см3 вируса в объеме 0,2 см3. Через 14 суток вирус
вводили повторно. Пять цыплят оставляли в качестве контроля. Через 21 день после второго введения вируса производили забор крови с целью получения сыворотки, которую
3
BY 12749 C1 2009.12.30
исследовали в ИФА тест-наборами, на наличие специфических антител к различным вирусам (вирусу инфекционного бронхита кур, вирусу инфекционной бурсальной болезни,
вирусу гриппа птиц).
Проведенные исследования показали, что в пробах сывороток крови не обнаружено
антител к вирусам инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальной болезни,
гриппа птиц.
Таким образом, штамм вируса Newcastle disease КМИЭВ-36 обладает по сравнению с
прототипом более высокой биологической активностью 109,8 ЭИД50/см3 и может быть использован для изготовления вакцины в качестве штамма-антигена с высокими иммуногенными свойствами.
Источники информации:
1. А.с. СССР 826584, МПК3 А 61K 39/17, 1982.
2. Патент России 2259844, МПК7 А 61K 39/17, А 61P 31/12, 2005 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
81 Кб
Теги
by12749, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа