close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY12989

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 12989
(13) C1
(19)
(46) 2010.04.30
(12)
(51) МПК (2009)
C 07D 495/00
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
КОНЪЮГАТЫ ЙОДИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ТИРОНИНА
С БИОТИНОМ ИЛИ 2-ИМИНОБИОТИНОМ В КАЧЕСТВЕ
БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВЯЗЫВАЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ
В ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
(21) Номер заявки: a 20081414
(22) 2008.11.11
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Новаковский Максим Евгеньевич; Вашкевич Ирина Игнатьевна; Свиридов Олег Васильевич
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) GUO S. et al. Tianjin Med. J., 2002,
vol.30, № 6, p. 347-349.
US 5648272 A, 1997.
US 4171432, 1979.
RU 2171807 C2, 2001.
US 2003/0186847 A1.
US 4040907, 1977.
US 3983099, 1976.
(57)
Конъюгат йодированного производного тиронина с биотином или 2-иминобиотином
общей формулы
Y
X
X
1
4
O
HN
O
NH
BY 12989 C1 2010.04.30
HN
,
X3
HO
X2
где X1 представляет собой H или I;
X2–H или I;
X3–H или I;
X4–H или I;
Y–O или NH.
NH
O
HN
S
O
Конъюгаты йодированных производных тиронина с биотином или 2-иминобиотином в
качестве бифункциональных связывающих компонентов в иммунодиагностических системах.
Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к новым химическим соединениям общей формулы:
BY 12989 C1 2010.04.30
Y
X
X
1
4
O
HN
O
NH
HN
X3
HO
X
2
,
NH
O
HN
(I)
S
O
где X1 представляет собой H или I;
X2-H или I;
X3-H или I;
X4-H или I;
Y-O или NH.
Заявляемые соединения могут быть использованы в качестве бифункциональных связывающих компонентов в иммунодиагностических системах с участием биотинсвязывающих соединений и антител против одного или нескольких йодтиронинов. В качестве
биотинсвязывающих соединений могут быть использованы авидины, стрептавидин, NeutrAvidin, NeutraLite Avidin™, антитела против биотина и (или) остатка биотина в составе
макромолекул, биотинсвязывающие протеины желтка яиц, биотинидаза.
В разной степени йодированные по фенильному и феноксильному кольцам производные тиронина являются природными низкомолекулярными соединениями. Среди них
3,3',5-трийод-L-тиронин (Т3) и 3,3',5,5'-тетрайод-L-тиронин (Т4, тироксин), вырабатываемые щитовидной железой, являются важными йодаминокислотными гормонами, которые
играют существенную роль в регуляции общего метаболизма, развития и дифференцировки тканей животных. Они регулируют экспрессию генов, связываясь с ядерными рецепторами клеток-мишеней [1] и их уровень в сыворотке крови является очень важным
клиническим и диагностическим показателем. 3,3',5'-трийодтиронин (обратный Т3), дийодтиронины и монойодтиронины являются продуктами ферментативного дейодирования
Т3 и Т4. Биотин (витамин Н) является важным коферментом ряда карбоксилаз у животных
и растений. Кроме того, он является природным лигандом для авидина, стрептавидина,
брадивидина и других биотинсвязывающих белков, с которыми связывается с очень высоким сродством (Ка≈10-12-10-14 М-1) даже в жестких условиях. 2-иминобиотин в отличие от
биотина полностью теряет сродство к биотинсвязывающим белкам в растворах с кислым
pH. Эти свойства витамина и его синтетического производного нашли широкое применение в разнообразных биохимических и медицинских научных и практических приложениях.
В литературе описано получение и применение широкого спектра производных тироидных гормонов, которые, в зависимости от внесенных изменений, обладают новыми и
полезными для практики свойствами. Запатентованы бифункциональные конъюгаты тироидных гормонов с ФАД [2], тирозином [3], рядом ферментов [4], инсулином [5], дикетопиперазинами [6], флуоресценом [7]. Недостаток - отсутствие у перечисленных
соединений способности связываться с биотинсвязывающими белками.
Известно высокомолекулярное соединение, способное связывать стрептавидин и антитела против тироксина, которое представляет собой биотинилированный конъюгат Т4 с
бычьим сывороточным альбумином [8] (прототип). Заявляемое соединение может быть
использовано в качестве связывающего компонента в иммуноферментной тест-системе
для определения уровня Т4 в сыворотке крови человека. Недостаток - конъюгаты с белками-носителями отличаются сильной вариацией связывающих свойств, нестабильностью,
небольшим сроком годности и, как следствие, сложностью в применении.
Задачей настоящего изобретения являются стабильные низкомолекулярные конъюгаты йодированных производных тиронина с биотином и 2-иминобиотином общей сруктур2
BY 12989 C1 2010.04.30
ной формулы 1. Наличие в заявляемых соединениях по одному остатку биотина и йодтиронина обеспечивает возможность связывания конъюгатов с одним связывающим центром биотинсвязывающего белка и с одним паратопом антитела против йодтиронина.
Такие конъюгаты могут быть использованы в качестве бифункциональных связывающих
компонентов в иммунодиагностических системах, в том числе в тест-системах для иммунохимического количественного определения Т3 или T4.
Поставленная задача решается заявляемыми соединениями, которые получают по схеме 1 путем N-ацилирования N-(3-аминопропил)биотинамида или N-(3-аминопропил)2иминобиотинамида N-оксисукцинимидным эфиром соответствующего N-ацетилйодтиронина, полученного реакцией N,N'-дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) в присутствии
N-гидроксисисукцинимида с исходным йодтиронином, предварительно ацетилированным
ацетоксисукцинимидом.
Схема 1
O
O
O
X4
1
+
O
X4
N
1
O
X
O
N
O
X3
HO
X2
O
OH
O
3
Y
HN
X4
X1
,
NH
O
O
HN
O
H2N
HN
S
соединение 1
O
3
HO
+ ДЦГК
HN
OH
2
+
O
X3
X2
O
O
X
NH2
HO
H
X
O
X2
N
O
4
O
где X1-H или I; X2-H или I; X3-H или I; X4-H или I; Y-О или NH.
Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Получение N-[2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5-дийодофенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил]-5-(2-оксо-гексагидро-1Н-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамида (соединение 1, где X1-I; X2-I; X3-I; X4-I; Y-О).
1 г (1,12 ммоль) пентагидрата натриевой соли L-тироксина растворяют в 300 мл этилового спирта и добавляют 220 мг (1,7 ммоль) ацетоксисукцинимида. Перемешивают 20 ч
при комнатной температуре, pH 8,5. Этанол упаривают в вакууме, остаток растворяют в
этилацетате и промывают 0,1 н. HCl, затем водой, высушивают Na2SO4, упаривают в вакууме. Получают 0,86 г (1,05 ммоль, выход 94 %) N-ацетилтироксина. Разлагается до достижения температуры плавления. Rf 0,28(EtAc-MeOH, 2:1).
0,165 г (0,2 ммоль) N-ацетилтироксина растворяют в 30 мл абс. диоксана и вносят
0,032 г (0,28 ммоль) N-оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0 °С и по каплям добавляют 0,045 мг (0,22 ммоль) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диоксана. Перемешивают 1 ч при 0 °С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, к фильтрату добавляют 0,29 г (0,24 ммоль)
трифторацетата N-(3-аминопропил)биотинамида в 2 мл 0,1 М NaHCO3 и перемешивают
2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывают, промывают последовательно водой, содой, водой, 0,1 М HCl, водой и высушивают безводным Na2SO4.
Получают 0,15 г (0,13 ммоль, выход 66 %) N-[2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,53
BY 12989 C1 2010.04.30
дийодофенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил]-5-(2-оксо-гексагидро-1Н-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамида. Разлагается до достижения температуры плавления.
Rf 0.43(EtAc-MeOH, 2:1). 1Н-ЯМР(500 МГц, d6-ДМСО), δ, м.д.: 1.30(м, 4Н, -СH2-), 1.48(м,
6Н, -СН2-), 1.79(с, 3Н, -СН3), 2.06(т, 2Н, J7.2, -NН-С(О)-СH2-), 2.82(дд, 1Н, J15.03, J212.46,
>СН-СНаНb-S-), 2.91(дд, 1H, J15.01, J213.31, >СН-СHаНb-S-), 3.05(м, 5Н, IIСН2-СH(СН<)-S+ -NН-СH2-СН2-СH2-), 4.13(м, 1H, -NH-СH(СН<)-СН(S-)-), 4.31(м, 1H, -NН-СH(СН<)СН2-S-), 4.42(м, 1H, -СН2-СH(NН-)-С(О)-), 6.39(с, 1H, -NH-СН(СН<)-СН(S-)-), 6.47(с, 1H,
-NH-СН(СН<)-СН2), 7.05(с, 2Н, HO-АrI2H2-), 7.77(уш.т, 1Н, J4.8, >СН-С(О)-NH-СН2-),
7.79(с, 2Н, -ArI2H2-СН2-), 8.06(уш. т, 1Н, J4.8, -(СН2)3-NH-С(O)-), 8.20(д, 1Н, J8.39,
СН3С(О)-NH-).
Пример 2
Получение N-[2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5-дийодофенокси)-3'-йодофенил)пропанамидо)пропил]-5-(2-оксо-гексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамида (соединение 1, где X1-Н; X2-I; X3-I; X4-I;Y-О).
0,75 г (1,12 ммоль) натриевой соли 3,3',5-трийод-L-тиронина растворяют в 300 мл этилового спирта и добавляют 220 мг (1,7 ммоль) ацетоксисукцинимида. Перемешивают 20 ч
при комнатной температуре, pH 8,5. Этанол упаривают в вакууме, остаток растворяют в
этилацетате и промывают 0,1 н. HCl, затем водой, высушивают Na2SO4, упаривают в вакууме. Получают 0,7 г(1,01 ммоль, выход 92 %) N-ацетилтрийодтиронина. Разлагается до
достижения температуры плавления. Rf 0,23(EtAc-MeOH, 2:1).
0,14 г (0,2 ммоль) N-ацетилтрийодтиронина растворяют в 30 мл абс. диоксана и вносят
0,032 г (0,28 ммоль) N-оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0 °С и по каплям добавляют 0,045 мг (0,22 ммоль) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диоксана. Перемешивают 1 ч при 0 °С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок
дициклогексилмочевины отфильтровывают, к фильтрату добавляют 0,29 г (0,24 ммоль)
трифторацетата N-(3-аминопропил)биотинамида в 2 мл 0,1 М NaHCO3 и перемешивают
2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывают, промывают последовательно водой, содой, водой, 0,1 М HCl, водой и высушивают безводным Na2SO4.
Получают 0,13 г (0,13 ммоль, выход 65 %) N-[2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5дийодофенокси)-3'-йодофенил)пропанамидо)пропил]-5-(2-оксо-гексагидро-1Н-тиено[3,4d]имидазол-4-ил)пентанамида. Разлагается до достижения температуры плавления. Rf
0.35(EtAc-MeOH, 2:1). 1Н-ЯМР(500 МГц, d6-ДМСО), δ, м.д.: 1.30(м, 4Н, -СH2-), 1.48(м, 6Н,
-СH2-), 1.79(с, 3H, -СH3), 2.06(т, 2Н, J7.2, -NH-С(О)-СH2-), 2.82(дд, 1H, J15.03, J212.46,
>СН-СНаHb-S-), 2.91(дд, 1Н, J15.01, J213.31, >СН-СHаНb-S-), 3.05(м, 5Н, >СН2-СH(СН<)-S+ -NН-СH2-СН2-СH2-), 4.13(м, 1H, -NН-СH(СН<)-CH(S-)-), 4.31(м, 1Н, -NН-СH(СН<)СН2-S-), 4.42(м, 1Н, -СН2-СH(NН-)-С(О)-), 6.39(с, 1H, -NH-СН(СН<)-СН(S-)-), 6.47(с, 1H,
...... C(OH) ......
6.74(d,
1H,
-NH-СН(СН<)-СН2),
6.56(d,
1H,
CH ...... CH ...... ),
...... C(OH) ......
......
......
), 7.06(с, 1H, ...... C(OH) ...... CI ...... CH ...... ), 7.77(уш. т, 1Н,
CH
CH
J4.8, >СН-С(О)-NH-СН2-), 7.79(с, 2Н, -АrI2H2-СН2-), 8.06(уш. т, 1H, J4.8, -(СН2)3-NH-С(O)-),
8.20(д, 1H, J8.39, СН3С(О)-NH-).
Пример 3
Получение N-(3-(2-ацетамидо-3-(4-(4-оксифенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил)-5-(2-иминогексагидро-1H-тиено[3,4-d[имидазол-4-ил)пентанамид (соединение 1,
где X1-Н; Х2-Н; Х3-I; Х4-I; Y-NH).
0,59 г (1,12 ммоль)3,5-дийод-L-тиронина растворяют в 300 мл этилового спирта и добавляют 220 мг (1,7 ммоль)ацетоксисукцинимида. Перемешивают 20 ч при комнатной
температуре, pH 8,5. Этанол упаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и
промывают 0,1 н. HCl, затем водой, высушивают Na2SO4, упаривают в вакууме. Получают
0,57 г (1,01 ммоль, выход 92 %)N-ацетилдийодтиронина. Разлагается до достижения температуры плавления. Rf 0,18(EtAc-MeOH, 2:1).
4
BY 12989 C1 2010.04.30
0,11 г (0,2 ммоль) N-ацетилдийодтиронина растворяют в 30 мл абс. диоксана и вносят 0,032 г (0,28 ммоль) N-оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0 °С и по каплям
добавляют 0,045 мг (0,22 ммоль) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диоксана. Перемешивают 1 ч при 0 °С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, к фильтрату добавляют 0,23 г (0,24 ммоль)
трифторацетата N-(3-аминопропил)2-иминобиотинамида в 2 мл 0,1 М NaHCO3 и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывают, промывают последовательно водой, содой, водой, 0,1 М HCl, водой и высушивают безводным
Na2SO4. Получают 0,11 г (0,13 ммоль, выход 66 %) N-(3-(2-ацетамидо-3-(4-(4-оксифенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил)-5-(2-иминогексагидро-1H-тиено[3,4d[имидазол-4-ил)пентанамида. Разлагается до достижения температуры плавления. Rf
0,43(EtAc-MeOH, 2:1). 1.30(м, 4Н, -СH2-), 1.48(м, 6Н, -СH2-), 1.79(с, 3Н, -СH3), 2.0(с, 2Н,
-NH-С(NН)-NH-), 2.06(т, 2Н, J7.2, -NН-С(О)-СH2-), 2.85(дд, 1Н, J1 5.03, J2 12.46, >СНСНаHb-S-), 3.05(м, 5Н, >СН2-СH(СН<)-S- + -NН-СH2-СН2-СH2-), 3.1(дд, 1H, J15.01, J213.31,
>СН-СHаНb-S-), 3.23(м, 2Н, >СH-СH<), 4.42(м, 1H, -СН2-СH(NН-)-С(О)-), 6.75(d, 2H,
...... C(OH) ...... CH ...... CH ...... ), 6.69(d, 2H, ...... C(OH) ...... CH ...... CH ...... ), 7.45 (с, 2Н,
-АrI2H2-СН2-), 7.8(м, 2Н, >СН-С(О)-NH-СН2- + HN = С<), 8.01(уш. т, 1Н, J4.8, -(СН2)3-NHС(О)-), 8.32(д, 1H, J8.39, СН3С(О)-NH-).
Заявляемые конъюгаты йодированных производных тиронина с биотином или 2иминобиотином могут быть использованы в качестве бифункциональных компонентов в
иммунодиагностических системах для количественного определения уровней свободных
тирогормонов, что подтверждается примерами конкретного выполнения. Представленные
примеры не ограничивают вариантов их применения.
Пример 4
Проведение иммуноферментного анализа свободного Т3 в сыворотке крови человека.
В полистирольные лунки планшета с иммобилизованным авидином вносят по 50 мкл калибровочных проб, содержащих 0, 1.5, 3, 6, 12 и 24 пмоль/л свободного Т3 или анализируемых образцов, содержащих свободный Т3, в дубликатах. Вносят во все лунки по 25 мкл
фосфатно-буферного раствора конъюгата антиТ3-пероксидаза хрена. Планшеты инкубируют
в течение 45 мин при комнатной температуре со встряхиванием, затем вносят во все лунки по
25 мкл конъюгата биотин-Т3 и продолжают встряхивание в течение 15 мин при комнатной
температуре. Затем удаляют жидкость из лунок и промывают их трижды фосфатнобуферным раствором, содержащим 0,9 % NaCl и 0,02 % Tween 20. Во все промытые лунки
добавляют по 100 мкл хромоген-субстратного буфера (раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина
в субстратном буфере с перекисью водорода) и инкубируют при комнатной температуре без
встряхивания в течение 15 минут. Останавливают реакцию добавлением во все лунки по
100 мкл раствора стоп-реагента (4,8 % раствор H2SO4). Измеряют на спектрофотометре оптическую плотность раствора во всех лунках при длине волны 450 нм.
В прямых координатах строят график зависимости оптического сигнала от концентрации свободного Т3 в калибровочных пробах (пмоль/л). Типичная для этой системы калибровочная кривая имеет линейную зависимость и максимальное значение сигнала в
диапазоне 1,6-2,2 о.е., который падает на 80 % в последней точке калибровочного диапазона. Значения концентраций свободного Т3, определенные в контрольных сыворотках,
попадают в предписанные интервалы (табл. 1).
Таблица 1
Открытие контрольных сывороток различных диапазонов концентраций
предписанные значения [сво- открытые значения [свободбодный Т3], пМ
ный Т3], пМ
контрольная сыворотка 1
2,8-4,0
3,7
контрольная сыворотка 2
8,9-2,7
10,3
контрольная сыворотка 3
13,9-24,2
24,0
5
BY 12989 C1 2010.04.30
Пример 5
Проведение лантанидного иммунофлуоресцентного анализа свободного Т4 в сыворотке крови человека.
В лунки микропланшета с иммобилизованными антителами к Т4 вносят последовательно по 0,03 мл калибровочных проб, содержащих 0, 2.5, 12, 24 и 72 пмоль/л свободного
Т4 или анализируемых образцов сывороток крови человека, содержащих свободный Т4 и
по 0,07 мл предварительно сформированного комплекса Бт-Т4 со стрептавидином (в мольном соотношении 1 к 2), меченным Eu (Wallac Oy, Финляндия), с концентрацией 20 мкг/л
в пересчете на стрептавидин. После инкубации 2 ч при 37 °С при постоянном встряхивании жидкую фазу удаляют и промывают лунки пять раз по 0,2 мл промывочного буфера
для DELFIA™ (Wallac Oy, Финляндия). Затем добавляют по 0,15 мл усиливающего раствора для DELFIA™ (Wallac Oy, Финляндия) и после мягкого перемешивания в течение 5
минут при комнатной температуре измеряют лантанидную флуоресценцию с разрешением
во времени (time-resolved fluorescence; TRF) на флуориметре (возбуждение/испускание 340/617 нм, время задержки - 300 мкс).
В прямых координатах строят график зависимости полученных значений TRF в относительных единицах от концентрации свободного Т4 в калибровочных пробах. Типичная
калибровочная кривая в начале имеет вогнутую форму, обеспечивая повышенную чувствительность при низких концентрациях свободного Т4, и приобретает прямолинейность в
диапазоне концентраций 15-70 пмоль/л свободного гормона. Значения концентраций свободного Т4, определенные в контрольных сыворотках, попадают в предписанные интервалы (табл. 2).
Таблица 2
Открытие контрольных сывороток различных диапазонов концентраций
предписанные значения [сво- открытые значения [свободбодный Т4], пМ
ный Т4], пМ
контрольная сыворотка 1
5-6,8
5,5
контрольная сыворотка 2
9-15
12
контрольная сыворотка 3
52-59
56
Приведенные в примерах 4 и 5 данные подтверждают, что заявляемые соединения могут быть использованы в качестве бифункциональных связывающих компонентов в иммунодиагностических системах с участием биотинсвязывающих соединений и антител
против одного или нескольких йодтиронинов, в частности, для иммуноферментного анализа свободного Т3 и иммунофлуоресцентного анализа свободного Т4 в сыворотке крови
человека.
Источники информации:
1. Мари Р. Биохимия человека. - М.: Мир, 1993.
2. US 4,171,432. Flavin adenine dinucleotide-iodothyronine conjugates: заявл. 22.06.78;
опубл. 16.10.79.
3. US 3,983,099. Thyroxine- and triiodothyronine-tyrosine dipeptide derivatives: заявл.
19.03.75; опубл. 28.09.1976.
4. US 4,040,907. Iodothyronine enzyme conjugates: заявл. 29.12.75; опубл. 09.08.77.
5. US 2003/0186847 A1. Insulin derivatives and synthesis thereof: заявл. 10.07.01; опубл.
02.10.2003.
6. US 2002/0038026 A1. Method of synthesizing diketopiperazines: заявл. 02.08.01; опубл.
28.03.02.
7. US 5,648,272. Reagent and methods for the detection and quantification of thyroxine in
fluid samples: заявл. 18.05.95; опубл. 15.07.97.
6
BY 12989 C1 2010.04.30
8. Guoshan Z.X. A competitive-type irnmunoassay for T4 in human serum with biotinstreptavidin system/Guoshan Z. X. [et al.] // Tianjin Medical Journal. - 2002. - V. 30. - P. 347349.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
7
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
118 Кб
Теги
by12989, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа