close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12761

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 12761
(13) C1
(19)
A 01N 63/00
ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AURANTIACA
БИМ B-446Д, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ГРИБНЫХ
И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ РАСТЕНИЙ
(21) Номер заявки: a 20080531
(22) 2008.04.22
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт микробиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Коломиец Эмилия Ивановна; Купцов Владислав Николаевич;
Сверчкова Наталья Владимировна;
Мандрик Марина Николаевна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) RU 2235771 С2, 2004.
BY 5073 С1, 2003.
RU 2203945 С1, 2003.
SU 1805849 А3, 1993.
RU 2121271 С1, 1998.
ФЕКЛИСТОВА И.Н. и др. Земляробства
i ахова раслiн. -2006. - № 2. - С. 42-44.
BY 12761 C1 2009.12.30
(57)
Штамм бактерий Pseudomonas aurantiaca БИМ В-446Д, обладающий антагонистической активностью в отношении грибных и бактериальных патогенов растений.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к разработке микробиологических
средств защиты растений от болезней, и касается нового штамма Pseudomonas aurantiaca
БИМ В-446Д, эффективного против фитопатогенов грибной и бактериальной природы.
Известен штамм Pseudomonas aureofaciens 51 - антагонист грибов Fusarium culmorum,
Fusarium graminearum, Fusarium nivale, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Tilletia caries возбудителей заболеваний пшеницы. Однако, характеризуясь выраженной антифунгальной активностью, штамм не способен контролировать развитие болезней растений бактериальной этиологии [1].
Известен штамм Pseudomonas putida BKM В-1743Д, способный подавлять рост фитопатогенных грибов рода Fusarium и бактерий Erwinia. Тем не менее следует отметить, что
спектр антагонистической активности культуры сравнительно узкий, штамм Pseudomonas
putida BKM В-1743Д неэффективен против важных сельскохозяйственных фитопатогенов
родов Alternaria, Botrytis, Colletotrichum, Rhizoctonia, Pleiochaeta, Phytophthora, Pseudomonas и Xanthomonas [2].
Известен штамм Pseudomonas lemoignei BKM B-6615, обладающий способностью стимулировать рост растений, ингибировать рост фитопатогенных грибов Alternaria radiciana,
Botrytis cinerea, Fusarium solani, Fusarium sambucinum, Helmintosporium sativum, защищать
от почвенных патогенов в процессе вегетации и хранения. Однако отсутствуют сведения
об антибактериальной активности штамма, кроме того, для культивирования бактерий ис-
BY 12761 C1 2009.12.30
пользуется дорогостоящая питательная среда с мясопептонным бульоном (МПБ), что не
приемлемо для промышленного производства [3].
Наиболее близким к заявляемому является бактериальный штамм Pseudomonas fluorescens P469, рекомендованный для подавления широкого спектра патогенов растений,
включая грибы и бактерии родов Alternaria, Colletotrichum, Fusarium, Rhizoctonia, Phoma,
Phytophthora, Oospora, Erwinia и Pseudomonas [4].
К основным недостаткам штамма-прототипа относится:
1) сравнительно невысокая антагонистическая активность в отношении большинства
испытанных грибных и бактериальных патогенов (угнетение роста мицелия гриба только
в местах соприкосновения с бактериальным штрихом; диаметр зон задержки роста бактериальных патогенов 15-20 мм);
2) отсутствие данных о способности штамма контролировать развитие таких вредоносных фитопатогенов, как Botrytis, Helmintosporium, Nectria, Fusicladium, Pleiochaeta,
Penicillum, Xanthomonas;
3) для культивирования штамма используются дорогостоящие питательные среды:
ЛВ, в состав которой входит триптон и дрожжевой экстракт, МПБ, Кинга Б, минимальная
синтетическая среда М9 с глюкозой;
4) нет данных о способности штамма утилизировать дешевые многокомпонентные
субстраты типа осадка городских сточных вод (ОГСВ), загрязняющие окружающую среду.
Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, характеризующегося комплексной антагонистической активностью в отношении грибных и бактериальных
патогенов растений и способного к росту на дешевом субстрате - осадке городских сточных вод, рациональное использование которого будет способствовать охране окружающей среды.
Указанная цель достигается путем получения штамма P. aurantiaca БИМ В-446Д, характеризующегося высокой антифунгальной и антибактериальной активностями, а также
способностью к росту и продукции антимикробных метаболитов на ОГСВ, что, с одной
стороны, удешевляет процесс ферментации, а с другой, способствует решению экологических проблем, связанных с утилизацией осадка городских сточных вод.
Штамм P. aurantiaca БИМ В-446Д выделен из лигниноцеллюлозных отходов методом
накопительной культуры на среде с гумином. 1 г лигниноцеллюлозных отходов вносили в
среду, содержащую в качестве единственного источника углерода гумин и солевой состав
среды Мейнелла (K2НРО4 - 7,0; KН2РО4 - 3,0; MgSO4 - 0,1; (NH4)2SO4 - 1,0) и культивировали в течение 1 недели на качалке (200 обр/мин) с последующим высевом на аналогичные агаризованные среды с гумином. Штамм депонирован в Коллекции непатогенных
микроорганизмов ГНУ "Институт микробиологии НАН Беларуси" под регистрационным
номером БИМ В-446Д. Культура также поддерживается в коллекции лаборатории средств
биологического контроля ГНУ "Институт микробиологии НАН Беларуси".
Штамм хранится при + 4 °С на агаризованной среде с МПБ (МПА), рН 7,0-7,2; перевивка - 1 раз в 6 месяцев.
Культурально-морфологические свойства.
Колонии на МПА: 3-5 мм в диаметре, круглые, выпуклые, с ровным краем, прозрачные, просвечиваются в проходящем свете. Окраска колоний и среды может варьировать в
зависимости от питательной среды и возраста культуры. Может синтезировать несколько
пигментов. Так, на МПА, среде Чапека штамм синтезирует желто-зеленый, флюоресцирующий в УФ пигмент, растворимый в воде, который окрашивает питательную среду в
соответствующий цвет. На среде Кинд Б синтезирует оранжевый пигмент, также выделяемый в среду, растворимый в воде и спирте.
Клетки: прямые или слабо изогнутые палочки 0,39-0,45 × 1,4-4,1 мм, одиночные, в парах, реже в коротких цепочках. Характер подвижности клеток соответствует полюсному
расположению жгутиков. Грамотрицательные.
2
BY 12761 C1 2009.12.30
Физиолого-биохимические свойства.
Штамм хорошо растет на натуральных (МПА) и синтетических (Чапека) средах, не
нуждаясь в факторах роста.
В качестве источника азота может использовать пептоны, соли аммония или нитратов.
В качестве источников углерода - пептоны, глюкозу, сахарозу, D-ксилозу, ионозит, сорбит, глюканат, цитрат, ацетат.
Строгий аэроб, мезофил, не растет при 41 °С. Для штамма характерны положительные
тесты на оксидазу, L-аргининдигидролазу, разжижение желатина, редукцию нитратов до
газообразных форм азота (денитрофикацию) и отрицательные тесты на гидролиз Tween80, усвоение адонита и бутирата.
Штамм не является патогенным, токсигенным и токсичным. Токсикологические исследования штамма проводились на белых мышах. Установлено, что при внутрижелудочном, внутрибрюшинном и интраназальном введении его суспензии во всех исследуемых
концентрациях от 105 до 1010 не вызывает гибели животных. Отклонений в поведении, поедаемости корма, состоянии шерстного покрова, двигательной активности опытных животных по сравнению с контрольными не выявлено. При введении фильтрата 3-суточной
жидкой культуры Pseudomonas aurantiaca БИМ В-446Д подкожно в заднюю лапку белым
мышам гибели опытных животных и некроза тканей на месте введения не выявлено.
Внутрибрюшное введение смыва суспензии агаровой культуры (107 микробных клеток) и
убитой подогреванием при 80 °С в течение 30 мин не вызывали гибели опытных животных. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что штамм может использоваться в микробиологическом производстве.
Суть предлагаемого изобретения иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
Для изучения спектра антимикробного действия P. aurantiaca БИМ В-446Д использовали метод лунок [5]. Чашки Петри с 2 % агаризованным бульоном Хоттингера заливали
вторым слоем 1,2 % агаризованного бульона Хоттингера с тест-культурой патогена, выросшей до экспоненциальной фазы роста в жидкой питательной среде. Затем сверлом
(диаметром 8 мм) делали лунки, в которые вносили исследуемый антагонист. Результаты
оценивали через 1-3 суток после инкубации при 28 °С по зонам лизиса патогенных тесткультур (табл. 1). Культивирование антагониста проводили на модифицированной нами
жидкой питательной среде Мейнелла (г/л): меласса - 30,0; K2HPO4 - 7,0; КН2РО4 - 3,0;
MgSO4 - 0,1; цитрат натрия - 0,5; (NH4)2SO4 - 1,0.
Согласно полученным данным (табл. 1), штамм P. aurantiaca БИМ В-446Д характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра грибных
и бактериальных патогенов растений и по большинству показателей превосходит прототип. Диаметр зон задержки роста бактериальных патогенов штаммом P. aurantiaca БИМ
В-446Д составляет 18-27 мм, а прототипом - 15-20 мм. Антифунгальная активность штамма
P. aurantiaca БИМ В-446Д проявляется ко всем изучаемым фитопатогенным грибам, диаметр
зон задержки роста составляет 15-36 мм, прототип в основном характеризуется образованием зон угнетения мицелия гриба в месте соприкосновения с бактериальным газоном.
Пример 2.
Фитозащитное действие штамма P. aurantiaca БИМ В-446Д изучали на проростках люпина при последовательной обработке семян суспензией фитопатогенного микроорганизма (1⋅106 КОЕ/мл) и жидкой культурой антагониста, разведенной в 10 раз, с последующей
инкубацией их во влажных камерах в чашках Петри (in vitro) или посевом в сосуды со
стерильной почвой (in vivo). Результаты эксперимента учитывали на 7-е сутки по интенсивности развития болезни на проростках (табл. 2, 3). Анализ результатов опыта показал,
что обработка семян жидкой культурой P. aurantiaca БИМ В-446Д приводила к снижению
развития антракноза в опыте in vitro на 43 %, а в опыте in vivo на 73 %, а развитие фузариоза подавлялось полностью в обоих экспериментах.
3
BY 12761 C1 2009.12.30
Таблица 1
Спектр антимикробной активности штамма P. aurantiaca БИМ В-446Д
P. aurantiaca P. fluorescens P469
БИМ В-446Д
(прототип)
Метод
Метод
Метод
лунок*
лунок* штриха**
Фитопатогены/заболевание
Грибные фитопатогены
Alternaria brassicae/альтернариоз капусты
22,5±1,5
++
Colletotrichum atraventa/антракноз зерновых культур
не иссл.
++
Colletotrichum lupini L2/антракноз люпина
29,0±0,6
нет данных
Botrytis cinerea L1/серая гниль зернобобовых
36,0±0,5
нет данных
Botrytis cinerea B1/серая гниль овощных культур
26,0±0,4
нет данных
Helmintosporium sp./гельминтоспориоз злаковых
23,5±0,5
нет данных
Nectria galligena Вres./европейский рак плодовых
21,5±1,5
нет данных
Fusarium avenae/фузариоз зерновых культур
31,5±0,5
нет данных
Fusarium culmorum F-55043/фузариоз злаков, сухая гниль
30,5±0,5
+
картофеля
Fusarium solani/корневая гниль
не иссл.
+
Fusarium oxysporum F-55071/фузариоз овощных и зерно28,5±1,5
+
бобовых
Fusarium glamineorum/фузариоз
не иссл.
++
Fusarium oxysporum pv. lupini/фузариоз люпина
27,5±1,3
нет данных
Fusicladium dendriticum Str./парша яблонь
25,4±0,5
нет данных
Pleiochaeta setosa L3/бурая пятнистость люпина
15,0±0,2
нет данных
Penicillum espansum/кагатная гниль сахарной свеклы
32,8±0,5
нет данных
Phoma betae/кагатная гниль сахарной свеклы
30,5±0,8
нет данных
Phoma esigia/фомозная гниль
не иссл.
10-30
Rhizoctonia solani/ризоктониоз капусты
33,5±0,8
+
Phytophthora infestans/фитофтороз
не иссл.
+
Oospora lactis/резиновая гниль картофеля
не иссл.
10-30
Бактериальные/фитопатогены
Xanthomonas phaseoli БИМ В-279/пустульный бактериоз сои
22±0,5
нет данных
Xanthomonas compestris 1/сосудистый бактериоз капусты,
18,3±0,5
нет данных
моркови
Xanthomonas beticola 8717/туберкулез корней овощных
21,5±0,5
нет данных
культур
Pseudomonas syringae БИМ В-280/бактериальный ожог сои
27,0±0,5
нет данных
Pseudomonas syringae 3-3/бактериальный рак плодовых
24,5±1,0
нет данных
Pseudomonas solanacearum № 9049/бурая гниль или вилт
не иссл.
15-20
картофеля
Pseudomonas sp. № 37/клубневая гниль картофеля
не иссл.
15-20
Pseudomonas sp. № 115/мягкая гниль капусты
не иссл.
15-20
Pseudomonas sp. № 116/мягкая гниль картофеля
не иссл.
15-20
Erwinia carotovora pv. carotovora S39/резиновая гниль карне иссл.
15-20
тофеля
*- размер зон ингибирования роста патогена определяли по диаметру, мм;
** - зоны ингибирования роста патогена оценивались по двум параметрам:
+ - зона угнетения роста мицелия гриба в месте соприкосновения гриба с бактериальным штрихом;
++ - обширная зона угнетения роста мицелия гриба не только в месте соприкосновения с бактериальным штрихом, но и в сопредельной области.
4
BY 12761 C1 2009.12.30
Таблица 2
Эффективность фитозащитного действия разбавленной в 10 раз жидкой культуры
P. aurantiaca БИМ В-446Д при обработке семян люпина в опыте in vitro
Развитие болезни, %
антракноз
фузариоз
(С. lupini L2)
(Fusarium spp.)
100
30
40
0
Антагонисты
Контроль (без обработки антагонистами)
P. aurantiaca БИМ В-446Д
Таблица 3
Эффективность фитозащитного действия разбавленной в 10 раз жидкой культуры
P. aurantiaca БИМ В-446Д при обработке семян люпина в опыте in vivo
Развитие болезни, %
антракноз
фузариоз
(С. lupini L2)
(Fmarium spp.)
83
30
10
0
Антагонисты
Контроль (без обработки антагонистами)
P. aurantiaca БИМ В-446Д
Пример 3.
Фитозащитное действие бактерий P. aurantiaca БИМ В-446Д на вегетирующие растения люпина и сои изучали при их последовательном опрыскивании споровой суспензией
грибного (1⋅106 КОЕ/мл) или культуральной жидкостью бактериального патогенов и разбавленной в 10 раз жидкой культурой антагониста в количестве 20 мл на 1 сосуд (15 растений). Результаты эксперимента учитывали на 7-е сутки по интенсивности развития
болезни на вегетирующих растениях.
Согласно полученным результатам, обработка всходов жидкой культурой P. aurantiaca
БИМ В-446Д позволила снизить развитие антракноза на 42 %, серой гнили на 36 % и бактериального ожога на 40 % (табл. 4).
Таблица 4
Эффективность фитозащитного действия разбавленной в 10 раз жидкой культуры
P. aurantiaca БИМ В-446Д при обработке вегетирующих растений люпина и сои
Развитие болезни, %
люпин
соя
Антагонисты
бактериальный
антракноз
серая гниль
ожог (P. syringae
(С. lupini L2) (В. cinerea L1)
БИМ В-280)
Контроль (без обработки антагонистами)
100
100
78
P. aurantiaca БИМ В-446Д
48
64
38
Пример 4.
С целью изучения способности бактерий P. aurantiaca БИМ В-446Д к росту и продукции антимикробных метаболитов на осадке городских сточных вод, предоставленном сотрудниками Минской очистной станции УП "Минскводоканал" (средний состав ОГСВ
характеризуется содержанием: сухие вещества (СВ) - 276,0 г/л, органические вещества
(ОВ) - 66,9 % СВ; С - 4,5 % СВ; N - 2,8 % СВ; Р2O5 - 5,9 % СВ, общие сахара (ОС) - 19,5 %
СВ, а также водорастворимые вещества - 3,3 % СВ, легкогидролизуемые полисахариды 5
BY 12761 C1 2009.12.30
8,2 % СВ, жиры - 9,9 % СВ; целлюлоза - 40,2 % СВ; белок - 10,6 % СВ; лигнин - 39,3 %),
культуру выращивали в течение 4-х суток в жидкой среде с различными концентрациями
ОГСВ. Анализировали титр клеток антагониста с использованием метода предельных разведений [6] и антимикробную активность методом лунок [5].
Согласно данным табл. 5, штамм P. aurantiaca БИМ В-446Д способен расти на средах с
ОГСВ в концентрациях 60-100 г/л (16-28 г/л сухих веществ (СВ)), при этом его титр и антагонистическая активность достигают такого же уровня, как и на контрольной полноценной среде Мейнелла с мелассой.
На основании полученных результатов можно сделать вывод о целесообразности использования ОГСВ в качестве единственного источника углерода и азота для выращивания
бактерий P. aurantiaca БИМ В-446Д как дешевого и доступного субстрата, утилизация которого вносит вклад в решение проблем охраны окружающей среды от загрязнений.
Таблица 5
Титр и антимикробная активность бактерий P. aurantiaca БИМ В-446Д
на средах с различными концентрациями ОГСВ
Диаметр зон задержки роста
патогена, мм
Среда культивирования
Титр, 10
P. syringae
F. oxysporum
БИМ В-280
Среда Мейнелла с 30 г/л (22,8 г/л СВ) мелассой 3,3±0,4
25,0±0,9
26,5±0,9
60 г/л ОГСВ (16,8 г/л СВ)
4,0±0,3
26,5±0,9
27,5±0,5
80 г/л ОГСВ (22,3 г/л СВ)
4,4±0,4
26,5±0,9
26,1±0,4
100 г/л ОГСВ (28 г/л СВ)
2,5±0,1
25,3±0,9
25±0,9
НСР0,5
0,5
1,1
1,0
9
Пример 5.
Для определения способности штамма P. aurantiaca БИМ В-446Д потреблять компоненты ОГСВ в процессе четырехсуточного культивирования проводился анализ количества содержания основных компонентов ОГСВ - лигнина [7], целлюлозы [8], легко- и
трудногидролизуемых полисахаридов, водорастворимых (ВРВ) и экстрактивных веществ в среде [7]. В результате проведенных исследований установлено, что в процессе роста
культуры на ОГСВ содержание лигнина уменьшается в 1,2 раза, а целлюлозы - в 1,4 раза.
Количество легкогидролизуемых полисахаридов возрастает в 1,3 раза, а трудногидролизуемых полисахаридов уменьшается в 1,2 раза. На протяжении 3-х суток культивирования
происходит снижение ВРВ, а на 4-е сутки количество ВРВ резко увеличивается. Содержание экстрактивных веществ в процессе культивирования микроорганизмов на вторые сутки возрастает, а на протяжении двух последующих снижается в 1,5 раза. Полученные
результаты свидетельствуют о способности штамма Р. aurantiaca БИМ В-446Д к потреблению трудноутилизируемых компонентов ОГСВ.
Пример 6.
Потребление в процессе роста бактерий P. aurantiaca БИМ В-446Д трудноутилизируемых компонентов ОГСВ осуществляется благодаря способности продуцировать специфические ферменты, участвующие в разложении компонентов отходов. Ферментативную
активность P. aurantiaca БИМ В-446Д на средах с МПБ, ОГСВ и лигнином (как трудноразлагаемым компонентом ОГСВ) анализировали спектрофотометрически с использованием
хромогенных субстратов Magazymes [9]. Установлена способность штамма P. aurantiaca
БИМ В-446Д продуцировать литические ферменты амилазу, протеазу, целлюлазу, пероксидазу и лакказу. Синтез амилазы и протеазы отмечен как на легко- (МПА), так и на труд6
BY 12761 C1 2009.12.30
ноутилизируемых средах, тогда как появление целлюлазной, пероксидазной и лакказной
активностей связано с деструкцией трудногидролизуемых компонентов (лигнина, целлюлозы и их производных) в процессе культивирования.
Таблица 6
Ферментативная активность бактерий P. aurantiaca БИМ В-446Д
на различных питательных средах
Ферментативная активность, ед/мл
целлюлаза
протеаза
амилаза
пероксидаза
МПБ
0
0,01
0,16
0
*
Лигнин +СС
0,05
0
0,11
0,05
ОГСВ
0,01
0.3
0,11
0
*
СС - солевой состав среды Мейнелла.
Среда
лакказа
0
0,05
0,05
Таким образом, штамм P. aurantiaca БИМ В-446Д по важнейшим показателям - широкому спектру антимикробного действия по отношению к грибным (Alternaria, Colletotrichum, Fusarium, Rhizoctonia, Phoma, Botrytis, Helmintosporium, Nectria, Fusicladium,
Pleiochaeta, Penicillum) и бактериальным (Xanthomonas, Pseudomonas) фитопатогенам,
биологической эффективности, фитозащитному потенциалу, способности к продукции
комплекса литических ферментов, обеспечивающих возможность его выращивания на
дешевом многокомпонентном субстрате - осадке городских сточных вод, превосходит
прототип и может быть использован для защиты растений от болезней грибной и бактериальной этиологии.
Источники информации:
1. Патент RU 2203945 С1, МПК7 C 12N 1/20, A 01N 63/00//(C 12N 1/20//C 12R 1:38), 2003.
2. Патент SU 1805849, МПК А 01N 63/00, 1993.
3. Патент RU 2121271 С1, МПК6 A 01N 63/00, C 12N 1/20//(C 12N 1/20//C 12R 1:38), 1998.
4. Патент RU 2235771 С2, МПК7 C 12N 1/20, A 01N 63/00//(C 12N 1/20//C 12R 1:39),
2004 (прототип).
5. Сеги Й. Методы почвенной микробиологии. - М.: Колос, 1983. - С. 296.
6. Практикум по микробиологии: Учебное пособие / Под ред. Н.С. Егорова. - М.: Изд-во
Моск. ун-та, 1976. - С. 307.
7. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии
древесины и целлюлозы. - М.: Экология, 1991. - С. 320.
8. Петербургская А.В. Практикум по агрономической химии. - Л.: Колос, 1968. - С. 439.
9. Megazyme II. Soluble Chromogenic Substrates. Wicklow: Megazyme, 2006.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
7
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
131 Кб
Теги
by12761, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа