close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13281

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.06.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 13281
(13) C1
(19)
A 61K 31/13
A 61K 31/56
A 61P 31/00
СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА
В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
(21) Номер заявки: a 20081014
(22) 2008.07.30
(43) 2010.04.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии
и микробиологии" (BY)
(72) Авторы: Бореко Евгений Иванович
(BY); Савинова Ольга Владимировна (BY); Павлова Наталья Ильинична (BY); Казакова Оксана Борисовна (RU)
(73) Патентообладатель: Государственное учреждение "Республиканский
научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии" (BY)
(56) БОРЕКО Е.И. и др. Медицинские новости. - 1999. - № 3. - C. 20-25.
BY 7811 С1, 2006.
BY 7601 С1, 2005.
BY 7809 C1, 2006.
SU 677298, 1981.
БОРЕКО Е.И. и др. Теория и практика
медицины. Вып. 2. - Минск, 2000. C. 28-29.
ФЕДЯКИНА И.Т. и др. Вопросы вирусологии. - 2005. - Т.50. - № 4. - C. 3537.
ЕРОПКИН М.Ю. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология,
2007. - Т.70. - № 5. - C. 33-37.
BY 13281 C1 2010.06.30
(57)
Способ подавления репродукции вируса гриппа в культуре клеток, отличающийся
тем, что на монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в среде 199
ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3,28-диоксим бетулина в концентрации до
50 мкг/мл.
Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, и может быть
использовано для подавления размножения вирусов гриппа и редукции вызываемых ими
заболеваний.
Известен способ подавления репродукции вируса гриппа с использованием 3,28диоксима бетулина [1]. Недостатком способа является относительно невысокая противовирусная активность.
Более интенсивное снижение репродукции вируса гриппа может быть достигнуто с
использованием ремантадина [2-4]. Недостатком такого способа ингибирования вируса в
отдельных случаях также является сниженная активность [4].
Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих противовирусным действием.
Поставленная задача достигается в способе подавления репродукции вируса гриппа в
культуре клеток. На монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в
среде 199 ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3,28-диоксим бетулина в концентрации до 50 мкг/мл.
BY 13281 C1 2010.06.30
Авторами обнаружено неочевидное свойство, позволяющее применить 3,28-диоксим
бетулина и ремантадин для увеличения противовирусного действия.
Сущность изобретения иллюстрируется примерами.
Пример 1.
Токсическое действие 3,28-диоксима бетулина для культуры клеток.
Токсические свойства определяют по способности вызывать цитодеструктивные изменения клеток спустя 72 ч инкубации. Монослойные культуры клеток первичнотрипсинизированных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) отмывают от ростовой среды и
наносят разведения 3,28-диоксима бетулина на среде поддержки (среда 199) с концентрацией 800 мкг/мл и менее. 3,28-Диоксим бетулина предварительно растворяют в 10 % этаноле (маточный раствор). По истечении указанного срока неокрашенные культуры
просматривают при малом увеличении микроскопа (объектив ×10). Максимальной переносимой концентрацией (МПК) принимают наивысшую концентрацию вещества, не вызывающую указанных изменений. Устанавливают, что в диапазоне концентраций от
200 мкг/мл и более низких 3,28-диоксим бетулина не обладает способностью вызывать
цитодеструкцию клеток.
Пример 2.
Токсическое действие ремантадина для культуры клеток.
Исследование, описанное в примере 1, выполняют с ремантадином. Устанавливают,
что в диапазоне концентраций от 12,5 мкг/мл и более низких ремантадин не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток.
Пример 3.
Противовирусное действие 3,28-диоксима бетулина. Исследование проводят методом
редукции количества бляшек под агаровым покрытием. Монослойную культуру ФЭК, выращенную во флаконах, отмывают от ростовой среды, инфицируют различными разведениями вируса гриппа A/Rostock/34 (H7N1) в пределах 0,01-0,00001 БОЕ/клетка путем
нанесения вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37 °С. Затем жидкость
удаляют и клетки покрывают расплавом питательного покрытия на основе концентрата
среды 199 с добавлением 1 % бактагара и 0,005 % нейтрального красного (все реактивы
Sigma) и различных концентраций исследуемого соединения. 3,28-Диоксим бетулина
предварительно растворяют в 10 % этаноле (маточный раствор). После застывания покрытия флаконы помещают в термостат на 36 ч и затем подсчитывают количество бляшек,
видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя. На основе количества
бляшек вычисляют титр вируса. Критерием противовирусного действия считают наличие
различий в сравнении с контролем вируса. Вычисляют также концентрацию 50 % подавления размножения вируса (среднеэффективная концентрация, ЕС50) и отношение МПК к
ЕС50.
Полученные результаты приведены в таблице. ЕС50 3,28-диоксима бетулина составляет 8,2 (10,1÷6,7) мкг/мл, отношение МПК/ЕС50 - 24.
Пример 4.
Противовирусное действие ремантадина. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с ремантадином. Полученные результаты приведены в таблице. ЕС50 ремантадина составляет 0,003 (0,01÷0,0009) мкг/мл, отношение МПК/ЕС50 - 4 167.
Пример 5.
Противовирусное действие 3,28-диоксима бетулина и ремантадина при совместном
использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями 3,28-диоксима бетулина и 0,1 мкг/мл ремантадина. Полученные результаты
приведены в таблице. ЕС50 3,28-диоксима бетулина в присутствии ремантадина составляет
0,5 (1,0÷0,3) мкг/мл, отношение МПК/ЕС50 - 400.
2
BY 13281 C1 2010.06.30
Пример 6.
Противовирусное действие ремантадина и 3,28-диоксима бетулина при совместном
использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями ремантадина и 6,0 мкг/мл 3,28-диоксима бетулина. Полученные результаты
приведены в таблице. ЕС50 ремантадина в присутствии 3,28-диоксима бетулина составляет
0,00025 (0,02÷0,000004) мкг/мл, отношение МПК/ЕС50 - 50 000.
Подавление репродукции вируса гриппа в культуре клеток ФЭК в присутствии
3,28-диоксима бетулина (I), ремантадина (Re) и их сочетаний
Разность с конШифр Концентрация, Титр виpyca±Sx,
ЕС50 (I95),
тролем, lg
МПК/ЕС50
вещества
мкг/мл
мкг/мл
lg БОЕ/мл
БОЕ/мл
>2,35
50
<4,0
1,01
25
5,34 ± 0,07
0,93
12,5
8,2
5,42 ± 0,03
24
I
0,2
(10,1÷6,7)
6,25
6,15 ± 0,06
-0,05
3,0
6,4 ± 0,051
0
6,35 ± 0,04
12,5
0,25
6,45 ± 0,03
6,25
0,71
5,99 ± 0,12
3,12
0,8
5,9 ± 0,12
1,5
1,22
5,48 ± 0,1
0,78
1,28
0,003
5,42 ± 0,02
4 167
Re
0,39
1,28
(0,01÷0,0009)
5,42 ± 0,16
0,19
1,26
5,44 ± 0,03
0,1
1,47
5,23 ± 0,07
0,01
0,54
6,16 ± 0,09
0
6,7 ± 0,02
50
<4,0
>2,35
25
1,16
5,19 ± 0,13
12,5
1,07
5,28 ± 0,02
6,25
1,01
5,34 ± 0,04
0,5
3,0
1,03
I + Re 0,1
400
5,32 ± 0,02
(1,0÷0,3)
1,5
0,9
5,45 ± 0,11
0,78
0,82
5,53 ± 0,02
0,39
0,05
6,3 ± 0,08
0
6,35 ± 0,04
12,5
<4,0
>2,7
6,25
<4,0
>2,7
3,12
<4,0
>2,7
1,5
<4,0
>2,7
0,00025
0,78
1,08
5,62 ± 0,08
Re + I 6,0
50 000
(0,02÷0,000
0,39
1,08
5,62 ± 0,08
004)
0,19
0,95
5,75 ± 0,03
0,1
1,04
5,66 ± 0,05
0,01
0,57
6,13 ± 0,05
0
6,7 ± 0,02
3
BY 13281 C1 2010.06.30
Таким образом, заявляемое решение позволяет решить поставленную задачу. При совместном использовании 3,28-диоксима бетулина и ремантадина удается получить увеличение ингибирования репродукции вируса гриппа в культуре клеток в сравнении с
индивидуальным применением веществ. При оценке по среднеэффективной концентрации
или по отношению МПК/ЕС50 активность 3,28-диоксима бетулина увеличивается в 16,7
раза, ремантадина - в 12 раз. Значение фракционального индекса ингибирования (ФИИ),
рассчитанное по формуле: ФИИ = ЕС50 в-ва "А" в комбинации/ЕС50 в-ва "А" в отдельности + ЕС50 в-ва "Б" в комбинации/EC50 в-ва "Б" в отдельности [5], составляет 0,14. Оно
свидетельствует о синергизме комбинированного использования препаратов.
Заявляемое решение может быть непосредственно в настоящий момент использовано
в исследовательской лабораторной практике для подавления репродукции вируса гриппа и
редукции вызываемых им заболеваний.
Источники информации:
1. Патент РБ 7811, МПК С 07J 53/00, 63/00, А 61Р 31/16, 2003.
2. Патент США 3,352,912, МПК C 07D 295/00; C 07D 295/03; C 07C 49/00; C 07C 49/323.
3. Патент США 3,592,934, МПК C 07D 295/03; C 07D 295/00.
4. Бореко Е.И., Павлова Н.И. Амантадин и ремантадин в профилактике и лечении
гриппа // Медицинские новости, 1999. - № 3(47). - С. 20-25.
5. Janz С, Wigand R. Combined interaction of antiherpes substances and interferon beta on
the multiplication of herpes simplex virus // Arch. Virol. - 1982. - Vol. 73. - P. 135-143.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
89 Кб
Теги
by13281, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа