close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13162

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.04.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 13162
(13) C1
(19)
G 01N 33/50
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОТОКСЕМИИ У ПАЦИЕНТА
С НАРУШЕНИЕМ ПИЩЕВОГО ПОВЕДЕНИЯ НЕРВНОЙ АНОРЕКСИЕЙ ИЛИ НЕРВНОЙ БУЛИМИЕЙ
(21) Номер заявки: a 20080463
(22) 2008.04.11
(43) 2009.12.30
(71) Заявитель: Учреждение образования
"Белорусский государственный медицинский университет" (BY)
(72) Авторы: Скугаревский Олег Алексеевич; Горанов Виталий Анатольевич;
Горанова Юлия Анатольевна (BY)
(73) Патентообладатель: Учреждение образования "Белорусский государственный медицинский университет" (BY)
(56) UA 8706 U, 2005.
RU 2311126 C1, 2007.
BY 13162 C1 2010.04.30
(57)
Способ диагностики эндотоксемии у пациента с нарушением пищевого поведения нервной анорексией или нервной булимией, заключающийся в том, что в суспензию клеток Uittenbogaard вносят сыворотку крови пациента до конечной концентрации 5-25 % и
этидиум бромид до конечной концентрации 0,01 %, определяют цитотоксический индекс
сыворотки крови, равный доле этидиум-позитивных клеток в процентах, и при значении
индекса выше 11,19 % диагностируют эндотоксемию.
Изобретение относится к медицине, к разделу психиатрия, и может быть использовано
для диагностики эндотоксемии у пациента с нарушением пищевого поведения - нервной
анорексией или нервной булимией.
При нарушениях пищевого поведения совокупность биологических и социальных влияний предопределяет риск их возникновения. Попадая под влияние этих факторов, пациенты,
преимущественно девушки подросткового возраста, находят выход в переключении фокуса
внимания на контроль собственно внешности, зачастую не учитывая диапазон "безопасного" вмешательства, приводящего к нарушениям пищевого поведения (нервная анорексия,
нервная булимия, переедание) и, как следствие, к соматическим последствиям, прежде
всего за счет истощения при нервной анорексии и нарушения обменных процессов при
булимии. Несомненно, что при нервной анорексии, булимии и переедании отмечается заинтересованность когнитивных, афферентных и поведенческих составляющих, предопределяющих особенности клинической картины, терапевтическую эффективность, способность
следовать плану лечения и прочее. Взаимосвязь этих компонентов реализуется в формировании своеобразных феноменов, свойственных нарушениям пищевого поведения, которые могут быть использованы для диагностики эндотоксемии у пациента с нарушением
пищевого поведения.
BY 13162 C1 2010.04.30
Известен метод оценки тяжести состояния пациентов с нарушением пищевого поведения с помощью расчета индекса массы тела (ИМТ = масса тела (кг) / (рост (м))2, в котором
тяжесть нарушений пищевого поведения определяется с учетом рекомендуемых интервалов ИМТ (Британский Королевский Колледж) [1]:
ИМТ < 12 - угрожающее жизни состояние;
12 ≤ ИМТ < 13,5 - критическое состояние;
13,5 ≤ ИМТ < 15 - тяжелая нервная анорексия;
15 ≤ ИМТ < 17,5 - нервная анорексия;
17,5 ≤ ИМТ < 20 - недостаток массы тела при других критериях нарушений пищевого
поведения;
20 ≤ ИМТ < 25 - норма;
ИМТ ≥ 25 - избыток массы тела и ожирение.
Данный метод, являясь, по сути, антропометрическим индексом ИМТ, косвенно отражает интенсивность катаболических процессов, активизирующихся при используемых
пациентами экстремальных методах контроля массы тела: жесткие диетические ограничения (зачастую до 500 кКал/сут) вплоть до полного отказа от еды, самовызывание рвоты,
использование мочегонных и слабительных препаратов, клизмы, изнуряющие физические
упражнения. Поэтому использование известного метода требует некоторой осмотрительности в плане формализованной оценки индекса массы тела. ИМТ, как клинический предиктор, "не точно работает" в случаях:
при быстрых изменениях веса;
при крайних значениях роста;
большой уровень риска для каждого значения ИМТ для мужчин (высокий рост);
в детском возрасте (возрастные изменения);
при наличии булимической симптоматики;
при ограничениях в приеме жидкости;
при сопутствующих проблемах.
Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, - получение альтернативного диагностического критерия эндотоксемии у пациента, страдающего нарушением
пищевого поведения, интегративно отражающего сопряженные отношения напряженности катаболических процессов и клинически значимых психопатических проявлений.
Принимая во внимание тот факт, что катаболические процессы при нарушениях пищевого поведения сопровождаются образованием побочных продуктов обмена (о чем
свидетельствуют результаты параклинических методов исследований - диспротеинемия,
ацидоз или алкалоз, увеличение сывороточного уровня мочевины, нарушение функции
печени и почек и пр.), то, по-видимому, уместно говорить о явлениях эндотоксикоза, а определение степени эндотоксикоза может стать диагностическим показателем тяжести изменения метаболических процессов, протекающих в организме пациентов, страдающих
нарушениями пищевого поведения.
Поставленная задача решается предлагаемым способом диагностики эндотоксемии у
пациента с нарушением пищевого поведения нервной анорексией или нервной булимией,
заключающимся в том, что в суспензию клеток Uittenbogaard вносят сыворотку крови пациента до конечной концентрации 5-25 % и этидиум бромид до конечной концентрации
0,01 %, определяют цитотоксический индекс сыворотки крови, равный доле этидиумпозитивных клеток в процентах, и при значении индекса выше 11,19 % диагностируют
эндотоксемию.
Способ осуществляется следующим образом.
Обследуемому пациенту выполняют антропометрические измерения с вычислением
индекса массы тела:
ИМТ = масса тела (кг)/ (рост (м))2
2
BY 13162 C1 2010.04.30
и на фоне прочих положительных диагностических критериев нарушений пищевого поведения проводят диагностику эндотоксемии у пациента, страдающего нервной анорексией,
нервной булимией. Для этого определяют цитотоксическую активность сыворотки крови
пациента, а в качестве маркера эндотоксикоза используют цитотоксический индекс сыворотки крови (ЦТИ) у пациента, отражающий долю клеток стандартной культуры, гибнущих под влиянием неспецифических токсических продуктов обмена исследуемой
сыворотки крови. При значении ЦТИ выше 11,19 % диагностируют токсемию, типичную
для нервной анорексии и нервной булимии (М (ợ)).
Используемая методика ориентирована на оценку сохранности процессов клеточного
метаболизма, необходимых для обеспечения клеточной пролиферации и структурной целостности органелл. Применяют фотоколориметрический метод с использованием соли
тетразолия 3-(4,5-диметилтиазол)-2,5-дифенилтетразолиум бромида (МТТ). МТТ воспринимается клетками и преобразуется митохондриальными дегидрогеназами в нерастворимый продукт (формазан), непроницаемый для клеточных мембран, что приводит к его
накоплению внутри жизнеспособных, здоровых клеток. При разрушении клеток происходит высвобождение формазана, которое может быть зафиксировано фотороллориметрическим методом [3, 4, 5].
Для исследования ЦТИ крови пациентов, страдающих нарушениями пищевого поведения (нервная анорексия, нервная булимия), используют культуру клеток Uittenbogaard,
выращенную в 96-луночном планшете на среде IMDM. Исследуемую сыворотку вносят до
конечной концентрации 5-25 %.
Определение количества этидиум-позитивных клеток (ЭПК) осуществляют по методике [2], включающей инстиляцию этидиума бромида в среду культивирования клеток до
конечной концентрации 0,01 %. Анализ суспензии осуществляют методом проточной цитофлюориметрии на аппарате FACSvantage. Возбуждение флюоресценции осуществляют
аргоновым лазером (488/780 мВт). Гейтирование пула этидиум-позитивных клеток проводят исходя из распределения клеток по флюоресценции.
Доля этидиум-позитивных клеток соответствует индексу цитотоксической активности
сыворотки крови пациента.
В качестве контроля принимают количество жизнеспособных (этидиум-негативных)
клеток в образцах, инкубируемых с фетальной эмбриональной сывороткой.
Пример выполнения способа
Для исследования ЦТИ крови пациентов, страдающих нарушениями пищевого поведения (нервная анорексия, нервная булимия), использовали культуру клеток Uittenbogaard,
выращенную в 96-луночном планшете на среде IMDM, в которую вносили исследуемую
сыворотку крови до конечной концентрации 5-25 %. В качестве контроля принимали количество жизнеспособных (этидиум-негативных) клеток в образцах, инкубируемых с фетальной эмбриональной сывороткой.
Определение количества этидиум-позитивных клеток (ЭПК) осуществляют по методике,
включающей инстиляцию этидиума бромида в среду культивирования клеток до конечной
концентрации 0,01 %. Анализ суспензии осуществляли методом проточной цитофлюориметрии на аппарате FACSvantage. Возбуждение флюоресценции осуществляли аргоновым
лазером (488/80 мВт). Гейтирование пула этидиум-позитивных клеток проводили исходя
из распределения клеток по флюоресценции. Доля этидиум-позитивных клеток соответствует индексу цитотоксической активности сыворотки крови пациента. В анализ брали
10 000 событий. Регистрацию сигнала осуществляли с использованием фильтра 600 нм.
Обработку полученных экспериментальных результатов выполняли с помощью пакета
программ "Statistica 6.0", а также с использованием программы Excel. Для оценки достоверности использовался t-критерий Стьюдента. Различия сравниваемых показателей считались достоверными при р < 0,05.
3
BY 13162 C1 2010.04.30
В сравнительном исследовании "случай-контроль" был исследован ЦТИ крови пациенток, страдающих нарушениями пищевого поведения (нервная анорексия, нервная булимия)
и получающих стационарную помощь, нацеленную в том числе на коррекцию соматического статуса, а также поведенческих нарушений. Основная группа - 95 пациенток с нарушениями пищевого поведения, контрольная группа - 39 здоровых девушек. Указанные подгруппы не различались между собой по возрасту и основным социально-демографическим
характеристикам. Диагностика нарушений пищевого поведения производилась с использованием критериев МКБ-10 и DSM-IV. В качестве критериев сравнения использовались:
ИМТ в контрольной группе и на момент обследования в основной группе;
процент потери массы тела от исходной массы тела до нарушений пищевого поведения с его последующим ранжированием (менее 15 % потери массы тела, от до 25 % и более 25 % потери массы тела);
тяжесть нарушений пищевого поведения с учетом рекомендуемых интервалов ИМТ
(Британский Королевский Колледж);
выраженность отклоняющегося пищевого поведения (на основании оценки по Опроснику
пищевых предпочтений (ОПП-26) с учетом его факторов: "Нарушение пищевого поведения", "Самоконтроль пищевого поведения", "Озабоченность образом тела", "Социальное
давление в отношении пищевого поведения");
продолжительность нарушений пищевого поведения.
Оказалось, что величина цитотоксического индекса сыворотки крови значимо различает здоровых лиц и больных НПП (табл. 1, фиг. 1). Факт наличия НПП предопределяет
дисперсию показателя ЦТИ на 32,4 % (коэффициент η2).
Таблица 1
Величина цитотоксического индекса и достоверность его различий в подгруппах
больных нервной анорексией (1), нервной булимией (2) и здоровых (3), М (σ
σ)
Сравниваемые подгруппы
Нервная анорексия, n = 65 (1)
Нервная булимия, n = 30 (2)
Здоровые, n = 39 (3)
Р (1:2)
Р (1:3)
Р (2:3)
ЦТИ
28,95 (15,82)
24,84 (15,40)
6,95 (4,95)
>0,05
<0,0001
<0,0001
При этом группы больных нервной анорексией и нервной булимией, достоверно отличаясь от здоровых по величине ЦТИ, были подобны по этому показателю друг другу.
Наглядно эти различия представлены на фиг. 1, где показаны различия в проявлениях
цитотоксической активности сыворотки крови больной НА (Огр.Т) (справа) в сравнении с
контролем (слева) в культуре клеток линии Rinm5f после экспозиции в течение 24 часов.
В культуре клеток, экспонированных с сывороткой крови здорового человека (контроль, слева), видны клетки с высокой метаболической активностью. Значительное количество клеток преобразует МТТ в нерастворимое соединение синего цвета - формазан
(ЦТИ = 5,7 %). В образце, экспонированном с сывороткой крови больной НА (ограничительный тип), на фоне пониженной метаболической активности имеет место интенсивная
гибель клеток (МТТ не накапливается клетками).
Величина цитотоксического индекса сыворотки крови сопряжена с целым рядом специфических для НПП клинических и психопатологических проявлений. Принимая во
внимание то, что величина ЦТИ является маркером в большей степени общебиологических процессов и состояний, а также полярный характер значений величины ЦТИ между
группами здоровых лиц и больными НПП, мы исследовали матрицу корреляций значений
ИМТ, оценок ОПП-26 и величины ЦТИ в целом у всех обследованных нами лиц (табл. 2).
4
BY 13162 C1 2010.04.30
Таблица 2
Коэффициенты корреляции Спирмена между величиной цитотоксического индекса
сыворотки крови и характеристиками, связанными с девиациями
в пищевом поведении в целом по всей обследованной группе
Параметры, коррелируемые с величиной ЦТИ
ИМТ
ОПП-26 (общий балл)
"Нарушение пищевого поведения"
"Самоконтроль пищевого поведения"
"Озабоченность образом тела"
"Социальное давление в отношении пищевого поведения"
n
131
120
124
124
125
124
R Спирмена, р
-0,48, р<0,00001
0,48, р<0,00001
0,42, р<0,00001
0,34, р<0,0001
0,35, р<0,0001
0,42, р<0,00001
Как следует из табл. 2, величина ИМТ имеет обратные корреляции с уровнем ЦТИ.
Выраженная сопряженность уровня ИМТ и величины ЦТИ отмечается в клинически наиболее неблагоприятных наблюдениях - при НА с эпизодами переедания и очистительного
поведения - НА (П/ОП) (Спирмена R = -0,53, р = 0,002). При НБ клинически значимым
параметром, сопряженным с величиной эндотоксемии (ЦТИ), является продолжительность НПП. Так, для всех больных НБ в целом R Спирмена между длительностью расстройства и величиной ЦТИ составила 0,48, р = 0,01, а для НБ (Оч.Т): Спирмена R = 0,57,
p = 0,003. Следует отметить, что субъективно оцениваемая респондентами частота использования диет имела выраженную степень корреляции с величиной ЦТИ (Спирмена
R = 0,48, p<0,001), равно как и констатированная респондентами потребность постоянно
следить за диетой, чтобы контролировать свой вес (Спирмена R = -0,39, p<0,001).
У больных НА (П/ОП) уровень калия сыворотки крови отрицательно коррелировал с
ранжированными квартальными оценками ЦТИ (n = 27, Спирмена R = -0,38, р = :0,049),
что согласуется в клинике с активным очистительным поведением с помощью рвоты. У
больных НБ в целом ранжированные квартальные оценки ЦТИ негативно коррелировали
с уровнем тестостерона (n = 21, Спирмена R = -0,59, р = 0,005) и положительно сопряжены
с уровнем общего трииодтиронина (n = 22, Спирмена R = 0,46, p = 0,029), что отражает
согласованность изменчивости ЦТИ и биологических изменений при НБ (дисфункция половых стероидов и высокая метаболическая активность).
Градация индекса массы тела, используемая при статистическом анализе, включала
следующие интервалы: "1" - ИМТ < 13,5; "2" - 13,5 ≤ ИМТ < 15; "3" - 15 ≤ ИМТ < 17,5; "4" 17,5 ≤ ИМТ < 20; "5" - 20 ≤ ИМТ < 25; "6" - ИМТ ≥ 25. Величина ИМТ оказывает значимый эффект на ЦТИ (однофакторный дисперсионный анализ ANOVA: F = 6,25, p < 0,0001,
фиг. 2). Причем 20,0 % дисперсии ЦТИ определяется градацией тяжести ИМТ (коэффициент η2). Отклонения в пищевом поведении (ОПП-26) в анализируемой выборке определяют
14,4 % дисперсии величины цитотоксического индекса (однофакторный дисперсионный
анализ ANOVA: F = 19,88, p < 0,001). При проведении многофакторного дисперсионного
анализа (ANOVA2*4 (ОПП-26*ИМТ) показано, что величина индекса массы тела и выраженность отклонений в пищевом поведении (ОПП-26) изолированно сопряжены с ЦТИ
(F = 0,99, р > 0,05), фиг. 3.
При проведении дискриминантного анализа с зависимой переменной, определяющей
отношение субъекта к когорте больных НПП или здоровых, ИМТ в качестве единственного предиктора точно классифицировал 73,4 %, а ЦТИ - 78,5 %.
При составлении уравнения множественной регрессии в качестве переменныхпредикторов для величины ЦТИ были включены анализированные выше клиникобиологические маркеры. Наилучшая регрессионная модель представлена следующим образом (табл. 3).
5
BY 13162 C1 2010.04.30
Таблица 3
Коэффициенты множественной регрессии для зависимой переменной величины
цитотоксического индекса
Intercept
Частота диет
АсАТ
РO2
ИМТ
Мотивация к изменениям
(YBC-EDS)
Unstandardized
Coefficients
В
Std. Error
24,65
14,99
5,36
1,26
7,18
2,11
0,39
0,12
-2,00
0,62
-0,62
0,29
Standardized
Coefficients
Beta
t
P
0,46
0,38
0,36
-0,37
1,64
4,24
3,40
3,28
-3,22
0,11
0,0002
0,002
0,003
0,003
-0,22
-2,11
0,043
Наиболее значимыми предикторами цитотоксического индекса оказались: частота использования диет, уровень аспартатаминотрансферазы, парциальное давление кислорода
капиллярной крови, величина ИМТ и мотивация к изменениям. Значение R2 составляет
0,60, что показывает, что 60,0 % дисперсии переменной ЦТИ обусловлено влиянием указанных предикторов (R = 0,81; R2 = 0,65; Adjusted R2 = 0,598; F(5,31) = 11,717, p < 0,0001).
Проверка включенных в уравнение регрессии предикторов в отношении коллинеарности
(оценка толерантности) свидетельствует в пользу их взаимной независимости, что уменьшает вероятность стандартной ошибки. Отрицательная размерность стандартизованного
коэффициента регрессии β для ИМТ свидетельствует об отрицательной корреляции этого
параметра и предиктора, т.е. высокие уровни цитотоксичности сопряжены с меньшими
значениями ИМТ. Подобная размерность коэффициента β для шкалы мотивации к изменениям свидетельствует о том, что при наличии мотивации к изменениям в плане пищевого поведения (в случае их болезненного характера) больше вероятность наличия
повышенного уровня ЦТИ.
Настоящие исследования показали, что цитотоксические эффекты сыворотки крови
лиц, имеющих нарушения пищевого поведения, имеют свои особенности, что, как мы полагаем, связано с увеличением концентрации как свободных, так и связанных эндотоксинов.
При этом изначально мы предполагали, что за счет преобладания скрытых катаболических и дисметаболических процессов будет в основном реализовываться цитотоксичность
за счет токсических факторов неиммунного генеза (билирубина, позже - индольных соединений, азотистых шлаков и др.), что было подтверждено нагрузочными тестами в
культуре.
У больных НПП на фоне диспротеинемии происходит снижение уровней иммуноглобулинов и различных белков, входящих в систему комплемента, что не способствовало
проявлению иммунной компоненты цитотоксичности сыворотки крови и косвенным образом было подтверждено нагрузочными тестами, включающими насыщение реакционной
смеси факторами комплемента. В тестах с разведением реакционной смеси наблюдалось
достоверное снижение цитотоксической активности в диапазоне разведений 1-5, что также не является характерным для цитотоксических реакций с вовлечением антител.
Клиническая валидность феномена эндотоксемии у больных НПП подтверждается положительной корреляционной взаимосвязью между выраженностью сопутствующих НПП
психопатологических феноменов (SCL-90-R) и величиной ЦТИ, что отчетливо было выявлено у больных НБ в целом (соматизация: Спирмена R = 0,49, p = 0,010; депрессия:
Спирмена R = 0,40, p = 0,040; тревожность: Спирмена R = 0,41, p = 0,035; враждебность:
Спирмена R = 0,44, p = 0,020; психотизм: Спирмена R = 0,40, p = 0,038; GSI: Спирмена
R = 0,45, р = 0,020; индекс наличного симптоматического дистресса: Спирмена R = 0,39,
p = 0,041). Важно подчеркнуть, что выраженность эндотоксемии (ЦТИ) сопряжена прежде
6
BY 13162 C1 2010.04.30
всего с физическим компонентом КЖСЗ. В частности, у больных НА ограничительного
подтипа НА (самой гомогенной группы в отношении способов экстремального контроля
массы тела) при потере массы тела на 25 % и более от доболезненного уровня обнаружена
тесная взаимосвязь интегративного показателя качества жизни - физического компонента
здоровья и выраженности эндотоксемии (Спирмена R = -0,72, p = 0,013, n = 11). Причем
составной компонент физического компонента здоровья - качество жизни, обусловленное
интенсивностью болевых ощущений - на фоне указанной потери массы тела в целом по
выборке больных НПП показало взаимосвязь с показателем ЦТИ (Спирмена R = -0,55,
р = 0,008, n = 22).
Таким образом, величина цитотоксического индекса сыворотки крови сопряжена с целым рядом специфических клинических психопатологических проявлений.
В то же время ЦТИ имеет корреляционные отношения с рутинными антропометрическими показателями у больных в процессе динамики нарушений пищевого поведения.
Дисперсионный анализ (ANOVA) свидетельствует в пользу достоверных различий по
величине ЦТИ внутри группы пациентов, страдающих нарушениями пищевого поведения
с учетом степени отмеченной у них потери массы тела (F = 6,25, р = 0,0001). Таким образом, выраженность кахексии сопряжена с величиной ЦТИ.
Углубленный феноменологический анализ нарушений пищевого поведения показал,
что величина ЦТИ достоверно различается при сопоставлении с контрольной группой
здоровых лиц.
С учетом вышеизложенного ЦТИ может быть использован в качестве способа оценки
тяжести состояния пациентов, страдающих нарушениями пищевого поведения.
Таким образом, по сравнению с прототипом указанный способ обладает следующими
преимуществами:
лишен недостатков критерия ИМТ, связанных с необходимостью оценки антропометрических показателей (например, использование центильных таблиц), что особенно значимо в пубертатном периоде, когда риск развития нарушений пищевого поведения
максимален;
позволяет сопоставлять специфическую психопатологическую симптоматику нарушений пищевого поведения и соматические последствия этих расстройств, опосредованные
катаболическими процессами.
Источники информации:
1. Rossi F.M., Campbell D.L., Pottier R.H. In vitro studies on the potential use of
5 aminolaevulinic acid-mediated photodynamic therapy for gynaecological tumours // British
Journal of Cancer. - 1996 (74). - 881-887.
2. Nagata Т., Tobitani W., Kiriike N., Iketani Т., Yamagami S. Capacity to Produce Cytokines During Weight Restoration in Patients With Anorexia Nervosa//Psychosomatic Medicine. 61:371-377 (1999).
3. Eating disorders and obesity: a comprehensive handbook/Fairburn C.G., Brownell K.D.
(Eds.).- The Guilford Press, New York, London.- 2002. - 633 p.
4. Handbook of treatment for eating disorders/Garner D.M., Garfinkel P.E. (Eds.).- The
Guilford Press, New York, London.- 1997. - 528 p.
5. Fink S., Eckert E., Mitchell J., Crosby R., Pomeroy C. T-lymphocyte subsets in patients
with abnormal body weight: longitudinal studies in anorexia nervosa and obesity // Int J Eat
Disord. - 1996 Nov; 20(3). - 295-305.
7
BY 13162 C1 2010.04.30
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
1 042 Кб
Теги
by13162, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа