close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13118

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.04.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/487
СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
РАСТИТЕЛЬНОГО ЭКСТРАКТА
(21) Номер заявки: a 20080728
(22) 2008.06.04
(43) 2010.02.28
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научно-практический центр гигиены" (BY)
(72) Авторы: Дудчик Наталья Владимировна; Филонов Валерий Петрович; Колядич Елена Сергеевна; Мельникова
Людмила Александровна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
BY 13118 C1 2010.04.30
BY (11) 13118
(13) C1
(19)
(56) SATISH S. et al. Letters in Applied Microbiology, 1999. V. 28. - P. 145-147.
ФАУСТОВА Н.М. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 3. - C. 3-7.
ДУДЧИК Н.В. и др. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы Международной конференции. Минск, 2004. - C. 199-201.
RU 2189040 C2, 2002.
RU 2298170 C2, 2007.
RU 2240556 C2, 2004.
RU 2289132 C1, 2006.
SU 1781610 A1, 1992.
UA 26942 U, 2007.
(57)
Способ оценки антибактериальной активности растительного экстракта, включающий
внесение экстракта в питательную среду, содержащую бактериальную тест-культуру в определенной концентрации, и культивирование тест-культуры, отличающийся тем, что
используют питательную среду, содержащую 5,0 г пептона, 2,0 г дрожжевого экстракта,
1,0 г глюкозы, 2,0 г натрия хлористого, 1,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,75 г
калия фосфорнокислого двузамещенного и воду дистиллированную до 1000 мл, в качестве
тест-культуры используют штаммы сапрофитных, санитарно-показательных, патогенных,
условно-патогенных или индикаторных бактерий в концентрации 1⋅107-1⋅108 клеток/мл,
осуществляют культивирование тест-культуры параллельно в питательной среде без растительного экстракта и в среде, содержащей экстракт в последовательно увеличивающихся
концентрациях, в измерительных ячейках микробиологического анализатора при температуре 28-37 °С с одновременной импедиметрической регистрацией показателей для определения времени детекции DT роста бактериальной тест-культуры, при увеличении
значения DT роста бактериальной тест-культуры в питательной среде с растительным
экстрактом по сравнению с DT роста бактериальной тест-культуры в питательной среде
без растительного экстракта в 1,5 раза определяют показатель I50, соответствующий концентрации растительного экстракта, при которой ингибируется рост бактериальной тесткультуры на 50 %, и при значении I50, равном 1-5 %, антибактериальную активность растительного экстракта оценивают как выраженную, при значении I50, равном 6-30 %, как
среднюю, а при значении I50 свыше 30 % - как слабую.
BY 13118 C1 2010.04.30
Изобретение относится к разделу гигиены питания, санитарной микробиологии и фармакологии.
Известен способ оценки антибактериальной активности растительных экстрактов in
vitro с использованием тест-культур фитопатогенных бактерий Xantomonas camperstris,
заключающийся в том, что в лунки на поверхности засеянного тест-штаммами микроорганизмов питательного агара вносят водные растительные экстракты, посевы инкубируют в
термостате при 24 °С в течение 24 ч и оценивают антибактериальную активность путем измерения диаметра зоны подавления роста тест-штаммов [1].
Однако способ-прототип обладает следующими недостатками: низкой чувствительностью, в связи с чем требуется длительное (до 24 ч) время проведения испытаний, полуколичественным характером измерений антибактериальной активности растительных экстрактов, а
также отсутствием характеристик оценки степени антибактериальной активности.
Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является то, что осуществляют параллельное внесение растительных экстрактов в разных концентрациях в питательную
среду, содержащую ранее определенную концентрацию бактериальной тест-культуры, и
проводят их совместное культивирование с последующей обработкой полученных данных.
Задачей заявленного изобретения является повышение чувствительности способа и
сокращение времени тестирования за счет определения электрохимических показателей
питательной среды, увеличение числа бактериальных тест-культур для оценки антибактериальной активности.
Поставленная задача достигается следующим образом.
Предложен способ оценки антибактериальной активности растительного экстракта,
включающий внесение экстракта в питательную среду, содержащую бактериальную тесткультуру в определенной концентрации, и культивирование тест-культуры, при этом используют питательную среду, содержащую 5,0 г пептона, 2,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г
глюкозы, 2,0 г натрия хлористого, 1,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,75 г
калия фосфорнокислого двузамещенного и воду дистиллированную до 1000 мл, в качестве
тест-культур используют штаммы сапрофитных, санитарно-показательных, патогенных,
условно-патогенных или индикаторных бактерий в концентрации 1⋅107-1⋅108 клеток/мл,
осуществляют культивирование тест-культуры параллельно в питательной среде без растительного экстракта и в среде, содержащей экстракт в последовательно увеличивающихся концентрациях, в измерительных ячейках микробиологического анализатора при
температуре 28-37 °С с одновременной импедиметрической регистрацией показателей для
определения детекции DT роста бактериальной тест-культуры, при увеличении значения
DT роста бактериальной тест-культуры в питательной среде с растительным экстрактом
по сравнению с DT роста бактериальной культуры в питательной среде без растительного
экстракта в 1,5 раза определяют показатель I50, соответствующий концентрации растительного экстракта, при которой ингибируется рост бактериальной культуры на 50 %, и
при значении I50, равном 1-5 %, антибактериальную активность растительного экстракта
оценивают как выраженную, при значении I50, равном 6-30 %, как среднюю, а при значении I50 свыше 30 % - как слабую.
Для оценки степени антибактериальной активности предложен показатель I50 - такая
концентрация растительного экстракта, которая ингибирует рост бактериальной тесткультуры на 50 %.
Предложены также количественные параметры показателя I50 для оценки степени антибактериальной активности растительных экстрактов.
При этом в заявленном способе могут быть использованы в качестве тест-культур сапрофитные, санитарно-показательные, патогенные, условно-патогенные, индикаторные
бактерии. Штаммы могут быть получены из государственных музеев и коллекций, а также
могут быть выделены в виде изолятов в ходе микробиологических исследований.
Оценка роста тест-культур бактерий по изменению электрохимических показателей
среды указанного состава позволяет повысить чувствительность способа за счет того, что
2
BY 13118 C1 2010.04.30
осуществляется импедиметрическая регистрация электрохимических изменений питательной среды, а это позволяет провести детекцию роста бактериальной тест-культуры в течение
2-10 ч, а также увеличить число бактериальных тест-культур при проведении анализа.
Примеры выполнения.
Пример 1.
Требуется определить I50 для растительного экстракта 1.
В качестве тест-культур используют санитарно-показательную грамотрицательную
бактерию Escherichia coli ATCC 8739 и сапрофитную почвенную бактерию Arthrobacter
ureafaciens БИМ В-6.
Тест-штамм Escherichia coli ATCC получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Тест-штамм Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6 получен из
Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов (научная коллекция типовых и
промышленно-ценных микроорганизмов) Института микробиологии НАН Беларуси.
Штаммы являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим
свойствам. Тест-штаммы хранят при температуре (5±1) °С под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова.
Для приготовления рабочих культур тест-штаммы культивируют в термостате на среде указанного состава, в которую добавляют агар до 2 %. Режимы культивирования: при
(28±2) °С для Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6 в течение 48 ч и при (35±2) °С для Escherichia coli ATCC 8739 в течение 24 ч. Смывы проводят фосфатным буферным раствором с 0,1 % пептоном, pH 7,0, используя стандарт мутности на 10 единиц мутности.
Содержание клеток тест-штамма в инокуляте доводили до 108 КОЕ/мл.
Подтверждение содержания клеток в рабочей культуре проводят путем высева на среду приведенного состава, в которую добавляют агар до 2 %.
В качестве питательной среды при проведении исследования используют среду следующего состава (на 1000,0 мл дистиллированной воды):
пептон
5,0 г
дрожжевой экстракт
2,0 г
глюкоза
10,0 г
натрий хлористый
2,0 г
калий фосфорнокислый однозамещенный
1,5 г
калий фосфорнокислый двузамещенный
0,75 г
pH 7,2-7,4.
Стерилизация 121 °С в течение 20 мин.
Приготовленную среду инокулируют параллельно тест-штаммом Escherichia coli
ATCC 8739 и тест-штаммом Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6 до конечной концентрации
1×107-1×108 клеток/мл, разливают в измерительные ячейки анализатора, вносят исследуемый
растительный экстракт в последовательно увеличивающихся концентрациях и инкубируют в
термоинкубаторе в течение 10-12 ч. Режимы инкубирования: при (28±2) °С для Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6 и при (35±2) °С для Escherichia coli ATCC 8739 в течение 24 ч.
Получены следующие результаты.
Время детекции роста тест-культуры DT (без исследуемого экстракта) составляет: для
Escherichia coli ATCC 8739 - 2,2 ч, для Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6 - 6,0 ч.
Для экстракта 1 в последовательно увеличивающихся концентрациях время детекции
составляет:
Таблица 1
Escherichia coli ATCC 8739
Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6
концентрация 0,9 % - 2,2 ч
концентрация 0,9 % - 6,2 ч
концентрация 1,8 % - 2,8 ч
концентрация 1,8 % - 7,8 ч
концентрация 2,7 % - 3,3 ч
концентрация 2,7 % - 9,0 ч
концентрация 3,6 % - 4,1 ч
концентрация 3,6 % - 11,1 ч.
3
BY 13118 C1 2010.04.30
Таким образом, при внесении в среду экстракта 1 в концентрации 2,7 % время детекции тест-культуры Escherichia coli возросло с 2,2 до 3,3 ч, а тест-культуры Arthrobacter
ureafaciens БИМ В-6 возросло с 6,0 до 9,0 ч, т.е. увеличилось на 50 %. Поэтому I50 для экстракта 1 составляет 2,7 % для обеих тест-культур.
Согласно предложенным критериям оценки, растительный экстракт 1 проявляет выраженную антибактериальную активность в отношении Escherichia coli ATCC 8739 и Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6, т.к. концентрация 2,7 % привела к 50 % ингибированию
роста культур.
Пример 2.
Требуется определить I50 для растительного экстракта 2.
В качестве тест-культур используют санитарно-показательную грамположительную
бактерию Staphylococcus aureus ATCC 25923 и сапрофитную почвенную бактерию Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6.
Тест-штамм Staphylococcus aureus ATCC 25923 получен из Всероссийской коллекции
промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Тест-штамм Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6
получен из Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов (научная коллекция
типовых и промышленно-ценных микроорганизмов) Института микробиологии НАН Беларуси.
Штаммы являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим
свойствам. Тест-штаммы хранят при температуре (5±1) °С под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова.
Пробоподготовку и проведение анализа проводят по методике, описанной в п. 1 раздела "Примеры выполнения".
Получены следующие результаты.
Время детекции роста тест-культуры DT (без исследуемого экстракта) составляет: для
Staphylococcus aureus ATCC 25923 - 2,5 ч, для Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6 - 6,0 ч.
Для экстракта 2 в последовательно увеличивающихся концентрациях время детекции
составляет:
Таблица 2
Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6
концентрация 30 % - 6,0 ч
концентрация 60 % - 2,2 ч
концентрация 90 % - 9,0 ч
Staphylococcus aureus ATCC 25923
концентрация 30 % - 2,2 ч
концентрация 60 % - 6,9 ч
концентрация 90 % - 3,3 ч
Таким образом, при внесении в среду экстракта 2 в концентрации 30-90 % время детекции тест-культуры Staphylococcus aureus ATCC 25923 возросло с 2,2 до 3,3 ч при внесении концентрации 60 %.
Время детекции тест-культуры Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6 возросло с 6,0 до 9,0 ч
для концентрации 90 %, т.е. увеличилось на 50 %.
Поэтому I50 для экстракта 2 составляет I50 = 60 % в отношении Staphylococcus aureus
ATCC 25923 и I50 = 90 % для Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6.
Согласно предложенным критериям оценки, растительный экстракт 2 проявляет слабую антибактериальную активность в отношении Staphylococcus aureus ATCC 25923 и Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6, т.к. только 60 и 90 % этой композиции привели к 50 %
ингибированию роста культур.
Параллельно было проведено определение антибактериальной активности для экстрактов 1 и 2 по способу-прототипу. Получены следующие результаты.
Для определения антибактериальной активности экстрактов 1 и 2 потребовалось 24 ч.
Размер зон ингибирования (в мм) приведен в табл. 3.
4
BY 13118 C1 2010.04.30
Таблица 3
Тест-штаммы
Escherichia coli ATCC 8739
Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Экстракт 1
2,1 мм
3,0 мм
нe определяли
Экстракт 2
нe определяли
0 мм
1,5 мм
Показатели I50 для экстрактов 1 и 2 не были определены, т.к. способ-прототип не предусматривает такого измерения.
Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается
в увеличении чувствительности, уменьшении времени тестирования с 24 до 2,2-9,0 ч, что
дает основание рекомендовать его в качестве экспресс-метода, а также увеличении числа
тест-культур для определения показателя антибактериальной активности I50, а также дает
возможность оценить степень антибактериальной активности растительных экстрактов.
Источники информации:
1. Satish S. et al. Letters in Applied Microbiology, 1999. V. 28. - P. 145-147.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
95 Кб
Теги
by13118, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа