close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13085

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.04.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 13085
(13) C1
(19)
C 12N 1/20
ШТАММ PASTEURELLA MULTOCIDA СЕРОВАРИАНТ A
КМИЭВ-67 - ШТАММ-АНТИГЕН
(21) Номер заявки: a 20080421
(22) 2008.04.03
(43) 2009.12.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Бирман Борис Яковлевич;
Полоз Светлана Васильевна; Андрусевич Андрей Сергеевич (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее
унитарное предприятие "Институт
экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) ПОПОВА Т.Е. и др. Биотехнология. 2000. - № 4. - С. 15-21.
СТРЕЛЬЧЕНЯ И.И. Эпизоотология,
иммунобиология, фармакология и санитария. - 2006. - № 2. - С. 32-34.
ЛЯХ Ю.Г. и др. Ученые записки учреждения образования "Витебская ордена "Знак Почета" государственная
академия ветеринарной медицины",
2006. Т. 42. Вып. 2. - Ч. 2. - С. 145-147.
ЛЯХ Ю.Г. и др. Материалы конференции "Современные технологии сельскохозяйственного производства". X
международная научно-практическая
конференция. - Гродно, 2007. - С. 250251.
КОЛОМНИНА Г.Ф. и др. Научные основы производства ветеринарных препаратов. Сборник научных трудов. М., 1989. - С. 78-82.
BY 13085 C1 2010.04.30
(57)
Штамм Pasteurella multocida серовариант А КМИЭВ-67 - штамм-антиген.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма,
предназначенного для конструирования вакцины против пастереллеза пушных зверей,
средств специфической профилактики и лечения.
Известен штамм Pasteurella multocida сероварианта А, максимальная удельная скорость роста которого в процессе культивирования составляет 1,45 л/ч, а минимальное время генерации - 0,48 ч [1].
Известен штамм Pasteurella multocida сероварианта А, который содержит следующий
состав: белок - 0,186 мг/мл, углеводы - 0,110 мг/мл, нуклеиновые кислоты - 0,07 мг/мл.
Иммуногенность которого составляет 80 %. Антигенная активность - 7 log2 [2].
Однако эти известные штаммы обладают другим количественным составом белковых
и углеводных компонентов с примесями нуклеиновых кислот и недостаточными ростовыми свойствами и низкой иммуногенностью и антигенной активностью.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение
штамма с большим количественным составом белкового компонента, обладающего луч-
BY 13085 C1 2010.04.30
шими ростовыми свойствами, более высокой иммуногенностью и антигенной активностью.
Поставленная задача достигается тем, что штамм выделен из легочной ткани больной
пастереллезом норки в 2006 году в Молодечненском отделении "Звероводство" ЧУП
"Белкоопвнешторг Белкоопсоюза" Молодечненского района Минской области.
Таксономическая принадлежность. Микроорганизм отнесен к виду Pasteurella multocida серовариант А семейства Pasteurellaceae.
Патогенность для животных. Штамм патогенен для пушных зверей и лабораторных
животных, при подкожном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г и молодняка норок.
Культурально-морфологические признаки. В мазках, приготовленных из бульонных и
агаровых культур, данный микроорганизм при окрашивании по Граму располагается в виде мелких грамотрицательных кокко-овоидов, размером 0,28-1,45 х 0,15-0,2 мкм, располагающихся отдельно, иногда парами, может в виде цепочек. Имеется выраженное
капсулообразование, спор не образует, неподвижна. В начале роста вызывает легкое помутнение бульона, иногда с образованием пристеночного кольца. На 4-5 день на дне пробирки образуется характерный слизистый осадок, при встряхивании пробирки
поднимающийся в виде косички, при этом наблюдается просветление бульона. На сывороточном агаре данный микроорганизм образует колонии с ровными краями, сероватобелого цвета, диаметром 2-3 мм. На МПА растут в виде нежных мелких росинчатых колоний, слегка опалесцирующих в косопроходящем свете.
Биохимические свойства. Штамм Pasteurella multocida серовариант А КМИЭВ-67 штамм-антиген - по биохимическим свойствам обладает способностью ферментировать
глюкозу, галактозу, сахарозу, ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты без газа.
Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, на индол - положительная. Не продуцирует гемолизин и уреазу.
Антигенный состав. Имеет в своем составе К- и О-антигены.
Другие особенности и маркерные признаки. Штамм Pasteurella multocida серовариант
А КМИЭВ-67 - штамм-антиген - в процессе роста образует гиалуроновую кислоту, которая может расщепляться гиалуронидазой, продуцируемой стафилококком. При взаимодействии с раствором акрифлавина в разведении 1:1000 штамм образует хлопьевидный
осадок, разбивающийся при встряхивании.
Условия хранения. Хранят в ампулах после лиофильного высушивания в сахарозожелатиновой среде в течение 5 лет при температуре +2+4 °C. Культивируют путем пересева на питательные среды - ПЖА, бульон Хоттингера, МПА на основе перевара Хоттингера - 1 раз в течение месяца.
Антигенные свойства. Антигенная активность штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - в PHГA составляет 8 log2.
Иммуногенность. Иммуногенность штамма Pasteurella multocida сероварианта А
КМИЭВ-67 - штамма-антигена - составляет 90 %.
Вирулентность. Штамм Pasteurella multocida серовариант А КМИЭВ-67 - штаммантиген обладает высокой вирулентностью, LD50 которого составляет 0,3 x 109 м.к.
Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к следующим антибактериальным препаратам: цефатоксиму, норфлоксацину, канамицину, цефалексину, пенициллину, энроксилу, гентамицину, амоксициллину, карбенициллину, рифампицину, доксициклину.
1. Пример выделения штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 штамма-антигена.
Штамм Pasteurella multocida серовариант А КМИЭВ-67 - штамм-антиген - выделен
при посеве кусочков легких на границе патологической и здоровой ткани на бульон Хоттингера. В первые сутки выращивания отмечали легкое равномерное помутнение среды,
2
BY 13085 C1 2010.04.30
иногда образовывание пристеночного кольца. Через 7-10 дней хранения при температуре +2+4 °C на дне пробирки образовывался характерный слизистый осадок с полным просветлением бульона.
2. Пример определения ростовых свойств штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена.
Ростовые свойства определяли в процессе культивирования по следующим параметрам: максимальная удельная скорость роста и минимальное время генерации. Культивирование проводили глубинным методом во флаконах с бульоном Хоттингера с
добавлением глюкозы при 37 °С в течение 24 ч при постоянном перемешивании. Контроль за накоплением пастерелл проводили фотометрическим методом. Результаты исследований показали, что у штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 штамма-антигена - максимальная удельная скорость роста составила 1,73 л/ч, а минимальное время генерации 0,35 ч, что лучше, чем в описанном [1], максимальная удельная
скорость роста которого составляет 1,45 л/ч, а минимальное время генерации 0,48 ч.
3. Пример определения химического состава штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена.
Химический состав определяли следующим образом: белок - по Лоури, углеводы [3],
нуклеиновые кислоты [4].
Для определения белка по Лоури к 0,4 мл антигена Pasteurella multocida сероварианта
А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - добавили 4 мл реактива С, состоящего из 60 мл реактива А (2 %-ный раствор NaCO3 в 0,1 н растворе NaOH) и 1 мл реактива В (0,5 %-ный раствор CuSO4 x 5 H2O в 1 %-ном растворе виннокислого натрия Na2C4H4O6). Смесь антигена
Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - и реактива С выдерживали 10 мин при температуре 18-22 °С, после чего добавили 0,2 мл реактива Фолина,
встряхивали и через 30 мин определяли оптическую плотность на спектрофотометре при
длине волны 750 нм. В качестве контроля использовали физиологический раствор с добавлением реактива С и реактива Фолина. Для построения калибровочной кривой 10 г сывороточного альбумина растворяли в 100 мл дистиллированной воды, делали
последующие двукратные разведения и в каждом определяли оптическую плотность белка, используя ранее указанные реактивы.
Результаты исследования показаны в таблице.
Химический состав культуры штамма Pasteurella multocida сероварианта А
КМИЭВ-67 - штамма-антигена
Штамм Pasteurella multocida серовариант
Химические компоненты
Прототип
А КМИЭВ-67 - штамм-антиген
Белок, мг/мл
0,186
0,214
Углеводы, мг/мл
0,110
0,118
Нуклеиновые кислоты, мг/мл
0,07
0,09
4. Пример определения иммуногенной активности штамма Pasteurella multocida
сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма антигена.
Иммуногенную активность штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 штамма-антигена -изучали на щенках норки в возрасте 1,5-2 месяца (10 иммунизированных - опытных и 10 контрольных). Через 15 дней после иммунизации всем опытным животным и контрольным инъецировали предварительно подтитрованную дозу LD50
бактериальной культуры штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена. Результаты реакции показали, что в опытной группе пало одно животное,
клинических признаков заболевания не наблюдали. Следовательно, иммуногенная активность штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - составляет 90 %, в то время как в прототипе она равна 80 %.
3
BY 13085 C1 2010.04.30
5. Пример определения антигенной активности штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена.
Антигенные свойства изучали в реакции непрямой гемагглютинации в разведении сыворотки до 1024. В качестве антигена использовали бактериальную культуру штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена. Результаты реакции
показали, что антигенная активность штамма Pasteurella multocida сероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - составляет 8 log2.
Таким образом, штамм Pasteurella multocida серовариант А КМИЭВ-67 - штаммантиген, выделенный от пушных зверей, обладает наибольшим количественным содержанием белка - 0,214 мг/мл (у известного штамма 0,186 мг/мл), что влияет на повышение
иммуногенной активности, высокими ростовыми свойствами с максимальной удельной
скоростью роста 1,75 л/ч (у известного штамма 1,45 л/ч), более высокой иммуногенностью 90 % (у известного штамма 80 %) и антигенной активностью 8 log2 (у известного штамма
7 log2), что является важным в процессе формирования иммунного ответа и создания биопрепаратов, поэтому он может использоваться в качестве штамма-антигена.
Источники информации:
1. Каломнена Г.Ф., Антонова Н.И., Галибина Н.В., Лукьянова Е.Н., Семенютина Г.А.,
Немчинов Н.Н., Рогожин С.П., Шегидевич Э.А. Физиологические и морфологические
особенности пастерелл в процессе культивирования. Науч. основы пр-ва вет. препаратов. M., 1989. - С. 78-82.
2. Попова Т.Е., Шэгидевич Э.А., Клицунова Н.В. Характеристика поверхностных антигенов Pasteurella multocida, выделенных методом водно-солевой экстракции // Биотехнология. - 2000. - № 4. - С 15-21 (прототип).
3. Dubois, M. // Anal Chem. - 1956. - V. 28. - Р.350-356.
4. Спирин А.С. Биохимия. - 1958. - T. 23. - Вып. 5. - С. 656-662.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
92 Кб
Теги
by13085, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа