close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13086

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.04.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 13086
(13) C1
(19)
C 12N 1/20
ШТАММ PASTEURELLA MULTOCIDA СЕРОВАРИАНТ D
КМИЭВ-69 - ШТАММ-АНТИГЕН
(21) Номер заявки: a 20080422
(22) 2008.04.03
(43) 2009.12.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Бирман Борис Яковлевич;
Полоз Светлана Васильевна; Андрусевич Андрей Сергеевич (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее
унитарное предприятие "Институт
экспериментальной
ветеринарии
имени С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) КУЛИКОВА И.Л. и др. Ветеринария. 1995. - № 7. - C. 25-28.
СТРЕЛЬЧЕНЯ И.И. Эпизоотология, иммунобиология, фармакология и санитария. - 2006. - № 2. - C. 32-34.
ЛЯХ Ю.Г. и др. Современные технологии сельскохозяйственного производства. Материалы конференции. X
международная научно-практическая
конференция. - Гродно, 2007. - C. 250251.
ЛЯХ Ю.Г. и др. Витебская ордена
"Знак почета" государственная академия ветеринарной медицины. Ученые
записки учреждения образования, 2006.
Т.42. Вып. 2. Ч.2. - C. 145-147.
ПОПОВА Т.Е. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1997. - № 3. - C. 15-19.
BY 13086 C1 2010.04.30
(57)
Штамм Pasteurella multocida серовариант D КМИЭВ-69 - штамм-антиген.
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается штамма, выделенного от пушных зверей больных пастереллезом, обладающего низкой токсичностью и
предназначенного для конструирования лечебно-профилактических и диагностических
препаратов при данном заболевании.
Известен штамм Pasteurella multocida серовариант D, обладающий недостаточным
ростом при выращивании в синтетической среде 199, используемой для изготовления биопрепаратов, обладающей наименьшим количеством балластных веществ. При этом концентрация жизнеспособных популяций данного штамма составила 5,08 × 108 в 1 мл.
Биохимические свойства культур были типичны для пастерелл [1]. Иммуногенность которого составляет 85 %.
Известен штамм Pasteurella multocida серовариант D, токсическое действие капсульных антигенов высокое и составляет в разведении от 1:2 до 1:8 [2].
Однако эти известные штаммы обладают низкой концентрацией жизнеспособных клеток, высокой токсичностью капсульного антигена и низкой иммуногенностью.
BY 13086 C1 2010.04.30
Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение
штамма, обладающего высокой концентрацией жизнеспособных клеток при культивировании в синтетической среде, низкой токсичностью капсульного антигена и высокой иммуногенностью для изготовления вакцины.
Поставленная задача достигается тем, что штамм Pasteurella multocida серовариант D
КМИЭВ-69 - штамм-антиген.
Выделен из легочной ткани больных пастереллезом пушных зверей в 2006 г. в Гродненском с/х отделении "Гродненское зверохозяйство" Гродненского района Гродненской
области.
Штамм Pasteurella multocida серовариант D КМИЭВ-69 - штамм-антиген- депонирован
в коллекции микроорганизмов РУП "Институт экспериментальной ветеринарии
им. С.Н. Вышелесского". Коллекционный номер КМИЭВ - 69.
Таксономическая принадлежность. Микроорганизм отнесен к виду Pasteurella multocida серовариант D семейства Pasteurellaceae.
Патогенность для животных. Штамм Pasteurella multocida серовариант D КМИЭВ-69 штамм-антиген- патогенен для пушных зверей и лабораторных животных, при подкожном
введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г и молодняка норок.
Культурально-морфологические признаки. Микроорганизм в фиксированных и окрашенных по Граму мазках имеет вид мелких грамотрицательных кокко-овоидов, размером
0,3-1,4 × 0,13-0,27 мкм, может располагаться одиночно, парами, иногда цепочками. Культура пастерелл неподвижная, имеет капсулу, спор не образует. На бульоне дает равномерное помутнение, при длительном хранении образует пристеночное кольцо и формирует
феномен "косички". На агаровых средах образует серовато-белые колонии с ровными
краями, диаметром до 3 мм.
Биохимические свойства. Штамм Pasteurella multocida серовариант D КМИЭВ-69 штамм-антиген- обладает способностью ферментировать глюкозу, галактозу, сахарозу,
ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты без газа. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, на индол - положительная. Не продуцирует гемолизин и уреазу.
Антигенный состав. Имеет в своем составе К- и О-антигены.
Другие особенности и маркерные свойства. Штамм Pasteurella multocida серовариант
D КМИЭВ-69 - штамм-антиген- дает положительную реакцию с раствором акрифлавина в
разведении 1:1000, при этом образуется интенсивный хлопьевидный флоккулят, оседающий на дне пробирки и не разбивающийся при встряхивании.
Способы и условия хранения. Хранят после лиофильного высушивания в сахарозожелатиновой среде в ампулах при температуре +2 - +4 °С в течение 5 лет. Сохранность
культур обеспечивается путем пересева на питательные среды - ПЖА, бульон Хоттингера,
МПА на основе перевара Хоттингера 1 раз в течение месяца.
Антигенные свойства. Антигенная активность штамма Pasteurella multocida сероварианта D КМИЭВ-69 - штамма-антигена- в РНГА составляет 7 log2.
Иммуногенность. штамма Pasteurella multocida сероварианта D КМИЭВ-69 - штаммаантигена- составляет 100 %.
Вирулентность. Штамм Pasteurella multocida сероварианта D КМИЭВ-69 - штаммантиген- обладает высокой вирулентностью, LD50 которого составляет 1,34 × 109 м.к.
Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к антибактериальным препаратам: энроксилу, норфлоксацину, цефатоксиму, цефалексину, гентамицину, канамицину,
карбенициллину, рифампицину, пенициллину, доксициклину, окситетрациклину, амоксициллину, левомицетину.
1. Пример выделения штамма Pasteurella multocida D КМИЭВ-69 - штамма-антигена.
Штамм Pasteurella multocida D КМИЭВ-69 - штамм-антиген- выделен при посеве кусочков
легких на границе патологической и здоровой ткани на мясо-пептонный бульон с добавлением 0,2 мл аминопептида-2 на пробирку. В первые сутки выращивания отмечали лег2
BY 13086 C1 2010.04.30
кое равномерное помутнение среды, иногда образование пристеночного кольца. Через 710 дней хранения при температуре +2 - +4 °С на дне пробирки образовывался характерный слизистый осадок с полным просветлением бульона.
2. Пример культивирования штамма Pasteurella multocida сероварианта D КМИЭВ-69 штамма-антигена. 18-часовую агаровую культуру данного штамма смывали с поверхности
агара стерильным физиологическим раствором, доводили концентрацию бактериальной
взвеси до 10 ед по оптическому стандарту мутности и вносили в среду 199 до конечной
концентрации 1 × 109 м.т. в 1 мл. Культивирование проводили в колбах объемом 500 мл,
содержащих 150 мл среды, при постоянном перемешивании при температуре 37 °С в течение 24 часов. Количество жизнеспособных клеток определяли методом титрования на
сывороточном агаре Хиттингера.
Результаты исследований показали, что концентрация жизнеспособных клеток популяции штамма Pasteurella multocida сероварианта D КМИЭВ-69 - штамма-антигена- составила 7,21 × 108 в 1 мл.
3. Пример определения токсичности капсульных антигенов штамма Pasteurella multocida сероварианта D КМИЭВ-69 - штамма-антигена. В опыте использовали растворимые
капсульные антигены штамма Pasteurella multocida сероварианта D КМИЭВ-69 - штаммаантигена. Для этого суточную бульонную культуру засевали на 5 % кровяной агар Хоттингера. Чашки Петри инкубировали при 37 °С 18 часов, микробные клетки с поверхности
агара смывали стерильным 2,5 %-ным раствора хлорида натрия концентрацию доводили
до 20 млрд.м.к. в 1 мл. Бактериальную взвесь экстрагировали на водяной бане 1 час при
56 °С, затем дважды центрифугировали при 13000 об/мин в течение 20 мин супернатант
собирали и подвергали диализу 48 часов против дистиллированной воды, содержащей
раствор мертиолята натрия в конечной концентрации 1:10000.
Для определения токсичности использовали культуру клеток ЛЭК (легкого эмбриона
коровы). Суспензию клеток в концентрации 100 кл/мл вносили по 2 мл в пробирку (10
пробирок на каждое разведение) и культивировали при 37 °С. После образования монослоя в пробирках меняли питательную среду и вносили препарат в разведениях 1:2, 1:4,
1:8, 1:16, 1:32, 1:64. Результаты учитывали через 24-72 часа.
Результаты исследований показали, что капсульные антигены-, полученные из штамма Pasteurella multocida сероварианта D КМИЭВ-69 - штамма-антигена-, выращенного на
агаре Хоттингера, разрушали 80 % монослоя с образованием множества мертвых и округлых клеток в разведении 1:2. В разведении 1:4 отмечали 100 % монослой с единичными
округлыми клетками. В разведении 1:8 и далее 100 % монослоя было без изменений морфологии клеток.
4. Пример определения иммуногенной активности штамма Pasteurella multocida сероварианта D КМИЭВ-69 - штамма антигена. Иммуногенную активность штамма Pasteurella
multocida сероварианта D КМИЭВ-69 - штамма-антигена- изучали на щенках норки в возрасте 1,5-2 месяца (10 иммунизированных - опытных и 10 контрольных). Через 15 дней
после иммунизации всем опытным животным и контрольным инъецировали предварительно подтитрованную дозу LD50 бактериальную культуры штамма Pasteurella multocida
сероварианта D КМИЭВ-69 - штамма-антигена. Результаты реакции показали, что все
опытные животные остались живы, клинических признаков заболевания не наблюдали.
Следовательно, иммуногенная активность штамма Pasteurella multocida сероварианта D
КМИЭВ-69 - штамма-антигена- составляет 100 %.
Таким образом, штамм Pasteurella multocida серовариант D КМИЭВ-69 - штаммантиген- обладает наибольшей концентрацией жизнеспособных клеток при культивировании в синтетической среде 199 и составляет 7,21 × 108 в 1 мл, по сравнению и известным
штаммом (5,08 × 108 в 1 мл), и низкой токсичностью капсульных антигенов - разведение
от 1:2-1:4 с разрушением от 80 % монослоя до единичных клеток, по сравнению с известным штаммом (разведение 1:2-1:8 с 100-80 % разрушения монослоя), и более высокой
3
BY 13086 C1 2010.04.30
иммуногенностью (100 %) по сравнению с известным штаммом (85 %), который может
быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов
в качестве штамма - антигена.
Источники информации:
1. Попова Т.Е. Культурально-морфологические свойства Pasteurella multocida различных серовариантов при культивировании в жидких питательных средах различного состава // Микробиология, эпидемиология и иммунология. - 1997. - № 3. - С. 15-19.
2. Куликова И.Л. Токсичность капсульных антигенов P. Multocida / И.Л. Куликова,
Т.Е. Попова // Ветеринария. - 1995. - № 7. - С. 25-28 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
80 Кб
Теги
by13086, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа