close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12778

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.02.28
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 01G 7/00
G 01N 33/52
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО
ПИГМЕНТА, В ЧАСТНОСТИ ПРОТОХЛОРОФИЛЛИДА, В ТКАНИ
РАСТИТЕЛЬНОГО ОБЪЕКТА ПО СПЕКТРАЛЬНЫМ ПАРАМЕТРАМ
(21) Номер заявки: a 20071617
(22) 2007.12.27
(43) 2009.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биофизики и
клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Савченко Галина Евсеевна;
Кабашникова Людмила Федоровна
(BY)
BY 12778 C1 2010.02.28
BY (11) 12778
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси"
(BY)
(56) ДОМАНСКАЯ И.Н. // Известия Национальной академии наук Беларуси,
Cерия биологических наук. - 2000. № 4. - С. 42-45.
SU 1450788 А1, 1989.
GB 1423991 A, 1976.
JP 2001264254 А, 2001.
ГАВРИЛЕНКО В.Ф. и др. Большой
практикум по фотосинтезу. - Москва,
2003. - С. 70-96.
(57)
Способ определения содержания флуоресцирующего пигмента, в частности протохлорофиллида, в ткани растительного объекта по спектральным параметрам, заключающийся в том, что препарат из ткани растительного объекта закрепляют на держателе,
выполненном в форме трубки с фиксированным шагом ее поворота, охлаждают в жидком
азоте и регистрируют спектры флуоресценции в разных участках препарата; затем осуществляют обработку без демонтажа препарата путем размораживания при комнатной температуре в течение не менее 30 мин и нагревания при 70-75 °С в течение 3-7 мин в
суховоздушной камере; вновь охлаждают препарат в жидком азоте и регистрируют низкотемпературные спектры флуоресценции в тех же участках препарата, где зарегистрированы спектры флуоресценции до нагревания, и определяют в них содержание пигмента по
величине интенсивности флуоресценции в области 633 нм.
Изобретение относится к биологическим наукам, в частности к биофизике биохимии и
физиологии растений, и может быть использовано в любых экспериментах, где необходимо произвести измерение параметров флуоресценции и содержания флуоресцирующего
пигмента (в частности, протохлорофиллида (Пд), присутствующего в растительном объекте в небольшом количестве, но в виде молекулярных агрегатов.
Известен способ определения содержания Пд после экстракции пигментов из тканей
растений растворителями с последующим фотометрированием растворов [1]. Однако этот
способ длителен и требует большого количества растительного материала. Недостатком
BY 12778 C1 2010.02.28
его является то, что определенный таким способом Пд представляет собой весьма усредненную пробу, не учитывающую неравномерность распределения пигмента в листе или
другом органе растения и не может отражать количественного содержания пигмента в
минимально возможном участке листа. Способ не предусматривает определения спектральных свойств объекта.
Известен способ обнаружения Пд-пигментов в растительных тканях с помощью измерения спектров флуоресценции нативных листьев при температуре жидкого азота [2], позволяющий тестировать очень низкое количество пигментов. Этот метод дает информацию о
состоянии всех флуоресцирующих компонентов растительной клетки в нативном состоянии,
но его трудно прямо применить для оценки их количества, поскольку измеряемая интенсивность свечения может не отражать их содержания. Это связано как с неравномерным
распределением пигментов в мембранах пластид, так и с их агрегированным состоянием,
при котором происходит тушение флуоресценции, которое объективно трудно оценить. В
частности, в низкотемпературных спектрах флуоресценции этиолированных листьев в
норме обнаруживаются как минимум две пространственно разделенные формы Пд: длинноволновая с максимумом флуоресценции при температуре жидкого азота при 657 нм
(Пд657) - агрегаты пигмента, и мономерная коротковолновая с максимумом при 633-635 нм
(Пд633). Для того чтобы определить общее содержание любого флуоресцирующего пигмента в ткани листа, необходимо упразднить межмолекулярные взаимодействия внутри
пигментных агрегатов, максимально приблизив состояние пигмента к наблюдаемому в
растворах. При этом в случае Пд форма Пд657 в спектре флуоресценции должна полностью превратиться в форму Пд633, а интенсивность флуоресценции последней при этом
должна достичь максимальной величины, пропорциональной концентрации Пд в анализируемом участке ткани листа.
Известен способ, при котором растительный объект закрепляют на плоском металлическом держателе, замораживают, погружают держатель в криостат в строго фиксированном положении и регистрируют параметры флуоресценции объекта в жидком азоте, затем
кипятят его несколько минут прямо на металлическом держателе, просушивают, вновь
замораживают и регистрируют спектры флуоресценции такого жестко денатурированного
образца с целью определения в нем содержания пигментов по интенсивности свечения
всей полосы в области 615-660 нм [3]. Недостатком этого способа является неизбежное
растрескивание препарата при очень быстрой смене температур, осложнение контроля
температуры денатурации объекта для получения воспроизводимых результатов и снижение интенсивности свечения полосы Пд при перегреве. При этом способе монтажа препарата практически невозможно многократное измерение спектров в разных участках одного
и того же листа. Нами показано, что при кипячении образца, закрепленного на металлическом
держателе, может появляться дополнительная полоса свечения Пд при 690 нм. На фиг. 1
приведены низкотемпературные спектры флуоресценции листьев этиолированных
проростков ячменя (участков листа, находящихся на расстоянии 1 см от верхушки) до (1)
и после (2) кипячения образца, закрепленного на металлическом держателе. Возбуждение 440 нм, -196 °С. На осях ординат - величина интенсивности флуоресценции в относительных единицах. На оси абсцисс - длина волны, нм.
Важность контроля температуры денатурации для определения содержания Пд в растительном объекте можно продемонстрировать следующим примером. На фиг. 2 представлена спектральная картина превращений разных форм Пд в одинаковых участках листа 8дневных этиолированных проростков ячменя после 2 мин нагревания в воде: 1 - 25 °С,
2 - 40 °С, 3 - 45 °С, 4 - 50 °С, 5 - 60-75 °С (возбуждение - 440 нм, регистрация при -196 °С).
Каждая кривая является результатом усреднения нескольких измерений (разные биологические повторности), стандартная ошибка которых может достигать 10 %. Видно, что при
нагревании происходит полное превращение длинноволновой формы пигмента Пд657 в
коротковолновую Пд633, но изменение интенсивности флуоресценции Пд633 носит нели2
BY 12778 C1 2010.02.28
нейный характер: интенсивность флуоресценции Пд633 сначала падает, по-видимому, за
счет тушения (кривая 3), и только после завершения этого процесса вновь увеличивается
до максимума (кривая 5). Вполне вероятно, что температурный предел этого перехода
может несколько отличаться у разных видов растений из-за различий в морфологии листа
или другого органа растения.
Известен способ денатурации с помощью детергентов, при котором в спектрах денатурированного образца присутствует только одна форма Пд633 [3]. Способ включает разделение листа на 2 симметричных отрезка, обработку с помощью инфильтрации ткани
одной половины листа раствором детергента (в контрольную половину инфильтрируют
воду) для разрушения нативной структуры мембран и упразднения пигмент-пигментных
взаимодействий; монтаж обеих половинок на 2-х разных плоских металлических держателях, охлаждение их до температуры жидкого азота и измерение низкотемпературных
спектров флуоресценции в двух параллельных пробах (с детергентом и без детергента).
Однако введение в лист детергента с помощью инфильтрации требует не только затрат
времени, но и демонтажа препарата при последовательном измерении флуоресцентных
параметров либо параллельного измерения, что исключает возможность мониторинга
флуоресцентных параметров ткани и содержания пигмента в одном и том же участке листа.
Задачей изобретения является разработка быстрого и надежного способа измерения
параметров флуоресценции как можно большего числа участков ткани растительного объекта без демонтажа препарата, повышение точности определения содержания флуоресцирующего пигмента, в частности протохлорофиллида, в ткани и возможность сопоставлять
его содержание с другими флуоресцентными параметрами нативного объекта в одном и
том же минимальном по размеру анализируемом участке.
Поставленная задача решается предлагаемым способом определения содержания
флуоресцирующего пигмента, в частности протохлорофиллида, в ткани растительного
объекта по спектральным параметрам, для чего препарат из ткани растительного объекта
закрепляют на держателе, выполненном в форме трубки, с фиксированным шагом ее поворота. Затем его охлаждают в жидком азоте и регистрируют спектры флуоресценции в
разных участках препарата. После этого без демонтажа препарата осуществляют обработку,
путем размораживания при комнатной температуре в течение не менее 30 мин и последующего нагревания при 70-75 °С в течение 3-7 мин в суховоздушной камере. Затем препарат охлаждают в жидком азоте и регистрируют низкотемпературные спектры флуоресценции в тех же участках растительного препарата, где были зарегистрированы спектры
флуоресценции до нагревания. Далее определяют в этих участках содержание пигмента по
величине интенсивности флуоресценции в области 633 нм.
Способ осуществляют следующим образом. Анализируемый растительный объект (например, лист) закрепляют липкой прозрачной лентой на конце трубки-держателя (из
инертного нефлуоресцирующего материала) с фиксированным шагом вращения, опускают
в криостат с жидким азотом и регистрируют спектры флуоресценции в разных участках
листа, поворачивая держатель. Это дает информацию о состоянии пигментного аппарата
исследуемого растительного объекта (и о взаимодействиях любых флуоресцирующих
внутриклеточных соединений хлорофиллов, восстановленных нуклеотидов, белков). Затем держатель с образцом выдерживают некоторое время при комнатной температуре в
темноте для предварительного оттаивания (не менее 30 мин) и переносят далее в воздушный термостат на 3-7 мин при 70-75 °С для окончательного упразднения межмолекулярных взаимодействий. После этого держатель с образцом вновь опускают в криостат с
жидким азотом и регистрируют низкотемпературные спектры флуоресценции растительного объекта с целью определения в них содержания Пд по величине интенсивности
флуоресценции единственной полосы в области 633 нм в тех же участках растительного
препарата, где были зарегистрированы флуоресцентные параметры до нагревания. Только
в этом случае интенсивность свечения этой полосы пропорциональна содержанию пигмента в данном типе растительной ткани.
3
BY 12778 C1 2010.02.28
Использование заявляемого способа позволяет определять непосредственно в ткани
объекта любые флуоресцирующие пигменты, присутствующие в очень незначительных
количествах, но склонные к агрегации (не только протохлорофиллид, но и хлорофилл в
зеленеющих тканях листа, лепестках, а также в поверхностном слое плодов и клубней), и
таким образом оценивать биосинтетические способности минимальных по размеру участков
растительных тканей и сравнивать их с другими процессами, происходящими в растительной клетке, которые отражаются на параметрах флуоресценции нативного объекта до
нагревания. Изобретение может быть использовано для мониторинга спектральных свойств
и локального содержания пигментов в ткани растительных объектов во всех современных
флуориметрах.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1
На фиг. 3 представлены низкотемпературные спектры флуоресценции листьев этиолированных проростков ячменя (участков листа, находящихся на расстоянии 1 см от верхушки) до и после нагревания в суховоздушном термостате. 1 - листья до нагревания, 2 те же листья после регистрации низкотемпературных спектров, размороженные при комнатной температуре в течение 30 мин без демонтажа и инкубированные 5 мин в суховоздушном термостате при 75 °С (возбуждение - 440 нм, регистрация при -196 °С. На осях
ординат - величина интенсивности флуоресценции в относительных единицах. На оси
абсцисс - длина волны, нм). Сравнение данных, приведенных на фиг. 1 и 3, свидетельствует о явном преимуществе более мягкого способа температурной денатурации для мониторинга содержания пигментов (фиг. 3) по сравнению с жестким кипячением (фиг. 1): при
нагревании в термостате интенсивность свечения при 633 нм выше, чем при кипячении
образца (размерность правой ординаты на фиг. 1 и 3 - разная).
Пример 2
На фиг. 4 показан один из вариантов измерения флуоресцентных параметров и содержания Пд, а именно результаты нескольких попарных измерений параметров флуоресценции (в данном случае - это две формы Пд, кривые 1) и содержания Пд (кривые 2) в разных
участках листа, подвергнутого такой физиологической обработке, в результате которой
изменилось соотношение форм Пд (иное, чем на фиг. 3, где преобладала форма Пд657).
1 - низкотемпературные спектры флуоресценции до нагревания, 2 - после размораживания
образца при комнатной температуре в течение 30 мин без демонтажа препарата и его нагревания в суховоздушном термостате в течение 5 мин при 75 °С. Условия регистрации
спектров аналогичны представленным на фиг. 1-3. Из приведенных данных видно, что до
нагревания в разных участках образца содержится примерно одинаковое количество двух
форм Пд при небольшом преобладании длинноволновой формы, а после нагревания во
всех трех участках обнаруживается разное количество Пд (интенсивность свечения Пд633
после нагревания хотя и выше, чем суммарная интенсивность форм Пд633 и Пд657 до нагревания, но неодинакова в разных участках анализируемого листа).
Источники информации:
1. Smith J.H.C., Coomber J. Absorption spectrum of protochlorophyll holochrome // Carn.
Inst. Wach. Year Book. - 1958-1959. - Vol. 58. - P.331.
2. Литвин Ф.Ф., Красновский А.А. Исследование процесса образования хлорофилла и
его состояния в листьях растений по спектрам флуоресценции // Известия АН СССР. Сер.
физ. - 1959. - Т. 23. - № 1. - С. 82-85.
3. Доманская И.Н. Определение эффективности переноса энергии от протохлорофиллида к хлорофиллу в зеленых и зеленеющих листьях ячменя // Весцi Нацыянальнай
акадэмii навук Беларусi. Сер. бiял. навук. - 2000. - № 4. - С. 42-45.
4
BY 12778 C1 2010.02.28
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 4
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Фиг. 3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
433 Кб
Теги
by12778, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа